Immune-related genes expression by

Immune-related genes expression by qRT-PCR

A Taqman probe-based quantitative reverse tran-
scription PCR (qRT-PCR) technique was taken to

determine expression of the six selected genes at transcript level. Pairs of gene-specific primers and

Taqman probes of six genes were designed using

Primer Express(r) Software v3.0 (Applied Biosys-
tems, Scoresby, Vic., Australia) (Table 1).

At the end of the experiment, three animals

from each treatment were removed to liquid nitro-
gen and stored at 80°C until used for RNA

extraction. Total RNA was extracted with the

RNeasy Mini Kit and further purified with DNase I

(Qiagen, Valencia, CA, USA). One-step real time

RT-PCR was accomplished using the One Step

Prime ScriptTM RT-PCR perfect real time Kit (Takara

Bio, Otsu, Japan). The reaction mixture consisted

of 10 lL 2X One-Step RT-PCR Buffer III, 2 units of

Takara Ex Hot Start Taq enzyme, 0.4 lL reverse

transcript enzyme Mix II and 0.4 lM each of for-
ward primer, reverse primer, and Taqman probe

in a final reaction volume of 20 lL. All PCR con-
ditions were as follows: 42°C for 5 min and 95°C

for 10 s, followed by 40 cycles of 95°C for 5 s and

60°C for 30 s. Fluorescent signal detection began

at the first cycle of the annealing stage. All

samples were analysed in triplicate, and

relative expression was determined by the com-
parative threshold cycle method (2DDCT method

Livak & Schmittgen 2001) using b-actin as a

reference. Data analysis

The results were expressed as the mean stan-
dard deviation (SD). Each significant difference

between different groups was determined by inde-
pendent samples T-tests with 95% confidence level

in SPSS13.0 software.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

นิพจน์ในยีนที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกัน โดย qRT PCRแบบ Taqman ใช้โพรบเชิงปริมาณย้อนทราน-มีนำเทคนิค PCR (qRT-PCR) แผ่นกำหนดค่าของยีนเลือก 6 ระดับเสียงบรรยาย คู่ของยีนเฉพาะไพรเมอร์ และคลิปปากตะเข้ Taqman ของยีน 6 ถูกออกแบบโดยใช้รองพื้น Express(r) ซอฟต์แวร์ v3.0 (ใช้ Biosys-สิน Scoresby, Vic. ออสเตรเลีย) (ตารางที่ 1)เมื่อสิ้นสุดการทดลอง สัตว์สามจากการรักษาแต่ละออกจะเหลวไนโตร-gen และเก็บไว้ที่ 80° C จนกว่าจะใช้อาร์เอ็นเอสกัด อาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกสกัดด้วยการชุดมินิ RNeasy และเพิ่มเติม บริสุทธิ์กับ DNase ฉัน(Qiagen, Valencia, CA, USA) เวลาจริงขั้นตอนเดียวRT-PCR ถูกทำได้โดยใช้ขั้นตอนเดียวนายกรัฐมนตรีเวลาจริงโก ScriptTM RT-PCR Kit (Takaraไบโอ โอสึ ญี่ปุ่น) ประกอบด้วยส่วนผสมของปฏิกิริยา10 จะ 2 X ขั้นตอนเดียว RT-PCR บัฟเฟอร์ III, 2 หน่วยTakara อดีตร้อนเริ่ม Taq เอนไซม์ 0.4 จะกลับเสียงบรรยายเอนไซม์ผสม II และ 0.4 lM แต่ละของการ-ผู้ป่วยสีรองพื้น รองพื้นกลับ และโพรบ Taqmanปริมาณปฏิกิริยาสุดท้าย 20 จะ ทั้งหมด PCR คอน-ditions ได้ดังนี้: 42° C 5 นาทีและ 95° C10 s ตามวงจร 40 95 องศาเซลเซียสสำหรับ 5 s และเริ่มที่ 60° C สำหรับการตรวจสอบสัญญาณฟลูออเรส s ได้ 30ในรอบแรกของขั้นตอนการหลอม ทั้งหมดตัวอย่างที่ analysed ใน triplicate และกำหนดนิพจน์ญาติ โดย com-ขีดจำกัด parative วงจรวิธี (วิธีการ 2DDCTLivak และ Schmittgen 2001) ใช้แอกตินบีเป็นการการอ้างอิง การวิเคราะห์ข้อมูลผลลัพธ์ได้แสดงเป็นหมายถึงสแตน-dard เบี่ยงเบน (SD) แต่ละความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่มต่าง ๆ ถูกกำหนด โดย inde-แขวนตัวอย่างทดสอบ T มีระดับความเชื่อมั่น 95%SPSS13.0 ซอฟต์แวร์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ภูมิคุ้มกันยีนที่เกี่ยวข้องกับการแสดงออกโดย qRT-PCR TaqMan สอบสวนตามปริมาณ tran- กลับscription PCR (qRT-PCR) ถูกนำตัวไปตรวจสอบการแสดงออกของยีนที่หกที่เลือกในระดับหลักฐาน คู่ของยีนที่เฉพาะเจาะจงและไพรเมอร์โพรบ TaqMan หกยีนได้รับการออกแบบโดยใช้ไพรเมอร์เอ็กซ์เพรส(R) ซอฟท์แว v3.0 (ประยุกต์ Biosys- TEMS, สกอร์วิก., ออสเตรเลีย) (ตารางที่ 1). ในตอนท้ายของการทดลองที่สาม สัตว์จากการรักษาแต่ละถูกถอดออกมาเป็นของเหลวnitro- เก็นและเก็บไว้ที่ 80 องศาเซลเซียสจนอาร์เอ็นเอที่ใช้สำหรับการสกัด รวม RNA ถูกสกัดด้วยRNeasy มินิชุดและบริสุทธิ์อีกด้วย DNase ฉัน(Qiagen, วาเลนเซีย, CA, USA) หนึ่งในขั้นตอนเวลาจริงRT-PCR ก็ประสบความสำเร็จโดยใช้ขั้นตอนที่หนึ่งนายกรัฐมนตรีScriptTM RT-PCR เวลาจริงที่สมบูรณ์แบบชุด (Takara ไบโอ Otsu, ญี่ปุ่น) ผสมปฏิกิริยาประกอบด้วย10 LL 2X หนึ่งขั้นตอน RT-PCR บัฟเฟอร์ III, 2 หน่วยTakara อดีตฮอตเอนไซม์ Taq เริ่ม 0.4 จะกลับเอนไซม์ผสมหลักฐานที่สองและ0.4 LM แต่ละระบบหุ่นยนต์ไพรเมอวอร์ดไพรเมอร์ย้อนกลับและการสอบสวนTaqMan ในปริมาณปฏิกิริยาสุดท้ายของ 20 LL ทํา PCR ทุกสภาวะแวดล้อมมีดังนี้: 42 ° C เป็นเวลา 5 นาทีและ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา10 วินาทีตามด้วย 40 รอบของ 95 ° C เป็นเวลา 5 และ60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที การตรวจจับสัญญาณเรืองแสงเริ่มที่รอบแรกของขั้นตอนการอบอ่อน ทั้งหมดตัวอย่างวิเคราะห์ในเพิ่มขึ้นสามเท่าและการแสดงออกของญาติที่ถูกกำหนดโดยสั่งวิธีวงจรเกณฑ์parative (วิธี 2DDCT Livak และ Schmittgen 2001) โดยใช้ B-โปรตีนเป็นอ้างอิง การวิเคราะห์ข้อมูลผลการวิจัยแสดงเป็นค่าเฉลี่ยลี้เบี่ยงเบนดาด(SD) แต่ละคนแตกต่างที่สำคัญระหว่างกลุ่มที่แตกต่างกันถูกกำหนดโดย inde- ตัวอย่างจี้ T การทดสอบที่มีระดับความเชื่อมั่น 95% ในซอฟแวร์ SPSS13.0

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับระบบภูมิคุ้มกัน โดยข้าพเจ้า PCR

taqman ตรวจสอบย้อนกลับตามปริมาณทราน -
scription PCR ( ข้าพเจ้า PCR ) โดยถ่ายให้

ตรวจสอบการแสดงออกของยีนที่ระดับหกเลือกใบรับรองผลการศึกษา คู่ของยีนที่เฉพาะเจาะจงชนิด

taqman ฟิวส์ 6 ยีนถูกออกแบบมาโดยใช้ไพรเมอร์ด่วน

( R ) ซอฟต์แวร์ประยุกต์ ( biosys v3.0 -
tems สกอร์สบี้ วิค ออสเตรเลีย ) ( ตารางที่ 1 ) .

เมื่อสิ้นสุดการทดลอง สามสัตว์

จากแต่ละการรักษาถูกถอดออกเพื่อของเหลว nitro -
Gen ที่เก็บรักษาที่อุณหภูมิ 80 องศา C จนกระทั่งใช้ RNA

การสกัด ทั้งหมดนี้ถูกสกัดด้วย

rneasy Mini Kit และเพิ่มเติมบริสุทธิ์กับตรวจหา ADNase ผม

( เพิ่ม , Valencia , CA , USA ) ขั้นตอนหนึ่งที่เวลาจริง

นี้ได้ โดยใช้ขั้นตอนเดียว

นายก scripttm RT-PCR ที่สมบูรณ์แบบเวลาจริง Kit ( ทาคาระ

ประวัติ , โอ๊ต , ญี่ปุ่น )ปฏิกิริยาผสม )

10 จะ 2x หนึ่งขั้นตอนต่อบัฟเฟอร์ 3 , 2 หน่วย

ทาคาระ อดีตจาเริ่มแท็คเอนไซม์ , 0.4 จะกลับ

หลักฐานเอนไซม์ผสม II และ 0.4 โดยแต่ละ -
วอร์ดไพรเมอร์ , รองพื้นและตรวจสอบย้อนกลับ , taqman

ในปริมาตรปฏิกิริยาสุดท้าย 20 จะ . ทั้งหมดจากคอน -
ditions ดังนี้ 42 ° C เป็นเวลา 5 นาทีและ 95 องศา C

10 s ตามด้วย 40 รอบ 95 องศา C เป็นเวลา 5 วินาทีและ 60 ° C

30 sตรวจจับสัญญาณฟลูออเรสเซนต์เริ่ม

ในรอบแรกของการอบอ่อนที่เวที ทุกคน

วิเคราะห์ทั้งสามใบและ

ญาติการแสดงออกถูกกำหนดจาก com -
parative เกณฑ์วิธีวงจร ( 2ddct วิธี

livak & schmittgen 2001 ) โดยใช้ b-actin เป็น

อ้างอิง การวิเคราะห์ข้อมูล

ผลที่แสดงเป็นค่าเฉลี่ย Stan dard --
ค่าเฉลี่ย ( SD ) แต่ละคนแตกต่างกัน

ระหว่างกลุ่มถูกกำหนดจากประเทศอินเดีย -
จี้ตัวอย่างแบบ ด้วยระดับความเชื่อมั่นร้อยละ 95



spss13.0 ในซอฟต์แวร์