Genetic damage in soybean workers exposed to pesticides: Evaluation with the comet and buccal micronucleus cytome assays
• Danieli Benedettia,
• Emilene Nunesa,
• Merielen Sarmentoa,
• Carem Portoa,
• Carla Eliete Iochims dos Santosb,
• Johnny Ferraz Diasb,
• Juliana da Silvaa, , ,
Show more
doi:10.1016/j.mrgentox.2013.01.001
Get rights and content
Under an Elsevier user license
Open Access
________________________________________
Abstract
Soybean cultivation is widespread in the State of Rio Grande do Sul (RS, Brazil), especially in the city of Espumoso. Soybean workers in this region are increasingly exposed to a wide combination of chemical agents present in formulations of fungicides, herbicides, and insecticides. In the present study, the comet assay in peripheral leukocytes and the buccal micronucleus (MN) cytome assay (BMCyt) in exfoliated buccal cells were used to assess the effects of exposures to pesticides in soybean farm workers from Espumoso. A total of 127 individuals, 81 exposed and 46 non-exposed controls, were evaluated. Comet assay and BMCyt (micronuclei and nuclear buds) data revealed DNA damage in soybean workers. Cell death was also observed (condensed chromatin, karyorhectic, and karyolitic cells). Inhibition of non-specific choline esterase (BchE) was not observed in the workers. The trace element contents of buccal samples were analyzed by Particle-Induced X-ray Emission (PIXE). Higher concentrations of Mg, Al, Si, P, S, and Cl were observed in cells from workers. No associations with use of personal protective equipment, gender, or mode of application of pesticides were observed. Our findings indicate the advisability of monitoring genetic toxicity in soybean farm workers exposed to pesticides.
________________________________________
Highlights
► Genotoxic and mutagenic effect of pesticides were observed in soybean farm workers. ► Cell death in blood cells was elevated in soybean workers exposed to pesticides. ► Inorganic elements were higher in cells from soybean farm workers than non-exposed group.
Keywords
• Soybean farm workers;
• Pesticides;
• Human monitoring;
• Comet assay;
• Buccal micronucleus cytome assay
________________________________________
1. Introduction
Across the world, pesticides have been widely used since the 1940's [1]. In Brazil, the use of chemical substances in agriculture has increased significantly, and the country is considered to be one of the largest consumers worldwide, with sales increasing by 160% between 1991 and 1998. According to the Brazilian Agricultural and Livestock Confederation, in 2003, sales of pesticides amounted to 375,000 tons of commercial product, equivalent to 182,400 tons of active ingredients [2].
Brazil is the world's second largest producer and exporter of soybean. The area dedicated to soybean culture has increased from 11.5 million ha in 1990 to 21.7 million ha in 2009. Five states are responsible for 80% of Brazil's soybean production; one of these is the state of Rio Grande do Sul, in the south region [3]. The significant increase in soybean production entails the use of several pesticides for crop protection and pest control. Farm workers are exposed simultaneously to a complex mixture of insecticides, such as organophosphates, pyrethroids, and organochlorines [4], as well as fungicides and herbicides employed in the preparation and application of these chemicals [2].
The risks to human health that may be associated with chronic exposure to pesticides should be addressed in more detail. The effects of long-term exposure to low doses of pesticides are often difficult to assess, since associated signs and symptoms may not manifest clinically [5]. Pesticides and fertilizers are extensively used in agriculture; formulations, combinations, and interactions between chemical compounds and multiple exposures are a rule, not an exception, in agricultural practice. Different formulations are often used simultaneously in complex mixtures, including a significant number of genotoxic compounds [6]. Thus, information about toxicity of pesticides may not be sufficient to evaluate risk of adverse health effects. Some of these compounds are considered possible initiators of cancer, and can lead to a higher incidence of chronic diseases, degenerative diseases, and congenital malformations, as a consequence of their genotoxic effects [6], [7], [8], [9], [10] and [11]. These toxic effects vary considerably, depending on the degree of poisoning, absorption pathway, specific characteristics of pesticides or cultivation practices, and individual factors, such as age, gender, nutritional status, and general health [4], [12], [13] and [14].
In the present study, we have used the comet assay in peripheral leukocytes and the human buccal micronucleus (MN) cytome assay (BMCyt) in exfoliated buccal cells to assess whether prolonged exposure to complex mixtures of pesticides could lead to an increase in cytogenetic damage in soybean farm workers.
2. Materials and methods
2.1. Study population and sample collection
This study was approved by the Brazilian National Committee on Research Ethics – Comissão Nacional de Ética em Pesquisa – CONEP and written informed consent was obtained from each individual before the research began.
Subjects from Espumoso were sampled from January to February 2008 and from January to February 2009, periods with intensive use of pesticides. In total, 127 individuals (46 non-exposed controls and 81 occupationally exposed to pesticides) took part in this study. For an appropriate assessment of the exposed group, individuals were screened by the Institute of Technical Assistance and Rural Extension of Rio Grande do Sul (EMATER), which listed the farming communities where pesticides are intensely used. Two different groups of exposed individuals were formed, according to the mode of spraying pesticides: (a) those that made use of tanks installed in tractors and (b) those that made use of tanks installed in tractors associated with use of hand pumps. Hands pumps are considered as useful tools in successive applications of pesticides in small areas and where tractor access is difficult. Apart from spraying plantations, soybean farm workers also prepare the pesticide mixtures and refill the tanks.
The control individuals were office employees living in the same region as the exposed individuals. None of the control individuals was recently exposed to agrochemicals or any other suspected genotoxic agents, and they had no previous occupational exposure to genotoxins.
All individuals in the study were asked to answer a Portuguese version of a questionnaire from the International Commission for Protection against Environmental Mutagens and Carcinogens [15] and to participate in a face-to-face interview, which included standard demographic data (age, gender, etc.), as well as questions concerning medical issues (exposure to X-rays, vaccinations, medication, etc.), lifestyle (smoking, coffee and alcohol consumption, diet, etc.) and occupation (number of working hours per day, personal protective equipment – PPE). All individuals in this study were intentionally selected to be non-smokers, so as to eliminate confounding factors.
Blood samples were collected by venipuncture using vacutainers with heparine and EDTA and processed as quickly as possible. Buccal samples were obtained by rubbing the inside of the cheeks with a cytobrush for analysis of BMCyt and PIXE elemental analysis. Blood and buccal samples were transported to the laboratories at or below 8 °C and processed within 20 h of collection. The samples were stored at 4 °C.
2.2. Comet assay
The alkaline comet assay was performed as described by Singh [16] with the modifications suggested by Tice et al. [17]. Blood samples (5 μL) were embedded in 0.75% low melting point agarose, in 95 μL, and after the agarose solidified, slides were placed in lysis buffer (2.5 M NaCl, 100 mM EDTA and 10 mM Tris; pH 10.0–10.5) containing freshly added 1% (v/v) Triton X-100 and 10% (v/v) dimethyl sulphoxide for a minimum of 1 h and a maximum of one week. After treatment with lysis buffer, the slides were incubated in freshly prepared alkaline buffer solution (300 mM NaOH and 1 mM EDTA; pH > 13) for 20 min, and the DNA electrophoresed for 20 min at 25 V (0.90 V/cm) and 300 mA. The buffer solution was subsequently neutralized with 0.4 M Tris (pH 7.5), and the DNA was stained with silver nitrate. The electrophoresis procedure and the efficiency of each electrophoresis run were assessed using negative and positive internal controls consisting of whole human blood collected in the laboratory, with the negative control being unmodified blood and the positive control 50 μL blood mixed with 13 μL (8 × 10–5 M) methyl methane sulphonate solution (CAS 66-27-3; Sigma, St Louis, MO, USA) and incubated for 2 h at 37 °C. Each electrophoresis run was considered valid only if the negative and positive controls yielded the expected results. Slides were randomized and coded to blind the scorer. Images of 100 randomly selected cells (50 cells from each of two replicate slides) were analyzed for each individual using bright-field optical microscopy at a magnification of 200–1000. Two parameters were evaluated: (i) the damage index (DI), in which each cell was assigned to one of five classes (from no damage = 0 to maximum damage = 4) according to tail size and shape such that the values obtained for each individual could range from 0 (0 × 100) to 400 (4 × 100) and (ii) the damage frequency (DF in %), it was calculated for each sample based on the number of cells with tail versus those without. International guidelines and recommendations for the comet assay consider the visual scoring of comets to be a well-validated evaluation method [17] and [18].
2.3. Buccal micronucleus cytome assay (BMCyt assay)
Buccal cell samples were obtained by gently rubbing the inside of the cheeks (right a
ความเสียหายทางพันธุกรรมในถั่วเหลืองผู้ปฏิบัติงานที่สัมผัสกับสารกำจัดศัตรูพืช: ประเมินกับดาวหางและ buccal micronucleus assays cytome• Danieli Benedettia • Emilene Nunesa • Merielen Sarmentoa • Carem Portoa •คาร์ลา Eliete Iochims dos Santosb •จอห์นนี่ Ferraz Diasb •จูเลียนาดา Silvaa,, ดูเพิ่มเติมdoi:10.1016/j.mrgentox.2013.01.001ได้รับสิทธิและเนื้อหาภายใต้สิทธิ์การใช้งานผู้ใช้ Elsevier เปิดเข้า________________________________________บทคัดย่อเพาะปลูกถั่วเหลืองเป็นที่แพร่หลายในรัฐริโอแกรนด์โดเน (RS บราซิล), โดยเฉพาะอย่างยิ่งในเมือง Espumoso ถั่วเหลืองผู้ปฏิบัติงานในภูมิภาคนี้มีมากขึ้นมีสัมผัสกับอยู่ในสูตร ของซึ่งเกิดจากเชื้อ สารเคมีกำจัดวัชพืช ยาฆ่าแมลงแทนสารเคมีรวมทั้ง ในการศึกษาปัจจุบัน วิเคราะห์ดาวหางใน leukocytes อุปกรณ์ต่อพ่วงและวิเคราะห์ cytome buccal micronucleus (MN) (BMCyt) ในเซลล์ exfoliated buccal ถูกใช้ในการประเมินผลควรให้ยาฆ่าแมลงในถั่วเหลืองฟาร์มคนงานจาก Espumoso มีประเมินจำนวน 127 คน 81 สัมผัสและควบคุมในการแสดงไม่ใช่ 46 วิเคราะห์ดาวหางและข้อมูล BMCyt (micronuclei และอาหารนิวเคลียร์) เปิดเผยความเสียหายของดีเอ็นเอในถั่วเหลืองคน เซลล์ตายยังถูกตรวจสอบ (บีบโครมาติน karyorhectic และ karyolitic เซลล์) ยับยั้งการเจาะจง choline esterase (BchE) ไม่ได้ถูกตรวจสอบในการปฏิบัติงาน เนื้อหาจุลธาตุอย่าง buccal ถูกวิเคราะห์โดยปล่อยก๊าซ Particle-Induced เอ็กซ์เรย์ (PIXE) ความเข้มข้นสูงของ Mg, Al, Si, P, S และ Cl ถูกสังเกตในเซลล์จากผู้ปฏิบัติงาน ไม่เชื่อมโยงกับการใช้อุปกรณ์ป้องกันส่วนบุคคล เพศ หรือโหมดการใช้งานของสารกำจัดศัตรูพืชได้ดำเนินการ ผลการวิจัยของเราบ่งชี้ advisability ตรวจสอบความเป็นพิษพันธุกรรมในถั่วเหลืองฟาร์มผู้ปฏิบัติงานสัมผัสกับสารกำจัดศัตรูพืช________________________________________ไฮไลท์► Genotoxic และ mutagenic ผลของยาฆ่าแมลงถูกพบในคนงานฟาร์มถั่วเหลือง ►ตายเซลล์ในเม็ดเลือดเป็นการยกระดับในถั่วเหลืองผู้ปฏิบัติงานที่สัมผัสกับยาฆ่าแมลง ►องค์ประกอบอนินทรีย์ได้สูงในเซลล์จากคนงานฟาร์มถั่วเหลืองมากกว่ากลุ่มที่ไม่เปิดเผยคำสำคัญ•ถั่วเหลืองฟาร์มคน สารกำจัดศัตรูพืช• •ตรวจสอบมนุษย์ •วิเคราะห์ดาวหาง • Buccal micronucleus cytome ทดสอบ________________________________________1. บทนำทั่วโลก ยาฆ่าแมลงได้อย่างกว้างขวางใช้ตั้งแต่ 1940's [1] ในบราซิล การใช้สารเคมีในการเกษตรได้เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ และประเทศถือว่าเป็นหนึ่งของผู้บริโภคที่ใหญ่ที่สุดทั่วโลก ด้วยการขายเพิ่มขึ้น 160% ระหว่างปีพ.ศ. 2534 ถึงปี 1998 ตามบราซิลเกษตรและปศุสัตว์สมาพันธ์ ใน 2003 ขายสารกำจัดศัตรูพืชมี 375,000 ตันผลิตภัณฑ์เชิงพาณิชย์ เทียบเท่ากับ 182,400 ตันของสารออกฤทธิ์ [2]บราซิลเป็นผู้ผลิตใหญ่เป็นอันดับสองของโลกและส่งออกถั่วเหลือง พื้นที่เฉพาะวัฒนธรรมถั่วเหลืองได้เพิ่มขึ้นจาก 11.5 ล้านฮา ในปี 1990 เพื่อ 21.7 ล้านฮา ใน 2009 อเมริกา 5 รับผิดชอบ 80% ของการผลิตถั่วเหลืองของบราซิล หนึ่งคือรัฐริโอแกรนด์โดเน ในภาคใต้ [3] เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในการผลิตถั่วเหลืองมีการใช้สารกำจัดศัตรูพืชต่าง ๆ สำหรับการควบคุมศัตรูพืชและป้องกันพืช คนงานฟาร์มกำลังเผชิญพร้อมกับส่วนผสมของยาฆ่าแมลง เช่น organophosphates, pyrethroids, organochlorines [4], ซับซ้อนซึ่งเกิดจากเชื้อและสารเคมีกำจัดวัชพืชในการว่าจ้างในการเตรียมและใช้สารเคมีเหล่านี้ [2]ความเสี่ยงต่อสุขภาพมนุษย์ที่อาจเกี่ยวข้องกับสารกำจัดศัตรูพืชสัมผัสเรื้อรังควรได้รับในรายละเอียดเพิ่มเติม ผลของการสัมผัสระยะยาวกับปริมาณต่ำสุดของสารกำจัดศัตรูพืชมักยากต่อการประเมิน เนื่องจากสัญญาณที่เกี่ยวข้องและอาการอาจไม่ชัดทางคลินิก [5] ยาฆ่าแมลงและปุ๋ยอย่างกว้างขวางใช้ในเกษตร สูตร ผสม และการโต้ตอบระหว่างสารเคมีและซ้อนเป็นกฎ ไม่มีข้อยกเว้น ในทางปฏิบัติทางการเกษตร สูตรต่าง ๆ มักใช้กันในน้ำยาผสมซับซ้อน รวมถึงจำนวนมากของสาร genotoxic [6] ดังนั้น ข้อมูลเกี่ยวกับความเป็นพิษของสารกำจัดศัตรูพืชได้เพียงพอต่อการประเมินความเสี่ยงของผลกระทบสุขภาพร้าย บางส่วนของสารเหล่านี้ถือว่า initiators เป็นไปได้ของมะเร็ง และสามารถนำไปสู่การเกิดขึ้นของโรคเรื้อรัง โรคเสื่อม และ malformations ธา เป็นลำดับของ genotoxic ผล [6], [7], [8], [9], [10] [11] และ ลักษณะพิเศษเหล่านี้เป็นพิษที่แตกต่างกันมาก ขึ้นอยู่กับระดับของการเป็นพิษ การดูดซึมทาง เดิน ลักษณะเฉพาะของสารกำจัดศัตรูพืช หรือเพาะปลูกปฏิบัติ และแต่ละ ปัจจัย เช่นอายุ เพศ โภชนาการ และสุขภาพโดยทั่วไป [4], [12], [13] [14] และในการศึกษาปัจจุบัน เราใช้วิเคราะห์ดาวหางใน leukocytes อุปกรณ์ต่อพ่วงและทดสอบ cytome ของมนุษย์ buccal micronucleus (MN) (BMCyt) ในเซลล์ exfoliated buccal เพื่อประเมินว่าสัมผัสน้ำยาผสมที่ซับซ้อนของสารกำจัดศัตรูพืชเป็นเวลานานอาจนำไปสู่การเพิ่มเสีย cytogenetic ในคนงานฟาร์มถั่วเหลือง2. วัสดุและวิธีการ2.1 การศึกษาประชากรและตัวอย่างชุดการศึกษานี้ได้รับการอนุมัติ โดยคณะกรรมการแห่งชาติบราซิลในงานวิจัยจรรยาบรรณ –เอม Comissão Nacional de Ética Pesquisa – CONEP และแจ้งความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษรได้รับจากแต่ละคนก่อนเริ่มงานวิจัยเรื่องจาก Espumoso ได้ความ จากเดือนมกราคมถึงเดือน 2551 กุมภาพันธ์ และเดือนมกราคมถึง 2552 กุมภาพันธ์ เวลา มีการใช้สารกำจัดศัตรูพืชเข้มข้น รวม 127 บุคคล (ตัวควบคุมไม่แสดง 46 และ 81 occupationally สัมผัสกับยาฆ่าแมลง) ใช้เวลาส่วนหนึ่งในการศึกษานี้ สำหรับการประเมินความเหมาะสมของกลุ่มสัมผัส บุคคลที่ฉายโดยที่สถาบันของช่วยเหลือทางเทคนิค และส่วนขยายของชนบทของ Rio Grande ทำเน (EMATER), ซึ่งแสดงชุมชนนาที่ยาฆ่าแมลงที่เจี๊ยบใช้ สองกลุ่มแตกต่างกันของบุคคลที่สัมผัสเกิดขึ้น ตามวิธีการพ่นสารกำจัดศัตรูพืช: (ก) ผู้ที่ใช้รถถังที่ติดตั้งในรถแทรกเตอร์และ (b) ที่ทำให้ ใช้ถังที่ติดตั้งในรถแทรกเตอร์เกี่ยวข้องกับการใช้ปั๊มมือ ปั๊มมือถือเป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์ในการใช้งานต่อเนื่องของสารกำจัดศัตรูพืชในพื้นที่ขนาดเล็กและยากเข้าถึงรถแทรกเตอร์ นอกจากพ่นไร่ ถั่วเหลืองฟาร์มคนงานยังเตรียมน้ำยาผสมยาฆ่าแมลง และเติมถังบุคคลควบคุมพนักงานสำนักงานที่อาศัยอยู่ในภูมิภาคเดียวกันเป็นบุคคลที่สัมผัสได้ ไม่มีการควบคุมบุคคลเพิ่งสัมผัสสูบหรือใด ๆ อื่น ๆ สงสัยตัวแทน genotoxic และพวกเขาก่อนหน้านี้ไม่มีอุบัติเหตุถึง genotoxinsบุคคลทั้งหมดในการศึกษาก็ขอตอบแบบโปรตุเกสของแบบสอบถามจากคณะกรรมการนานาชาติสำหรับป้องกัน Mutagens สิ่งแวดล้อมและสารก่อมะเร็ง [15] และ เข้าร่วมในการสัมภาษณ์แบบพบปะ ซึ่งรวมมาตรฐานประชากร (อายุ เพศ ฯลฯ), และคำถามเกี่ยวกับปัญหาการแพทย์ (สัมผัสกับรังสีเอกซ์ วัคซีน ยา ฯลฯ), (สูบบุหรี่ กาแฟ และแอลกอฮอล์การใช้ชีวิตอาหาร ฯลฯ .) และอาชีพ (จำนวนชั่วโมงทำงานต่อวัน ส่วนบุคคลอุปกรณ์ป้องกัน – บริษัทพีพีอี) บุคคลทั้งหมดในการศึกษานี้ได้ตั้งใจเลือกที่จะสูบ บุหรี่ เพื่อกำจัดปัจจัย confoundingตัวอย่างเลือดเก็บรวบรวม โดยการเจาะหลอดเลือดดำที่ใช้ vacutainers กับ heparine และ EDTA และประมวลผลเร็วที่สุด ตัวอย่าง buccal ได้รับ โดยถูด้านในของแก้มกับ cytobrush สำหรับการวิเคราะห์ของ BMCyt และ PIXE วิเคราะห์ธาตุ เลือดและตัวอย่าง buccal ถูกขนส่งไปห้องปฏิบัติการที่ หรือต่ำ กว่า 8 ° C และประมวลผลภายใน 20 h ของคอลเลกชัน ตัวอย่างถูกเก็บไว้ที่ 4 องศาเซลเซียส2.2. ดาวหางทดสอบThe alkaline comet assay was performed as described by Singh [16] with the modifications suggested by Tice et al. [17]. Blood samples (5 μL) were embedded in 0.75% low melting point agarose, in 95 μL, and after the agarose solidified, slides were placed in lysis buffer (2.5 M NaCl, 100 mM EDTA and 10 mM Tris; pH 10.0–10.5) containing freshly added 1% (v/v) Triton X-100 and 10% (v/v) dimethyl sulphoxide for a minimum of 1 h and a maximum of one week. After treatment with lysis buffer, the slides were incubated in freshly prepared alkaline buffer solution (300 mM NaOH and 1 mM EDTA; pH > 13) for 20 min, and the DNA electrophoresed for 20 min at 25 V (0.90 V/cm) and 300 mA. The buffer solution was subsequently neutralized with 0.4 M Tris (pH 7.5), and the DNA was stained with silver nitrate. The electrophoresis procedure and the efficiency of each electrophoresis run were assessed using negative and positive internal controls consisting of whole human blood collected in the laboratory, with the negative control being unmodified blood and the positive control 50 μL blood mixed with 13 μL (8 × 10–5 M) methyl methane sulphonate solution (CAS 66-27-3; Sigma, St Louis, MO, USA) and incubated for 2 h at 37 °C. Each electrophoresis run was considered valid only if the negative and positive controls yielded the expected results. Slides were randomized and coded to blind the scorer. Images of 100 randomly selected cells (50 cells from each of two replicate slides) were analyzed for each individual using bright-field optical microscopy at a magnification of 200–1000. Two parameters were evaluated: (i) the damage index (DI), in which each cell was assigned to one of five classes (from no damage = 0 to maximum damage = 4) according to tail size and shape such that the values obtained for each individual could range from 0 (0 × 100) to 400 (4 × 100) and (ii) the damage frequency (DF in %), it was calculated for each sample based on the number of cells with tail versus those without. International guidelines and recommendations for the comet assay consider the visual scoring of comets to be a well-validated evaluation method [17] and [18].2.3. buccal micronucleus cytome วิเคราะห์ (วิเคราะห์ BMCyt)ตัวอย่างเซลล์ buccal ได้รับ โดยถูด้านในของแก้มแบบเบา ๆ (ขวา
การแปล กรุณารอสักครู่..
Genetic damage in soybean workers exposed to pesticides: Evaluation with the comet and buccal micronucleus cytome assays
• Danieli Benedettia,
• Emilene Nunesa,
• Merielen Sarmentoa,
• Carem Portoa,
• Carla Eliete Iochims dos Santosb,
• Johnny Ferraz Diasb,
• Juliana da Silvaa, , ,
Show more
doi:10.1016/j.mrgentox.2013.01.001
Get rights and content
Under an Elsevier user license
Open Access
________________________________________
Abstract
Soybean cultivation is widespread in the State of Rio Grande do Sul (RS, Brazil), especially in the city of Espumoso. Soybean workers in this region are increasingly exposed to a wide combination of chemical agents present in formulations of fungicides, herbicides, and insecticides. In the present study, the comet assay in peripheral leukocytes and the buccal micronucleus (MN) cytome assay (BMCyt) in exfoliated buccal cells were used to assess the effects of exposures to pesticides in soybean farm workers from Espumoso. A total of 127 individuals, 81 exposed and 46 non-exposed controls, were evaluated. Comet assay and BMCyt (micronuclei and nuclear buds) data revealed DNA damage in soybean workers. Cell death was also observed (condensed chromatin, karyorhectic, and karyolitic cells). Inhibition of non-specific choline esterase (BchE) was not observed in the workers. The trace element contents of buccal samples were analyzed by Particle-Induced X-ray Emission (PIXE). Higher concentrations of Mg, Al, Si, P, S, and Cl were observed in cells from workers. No associations with use of personal protective equipment, gender, or mode of application of pesticides were observed. Our findings indicate the advisability of monitoring genetic toxicity in soybean farm workers exposed to pesticides.
________________________________________
Highlights
► Genotoxic and mutagenic effect of pesticides were observed in soybean farm workers. ► Cell death in blood cells was elevated in soybean workers exposed to pesticides. ► Inorganic elements were higher in cells from soybean farm workers than non-exposed group.
Keywords
• Soybean farm workers;
• Pesticides;
• Human monitoring;
• Comet assay;
• Buccal micronucleus cytome assay
________________________________________
1. Introduction
Across the world, pesticides have been widely used since the 1940's [1]. In Brazil, the use of chemical substances in agriculture has increased significantly, and the country is considered to be one of the largest consumers worldwide, with sales increasing by 160% between 1991 and 1998. According to the Brazilian Agricultural and Livestock Confederation, in 2003, sales of pesticides amounted to 375,000 tons of commercial product, equivalent to 182,400 tons of active ingredients [2].
Brazil is the world's second largest producer and exporter of soybean. The area dedicated to soybean culture has increased from 11.5 million ha in 1990 to 21.7 million ha in 2009. Five states are responsible for 80% of Brazil's soybean production; one of these is the state of Rio Grande do Sul, in the south region [3]. The significant increase in soybean production entails the use of several pesticides for crop protection and pest control. Farm workers are exposed simultaneously to a complex mixture of insecticides, such as organophosphates, pyrethroids, and organochlorines [4], as well as fungicides and herbicides employed in the preparation and application of these chemicals [2].
The risks to human health that may be associated with chronic exposure to pesticides should be addressed in more detail. The effects of long-term exposure to low doses of pesticides are often difficult to assess, since associated signs and symptoms may not manifest clinically [5]. Pesticides and fertilizers are extensively used in agriculture; formulations, combinations, and interactions between chemical compounds and multiple exposures are a rule, not an exception, in agricultural practice. Different formulations are often used simultaneously in complex mixtures, including a significant number of genotoxic compounds [6]. Thus, information about toxicity of pesticides may not be sufficient to evaluate risk of adverse health effects. Some of these compounds are considered possible initiators of cancer, and can lead to a higher incidence of chronic diseases, degenerative diseases, and congenital malformations, as a consequence of their genotoxic effects [6], [7], [8], [9], [10] and [11]. These toxic effects vary considerably, depending on the degree of poisoning, absorption pathway, specific characteristics of pesticides or cultivation practices, and individual factors, such as age, gender, nutritional status, and general health [4], [12], [13] and [14].
In the present study, we have used the comet assay in peripheral leukocytes and the human buccal micronucleus (MN) cytome assay (BMCyt) in exfoliated buccal cells to assess whether prolonged exposure to complex mixtures of pesticides could lead to an increase in cytogenetic damage in soybean farm workers.
2. Materials and methods
2.1. Study population and sample collection
This study was approved by the Brazilian National Committee on Research Ethics – Comissão Nacional de Ética em Pesquisa – CONEP and written informed consent was obtained from each individual before the research began.
Subjects from Espumoso were sampled from January to February 2008 and from January to February 2009, periods with intensive use of pesticides. In total, 127 individuals (46 non-exposed controls and 81 occupationally exposed to pesticides) took part in this study. For an appropriate assessment of the exposed group, individuals were screened by the Institute of Technical Assistance and Rural Extension of Rio Grande do Sul (EMATER), which listed the farming communities where pesticides are intensely used. Two different groups of exposed individuals were formed, according to the mode of spraying pesticides: (a) those that made use of tanks installed in tractors and (b) those that made use of tanks installed in tractors associated with use of hand pumps. Hands pumps are considered as useful tools in successive applications of pesticides in small areas and where tractor access is difficult. Apart from spraying plantations, soybean farm workers also prepare the pesticide mixtures and refill the tanks.
The control individuals were office employees living in the same region as the exposed individuals. None of the control individuals was recently exposed to agrochemicals or any other suspected genotoxic agents, and they had no previous occupational exposure to genotoxins.
All individuals in the study were asked to answer a Portuguese version of a questionnaire from the International Commission for Protection against Environmental Mutagens and Carcinogens [15] and to participate in a face-to-face interview, which included standard demographic data (age, gender, etc.), as well as questions concerning medical issues (exposure to X-rays, vaccinations, medication, etc.), lifestyle (smoking, coffee and alcohol consumption, diet, etc.) and occupation (number of working hours per day, personal protective equipment – PPE). All individuals in this study were intentionally selected to be non-smokers, so as to eliminate confounding factors.
Blood samples were collected by venipuncture using vacutainers with heparine and EDTA and processed as quickly as possible. Buccal samples were obtained by rubbing the inside of the cheeks with a cytobrush for analysis of BMCyt and PIXE elemental analysis. Blood and buccal samples were transported to the laboratories at or below 8 °C and processed within 20 h of collection. The samples were stored at 4 °C.
2.2. Comet assay
The alkaline comet assay was performed as described by Singh [16] with the modifications suggested by Tice et al. [17]. Blood samples (5 μL) were embedded in 0.75% low melting point agarose, in 95 μL, and after the agarose solidified, slides were placed in lysis buffer (2.5 M NaCl, 100 mM EDTA and 10 mM Tris; pH 10.0–10.5) containing freshly added 1% (v/v) Triton X-100 and 10% (v/v) dimethyl sulphoxide for a minimum of 1 h and a maximum of one week. After treatment with lysis buffer, the slides were incubated in freshly prepared alkaline buffer solution (300 mM NaOH and 1 mM EDTA; pH > 13) for 20 min, and the DNA electrophoresed for 20 min at 25 V (0.90 V/cm) and 300 mA. The buffer solution was subsequently neutralized with 0.4 M Tris (pH 7.5), and the DNA was stained with silver nitrate. The electrophoresis procedure and the efficiency of each electrophoresis run were assessed using negative and positive internal controls consisting of whole human blood collected in the laboratory, with the negative control being unmodified blood and the positive control 50 μL blood mixed with 13 μL (8 × 10–5 M) methyl methane sulphonate solution (CAS 66-27-3; Sigma, St Louis, MO, USA) and incubated for 2 h at 37 °C. Each electrophoresis run was considered valid only if the negative and positive controls yielded the expected results. Slides were randomized and coded to blind the scorer. Images of 100 randomly selected cells (50 cells from each of two replicate slides) were analyzed for each individual using bright-field optical microscopy at a magnification of 200–1000. Two parameters were evaluated: (i) the damage index (DI), in which each cell was assigned to one of five classes (from no damage = 0 to maximum damage = 4) according to tail size and shape such that the values obtained for each individual could range from 0 (0 × 100) to 400 (4 × 100) and (ii) the damage frequency (DF in %), it was calculated for each sample based on the number of cells with tail versus those without. International guidelines and recommendations for the comet assay consider the visual scoring of comets to be a well-validated evaluation method [17] and [18].
2.3. Buccal micronucleus cytome assay (BMCyt assay)
Buccal cell samples were obtained by gently rubbing the inside of the cheeks (right a
การแปล กรุณารอสักครู่..