The use of direct nested PCR enable

The use of direct nested PCR enables the detection of Plasmodium spp. from blood samples collected on filter papers without requiring the time-consuming procedures associated with DNA extraction. Direct PCR provides a rapid, highly sensitive, and cost-effective alternative to diagnosing malaria using filter paper samples and standard nested PCR.

Malaria remains a major global health burden with an estimated death toll of almost 900,000 every year (11). Recent reports of newly emerging artemisinin resistance and the emergence of endemic populations of a number of “new,” potentially human-pathogenic Plasmodium species, such as Plasmodium knowlesi, as well as a variety of Plasmodium ovale parasites, in Asia indicate that there is an urgent need for new techniques to provide rapid and highly accurate diagnoses to adequately treat and control malaria (3, 5, 9).

The use of direct PCR allows for PCR amplifications without any prior DNA extraction and purification steps. The Phusion blood DNA polymerase used in the assay is reported to lead to a 25-fold-lower error rate than the common Thermus aquaticus polymerase (2).

The aim of this study was to adapt this novel technique for use in the rapid laboratory-based detection of Plasmodium spp. and to validate the sensitivity of this technique in comparison to that of conventional nested PCR and microscopy (6, 8).

Patient samples were collected between 2007 and 2009 at the MARIB (Malaria Research Initiative Bandarban) center in Bandarban, Chittagong Hill Tracts, Bangladesh, as part of a hospital- and field-based fever survey. Written informed consent was obtained from all study participants or their legal representatives, and the study protocol was approved by the appropriate ethical review committee.

From all participating patients aged 8 years and older, 100 μl venous blood was drawn. From patients younger than 8 years, 2 drops of blood obtained by finger prick was collected and transferred onto 903 filter paper (Schleicher & Schuell BioScience GmBH, Dassel, Germany) in duplicate. Filter papers were air dried at room temperature and stored under airtight conditions at 4°C until further processing. A total number of 140 filter paper samples was included in the evaluation.

Previous Section
Next Section
Direct nested PCR.

A blood spot 2 mm in diameter was punched out of each filter paper sample and washed with 30 μl double-distilled water at 50°C for 3 min. The water was removed, and the PCR mixture (Phusion blood direct PCR kit; Finnzymes Oy, Espoo, Finland) was added directly to the sample. A modified standard nested-PCR protocol was used for the evaluation of genus- and species-specific Plasmodium DNA within the highly conserved regions of the small-subunit (SSU) rRNA gene (6, 7, 8). The following primers were used: rPLU1/rPLU5 for the nest 1 reactions and rPLU3/rPLU4 for the genus-specific nest 2 amplifications. Whenever the genus-specific nest 2 PCR revealed positive results, the following species-specific nest 2 primers were used to determine the Plasmodium species: rFAL1/rFAL2 (P. falciparum), rVIV1/rVIV2 (P. vivax), rMAL1/rMAL2 (P. malariae), rOVA1/rPLU2 (P. ovale), and Pmk8/Pmkr9 (P. knowlesi). All oligonucleotide primers were obtained from Microsynth AG (Balgach, Switzerland).

A 50-μl nest 1 reaction mixture, which included 25 μl 2× Phusion blood PCR buffer (which included 200 μM deoxynucleoside triphosphates [dNTPs] and 3 mM MgCl2), 1 μl (2 U) Phusion blood DNA polymerase, and 5 μl of each primer (rPLU1 and rPLU5, 10 μM), was made according to the manufacturer's manual (2). The DNA was denatured at 98°C for 4 min, followed by 25 cycles of amplification (annealing, 65°C for 2 min; extension, 72°C for 2 min; denaturation, 94°C for 1 min). After 25 cycles, the final extension was done at 72°C for 4 min using an Eppendorf Mastercycler Personal (Eppendorf AG, Hamburg, Germany). The annealing temperature was determined using the Tm calculator on the manufacturer's website (https://www.finnzymes.fi/tm_determination.html) (2). The resulting nest 1 PCR product was centrifuged at 1,000 × g for 3 min. Volumes of 2.5 μl of nest 1 products (same in standard nested PCR and direct nested PCR) were used in 25-μl nest 2 amplification mixtures (GoTaq PCR core system; Promega, Madison, WI).

Known positive-control samples and nuclease-free water as the negative control were run with each PCR amplification. Nest 2 PCR products were analyzed by gel electrophoresis with 2% agarose and ethidium bromide staining.

Previous Section
Next Section
Standard nested PCR technique.

A modified Chelex-based method using an InstaGene whole blood kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) was used to extract DNA from blood spots on filter paper. A blood spot of 4 mm in diameter was punched out and soaked overnight in 100 μl of phosphate-buffered saline (PBS) at 4°C. DNA extraction was performed on the following day as described previously (1). All samples were purified twice with the InstaGene matrix and stored at −20°C until further processing.

A template of 5 μl was used in a 50-μl nest 1 reaction mixture (GoTaq PCR core system; Promega, Madison, WI) under the following conditions: 5 μl of each primer (10 μM), 125 μM each dNTP, 2 mM MgCl2, and 1 U of GoTaq DNA polymerase.

Nest 2 reactions and further procedures (with the exception of the centrifugation step of the direct PCR nest 1 product) were identical to the standard- and direct nested-PCR techniques discussed above.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ใช้ PCR ซ้อนกันโดยตรงทำให้การตรวจพบของพลาสโมเดียมโอจากตัวอย่างเลือดที่เก็บบนกระดาษกรองโดยขั้นตอนใช้เวลานานเกี่ยวข้องกับการสกัดดีเอ็นเอ PCR โดยตรงให้เป็นทางเลือกที่รวดเร็ว มีความไวสูง และมีประสิทธิภาพเพื่อการวินิจฉัยโรคมาลาเรียโดยใช้กระดาษกรองตัวอย่าง และมาตรฐานซ้อน PCRมาลาเรียเหลือ ภาระสุขภาพหลักสากลกับโทรตายการประเมินของ 900,000 เกือบทุกปี (11) รายงานล่าสุดของใหม่ใหม่ต้านทาน artemisinin และการเกิดขึ้นของประชากรยุงจำนวน "ใหม่ อาจบุคคล pathogenic พลาสโมเดียมชนิด เช่นพลาสโมเดียม knowlesi ตลอดจนความหลากหลายกับ ovale เดียม ในเอเชียระบุว่า มีความเร่งด่วนที่จำเป็นสำหรับเทคนิคใหม่เพื่อให้การวิเคราะห์อย่างรวดเร็ว และแม่นยำสูงเพื่อรักษา และควบคุมโรคมาลาเรีย (3 อย่างเพียงพอ , 5, 9)การใช้ PCR โดยตรงช่วยให้สำหรับ amplifications PCR โดยการสกัดดีเอ็นเอก่อนและฟอกขั้นตอน เลือด Phusion พอลิเมอเรส DNA ที่ใช้ในการวิเคราะห์เป็นรายงานเพื่อนำไปสู่อัตราข้อผิดพลาด 25-fold-ล่างกว่าจะทั่ว Thermus aquaticus พอลิเมอเรส (2)จุดมุ่งหมายของการศึกษานี้มี การปรับเทคนิคนี้นวนิยายสำหรับใช้ในการตรวจโดยห้องปฏิบัติการที่รวดเร็วของพลาสโมเดียมโอ และ การตรวจสอบความไวของเทคนิคนี้โดยที่ PCR ธรรมดาซ้อนและ microscopy (6, 8)ตัวอย่างผู้ป่วยถูกเก็บรวบรวมระหว่าง 2007 และ 2009 ที่ศูนย์ MARIB (Bandarban การริเริ่มวิจัยมาลาเรีย) ใน Bandarban รามิด Chittagong Hill บังคลาเทศ เป็นส่วนหนึ่งของการสำรวจไข้ตามโรงพยาบาล และฟิลด์ แจ้งความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษรได้รับจากการร่วมศึกษาหรือตัวแทนของตนตามกฎหมาย และโพรโทคอลการศึกษาได้รับการอนุมัติ โดยคณะกรรมการตรวจสอบจริยธรรมที่เหมาะสมจากทั้งหมดเข้าร่วมผู้ป่วยอายุ 8 ปี และมากกว่า 100 μl เลือดดำออก จากผู้ป่วยอายุน้อยกว่า 8 ปี 2 หยดเลือดที่ได้รับ โดยนิ้วพริกถูกรวบรวม และโอนสำเนาลงบนกระดาษกรอง 903 (Schleicher & GmBH ซื้อ Schuell, Dassel เยอรมนี) กระดาษกรองอากาศแห้งที่อุณหภูมิห้อง และเก็บไว้ภายใต้เงื่อนไขแบบสุญญากาศที่ 4° C จนประมวลผลต่อไป ได้ จำนวน 140 กระดาษกรองตัวอย่างรวมอยู่ในการประเมินส่วนก่อนหน้านี้ส่วนถัดไปตรงซ้อน PCRเลือดจุดเส้นผ่าศูนย์กลาง 2 มม.เจาะรูออกจากแต่ละตัวอย่างกระดาษกรอง และล้างน้ำ 30 μl กลั่นคู่ที่ 50 ° C สำหรับ 3 นาที น้ำถูกเอาออก และส่วนผสม PCR (Phusion เลือดตรง PCR ชุด Finnzymes Oy, Espoo ฟินแลนด์) ถูกเพิ่มโดยตรงกับตัวอย่าง โพรโทคอลที่การปรับเปลี่ยนมาตรฐานซ้อน-PCR ถูกใช้สำหรับการประเมิน specific สกุล และ species เดียมเอ็นภายในภูมิภาคสูงนำของยีนใน rRNA (SSU) ย่อยขนาดเล็ก (6, 7, 8) ใช้ไพรเมอร์ดังต่อไปนี้: rPLU1/rPLU5 สำหรับปฏิกิริยารัง 1 และ rPLU3/rPLU4 สำหรับเฉพาะสกุลรัง 2 amplifications เมื่อใดก็ ตามเฉพาะสกุลรัง 2 PCR เปิดเผยผลบวก ไพรเมอร์ species-specific รัง 2 ต่อไปนี้ถูกใช้เพื่อกำหนดชนิดพลาสโมเดียม: rFAL1/rFAL2 (P. falciparum), rVIV1 (P. vivax) rVIV2, rMAL1 (P. malariae) rMAL2, rOVA1/rPLU2 (P. ovale), และ Pmkr9 Pmk8 (P. knowlesi) ไพรเมอร์ oligonucleotide ทั้งหมดได้รับมาจาก Microsynth AG (Balgach สวิตเซอร์แลนด์)50 μl รังปฏิกิริยา 1 ส่วนผสม ซึ่งรวม 25 μl 2 × Phusion เลือด PCR บัฟเฟอร์ (ซึ่งรวม 200 μM deoxynucleoside triphosphates [dNTPs] และ 3 มม. MgCl2) 1 (2 U) μl Phusion เลือดดีเอ็นเอพอลิเมอเรส และ μl 5 แต่ละพื้น (rPLU1 และ rPLU5, 10 μM), ทำตามคู่มือของผู้ผลิต (2) ดีเอ็นเอถูก denatured ที่ 98° C สำหรับ 4 นาที ตาม ด้วยวงจร 25 การขยาย (การอบ เหนียว 65° C สำหรับ 2 นาที ส่วน ขยาย 72° C สำหรับ 2 นาที denaturation, 94° C สำหรับ 1 นาที) หลังจากรอบ 25 ขยายสุดท้ายได้กระทำที่ 72° C สำหรับ 4 นาทีโดยใช้การ Eppendorf Mastercycler ส่วนบุคคล (Eppendorf AG ฮัมบูร์ก เยอรมนี) อุณหภูมิหลอมถูกกำหนดโดยใช้เครื่องคิดเลข Tm บนเว็บไซต์ของผู้ผลิต (https://www.finnzymes.fi/tm_determination.html) (2) ผลิตภัณฑ์ PCR รัง 1 ผลลัพธ์ถูก centrifuged ที่ 1000 × g สำหรับใช้ในน้ำยาผสม 2 ขยายรัง 25-μl (ระบบหลัก GoTaq PCR; 3 นาทีปริมาณของ μl 2.5 ของผลิตภัณฑ์รัง 1 (เหมือนใน PCR มาตรฐานซ้อนซ้อน PCR โดยตรง) Promega เมดิสัน WI)ตัวอย่างบวกควบคุมทราบและ nuclease ปราศจากน้ำเป็นตัวควบคุมค่าลบถูกเรียกใช้กับขยาย PCR แต่ละ ผลิตภัณฑ์ PCR รัง 2 ถูกวิเคราะห์ โดย electrophoresis เจล 2% agarose และย้อมสีโบรไมด์ ethidiumส่วนก่อนหน้านี้ส่วนถัดไปมาตรฐานซ้อน PCR เทคนิคแก้ไข Chelex ตามวิธีการใช้ชุดการรวมเลือด InstaGene (ห้องปฏิบัติการชีวภาพ Rad เฮอร์คิวลิส แคลิฟอร์เนีย) ถูกใช้เพื่อแยกดีเอ็นเอจากเลือดจุดบนกระดาษกรอง จุดเลือดของเส้นผ่าศูนย์กลาง 4 มม.เจาะรูออกมา และนำไปแช่ค้างคืนใน μl 100 ของ buffered ฟอสเฟตน้ำเกลือ (PBS) ที่ 4 องศาเซลเซียส ทำการสกัดดีเอ็นเอในต่อวันอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (1) ตัวอย่างทั้งหมดก็บริสุทธิ์สองกับเมตริกซ์ InstaGene และเก็บไว้ที่ −20 ° C จนประมวลผลต่อไปใช้แบบของ 5 μl ใน 50 μl รัง 1 ปฏิกิริยาส่วนผสม (ระบบหลัก GoTaq PCR Promega เมดิสัน WI) ภายใต้เงื่อนไขต่อไปนี้: 5 μl ของแต่ละพื้น (10 μM), 125 μM dNTP, MgCl2 2 มม. และพอลิเมอเรส U GoTaq DNA 1ซ้อนปฏิกิริยาที่ 2 และขั้นตอนต่อไป (ยกเว้นขั้นตอน centrifugation ผลิตภัณฑ์รัง 1 PCR โดยตรง) ได้เหมือนกับเทคนิคมาตรฐาน และตรงซ้อน-PCR ที่กล่าวถึงข้างต้น

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การใช้วิธี PCR ที่ซ้อนกันโดยตรงจะช่วยให้การตรวจสอบของ Plasmodium เอสพีพี จากตัวอย่างเลือดที่เก็บรวบรวมบนกระดาษกรองโดยไม่ต้องมีขั้นตอนที่ใช้เวลานานที่เกี่ยวข้องกับการสกัดดีเอ็นเอ PCR Direct ให้อย่างรวดเร็วมีความไวสูงและค่าใช้จ่ายที่มีประสิทธิภาพทางเลือกในการวินิจฉัยโรคมาลาเรียโดยใช้ตัวอย่างกระดาษกรองและมาตรฐานที่ซ้อนกัน PCR. มาลาเรียยังคงเป็นภาระด้านสุขภาพที่สำคัญระดับโลกที่มีผู้เสียชีวิตประมาณ 900,000 เกือบทุกปี (11) รายงานล่าสุดของที่เกิดขึ้นใหม่ที่เพิ่งต้านทาน artemisinin และการเกิดของประชากรถิ่นของจำนวนของ "ใหม่" ที่อาจเกิดขึ้นของมนุษย์ที่ทำให้เกิดโรคชนิด Plasmodium เช่น Plasmodium knowlesi เช่นเดียวกับความหลากหลายของปรสิต Plasmodium ovale ในเอเชียระบุว่ามีเป็น ความจำเป็นเร่งด่วนสำหรับเทคนิคใหม่เพื่อให้การวินิจฉัยที่รวดเร็วและมีความถูกต้องสูงเพียงพอที่จะรักษาและควบคุมโรคมาลาเรีย (3, 5, 9). การใช้วิธี PCR โดยตรงช่วยให้การขยายเสียง PCR โดยไม่มีการสกัดดีเอ็นเอใด ๆ ก่อนและขั้นตอนการทำให้บริสุทธิ์ โพลิเมอร์ดีเอ็นเอเลือด Phusion ที่ใช้ในการทดสอบเป็นรายงานที่นำไปสู่อัตราความผิดพลาด 25 เท่าต่ำกว่าโพลิเมอร์ Thermus aquaticus ร่วมกัน (2). จุดมุ่งหมายของการศึกษาครั้งนี้คือการปรับตัวเข้ากับเทคนิคใหม่นี้สำหรับการใช้งานใน laboratory- อย่างรวดเร็ว ตามการตรวจสอบของ Plasmodium เอสพีพี และการตรวจสอบความไวของเทคนิคนี้ในการเปรียบเทียบกับที่ของ PCR แบบเดิมที่ซ้อนกันและกล้องจุลทรรศน์ (6, 8). ตัวอย่างผู้ป่วยที่ถูกเก็บรวบรวมระหว่างปี 2007 และ 2009 ที่ Marib (มาลาเรียวิจัยความคิดริเริ่ม Bandarban) ศูนย์ Bandarban, Chittagong ขุดเจาะภูเขาบังคลาเทศ ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของโรงพยาบาลและการสำรวจภาคสนามไข้ตาม ความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษรที่ได้รับจากผู้เข้าร่วมการศึกษาหรือผู้แทนของตนตามกฎหมายและโปรโตคอลการศึกษาได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการตรวจสอบจริยธรรมที่เหมาะสม. จากผู้ป่วยที่เข้าร่วมโครงการทั้งหมดอายุ 8 ปีและผู้สูงอายุ 100 ไมโครลิตรเลือดดำถูกดึง จากผู้ป่วยที่อายุน้อยกว่า 8 ปี 2 หยดเลือดที่ได้จากการทิ่มนิ้วถูกเก็บรวบรวมและโอนไปยัง 903 กระดาษกรอง (Schleicher และ Schuell ไบ GmbH, Dassel, เยอรมนี) ในที่ซ้ำกัน เอกสารถูกกรองอากาศแห้งที่อุณหภูมิห้องและเก็บไว้ภายใต้สภาพอากาศที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสจนกว่าจะดำเนินการต่อไป จำนวนรวมทั้งสิ้น 140 ตัวกรองตัวอย่างกระดาษถูกรวมอยู่ในการประเมินผล. ก่อนหน้ามาตรามาตราถัดไปตรงที่ซ้อนกันPCR. จุดเลือด 2 มมถูกเจาะออกมาจากแต่ละตัวอย่างกระดาษกรองและล้างด้วยน้ำสองครั้งที่กลั่น 30 ไมโครลิตรที่ 50 ° C เป็นเวลา 3 นาที น้ำจะถูกลบออกและส่วนผสม PCR (Phusion เลือดชุด PCR โดยตรง Finnzymes Oy, เอสโป, ฟินแลนด์) ถูกบันทึกโดยตรงไปยังกลุ่มตัวอย่าง แก้ไขโปรโตคอลมาตรฐานที่ซ้อนกัน-PCR ที่ใช้สำหรับการประเมินผลของดีเอ็นเอ Plasmodium genus- และพันธุ์เฉพาะภายในภูมิภาคอนุรักษ์สูงของหน่วยย่อยขนาดเล็ก (ที่ซุ) rRNA ยีน (6, 7, 8) ไพรเมอร์ต่อไปนี้ถูกนำมาใช้: rPLU1 / rPLU5 สำหรับรัง 1 ปฏิกิริยาและ rPLU3 / rPLU4 สำหรับรังสกุลเฉพาะ 2 เครื่องขยายเสียง เมื่อใดก็ตามที่รังสกุลเฉพาะ 2 PCR เปิดเผยผลบวกสายพันธุ์เฉพาะต่อไปนี้รัง 2 ไพรเมอร์ที่ถูกใช้ในการกำหนดชนิด Plasmodium: rFAL1 / rFAL2 (พี falciparum) rVIV1 / rVIV2 (พี vivax) rMAL1 / rMAL2 ( P. malariae) rOVA1 / rPLU2 (พี ovale) และ Pmk8 / Pmkr9 (พี knowlesi) ไพรเมอร์ oligonucleotide ทั้งหมดที่ได้รับจาก Microsynth AG (Balgach วิตเซอร์แลนด์). 50 ไมโครลิตรรัง 1 ผสมปฏิกิริยาซึ่งรวมถึง 25 ไมโครลิตร 2 × Phusion บัฟเฟอร์ PCR ในเลือด (ซึ่งรวมถึง 200 ไมครอน triphosphates deoxynucleoside [dNTPs] และ 3 มิลลิ MgCl2) 1 ไมโครลิตร (2 U) Phusion เลือดดีเอ็นเอโพลิเมอร์และ 5 ไมโครลิตรของแต่ละไพรเมอร์ (rPLU1 และ rPLU5 10 ไมครอน) ได้ทำตามคู่มือของผู้ผลิต (2) ดีเอ็นเอถูกเอทิลแอลกอฮอล์ที่ 98 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 4 นาทีตามด้วย 25 รอบของการขยาย (การอบ 65 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาที; ขยาย 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาที; denaturation 94 ° C เป็นเวลา 1 นาที) หลังจาก 25 รอบนามสกุลสุดท้ายก็ทำได้ที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 4 นาทีใช้ Eppendorf Mastercycler ส่วนบุคคล (Eppendorf AG, ฮัมบูร์ก, เยอรมนี) อุณหภูมิการหลอมถูกกำหนดโดยใช้เครื่องคิดเลข Tm บนเว็บไซต์ของผู้ผลิต (https://www.finnzymes.fi/tm_determination.html) (2) รังผล 1 ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 1000 ×กรัมเป็นเวลา 3 นาที ปริมาณ 2.5 ไมโครลิตรรัง 1 ผลิตภัณฑ์ (มาตรฐานเดียวกันใน PCR ที่ซ้อนกันและ PCR โดยตรงซ้อนกัน) ถูกนำมาใช้ในรัง 25 ไมโครลิตร 2 ผสมเครื่องขยายเสียง (GoTaq ระบบหลัก PCR; Promega, Madison, WI). เป็นที่รู้จักในกลุ่มตัวอย่างที่เป็นบวกและการควบคุม nuclease- น้ำฟรีเช่นการควบคุมเชิงลบวิ่งกันขยาย PCR Nest 2 ผลิตภัณฑ์ PCR วิเคราะห์ข่าวคราวกับ agarose 2% และ ethidium ย้อมสีโบรไมด์. ก่อนหน้ามาตราถัดไปมาตรามาตรฐานซ้อนเทคนิคPCR. แก้ไขวิธี Chelex โดยใช้ชุดเลือด InstaGene ทั้ง (ห้องปฏิบัติการ Bio-Rad ดาว, CA) เป็น ใช้ในการสกัดดีเอ็นเอจากจุดเลือดบนกระดาษกรอง จุดเลือด 4 มมถูกเจาะออกมาและแช่ค้างคืนใน 100 ไมโครลิตรน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (พีบีเอส) ที่ 4 ° C การสกัดดีเอ็นเอที่ได้ดำเนินการในวันต่อไปนี้ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (1) ตัวอย่างทั้งหมดถูกบริสุทธิ์เป็นครั้งที่สองกับเมทริกซ์ InstaGene และเก็บไว้ที่ -20 ° C จนดำเนินการต่อไป. แม่แบบ 5 ไมโครลิตรที่ใช้ใน 50 ไมโครลิตรรัง 1 ปฏิกิริยาส่วนผสม (ระบบหลัก GoTaq PCR; Promega, Madison, WI) ภายใต้ ต่อไปนี้เงื่อนไข: 5 ไมโครลิตรของแต่ละไพรเมอร์ (10 ไมครอน) 125 ไมครอนแต่ละ dNTP 2 มิลลิ MgCl2 และ 1 ยู GoTaq ดีเอ็นเอโพลิเมอร์. Nest 2 ปฏิกิริยาและขั้นตอนต่อไป (ยกเว้นขั้นตอนการหมุนเหวี่ยงของรัง PCR โดยตรงที่ 1 ผลิตภัณฑ์) เหมือนกันกับระดับมาตรฐานและตรงเทคนิคการซ้อนกัน-PCR ที่กล่าวข้างต้น

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การใช้โดยตรงด้วยวิธี PCR สามารถตรวจหาการ spp . จากตัวอย่างเลือดที่เก็บบนกระดาษกรองโดยไม่ต้องขั้นตอนที่ใช้เวลานานที่เกี่ยวข้องกับการสกัดดีเอ็นเอ โดยตรง ให้บริการอย่างรวดเร็ว ความไวสูงและมีประสิทธิภาพทางเลือกเพื่อการวินิจฉัยโรคมาลาเรียที่ใช้กรองกระดาษตัวอย่างมาตรฐานซ้อนกัน

และ PCRโรคมาลาเรียยังคงเป็นสาขาด้านสุขภาพเป็นภาระกับคาดว่ามีผู้เสียชีวิตเกือบ 900000 ทุกปี ( 11 ) รายงานล่าสุดของยาต้านใหม่และวิวัฒนาการของประชากร ถิ่นของ " ใหม่ " ที่อาจก่อโรคชนิดพลาสโมเดียมมนุษย์ เช่น พลาสโมเดียม โนวซี่ , เช่นเดียวกับความหลากหลายของปรสิตพลาสโมเดียม โอวาเล ,ในเอเชีย พบว่า มีความต้องการเร่งด่วนสำหรับเทคนิคใหม่เพื่อให้รวดเร็วและถูกต้องสูง สามารถรักษาและควบคุมโรคมาลาเรียการวินิจฉัย ( 3 , 5 , 9 ) .

ใช้ PCR PCR โดยตรงช่วยให้ amplifications โดยไม่ก่อนการสกัดดีเอ็นเอและขั้นตอนการฟอก .การ phusion เลือด DNA polymerase ที่ใช้ในการทดสอบจะรายงานให้นำไปสู่ 25 พับลดอัตราความผิดพลาดมากกว่าปกติ thermus ใช้สื่อ ( 2 )

มีวัตถุประสงค์เพื่อปรับนี้เทคนิคใหม่สำหรับใช้ในห้องปฏิบัติการอย่างรวดเร็วจากการตรวจหาชนิด และตรวจสอบความไวของเทคนิคนี้ในการเปรียบเทียบ ที่ซ้อนกันและการใช้กล้องจุลทรรศน์แบบ PCR ( 6 , 8 ) .

ตัวอย่างผู้ป่วยจำนวนระหว่าง 2007 และ 2009 ที่ คามิ ( โครงการวิจัยโรคมาลาเรียบันดาร์บัน ) ศูนย์ในบันดาร์บัน Chittagong Hill Tracts บังกลาเทศ เป็นส่วนหนึ่งของโรงพยาบาล และการสำรวจภาคสนาม ไข้ขึ้นอยู่ เขียนโดยความยินยอมจากผู้เข้าร่วมการศึกษาทั้งหมดหรือตัวแทนทางกฎหมายของพวกเขาและการศึกษาโปรโตคอลได้รับอนุมัติจากคณะกรรมการพิจารณาจริยธรรมที่เหมาะสม .

จากทั้งหมดที่เข้าร่วมโครงการ ผู้ป่วยอายุ 8 ปี และอายุมากกว่า เลือด 100 μฉันสามารถวาด . จากผู้ป่วยที่อายุน้อยกว่า 8 ปี 2 หยดเลือดได้โดยการใช้นิ้วสะกิดที่ถูกเก็บรวบรวมและโอนไปยังกว่ากรองกระดาษ ( ไชลเคอร์& schuell วิทยาศาสตร์ชีวภาพ dassel GmbH , Germany ) ในที่ซ้ำกันกระดาษกรองแห้งที่อุณหภูมิห้องและเก็บไว้ภายใต้สภาวะสุญญากาศที่อุณหภูมิ 4 องศา C ถึงการประมวลผลต่อไป จำนวน 140 ตัวกรองกระดาษ จำนวนรวมอยู่ในการประเมินค่า



ส่วนก่อนหน้านี้ต่อไปตรงซ้อนกัน )

เลือด 2 จุดมม. ถูกเจาะออกจากตัวกรองแต่ละตัวอย่างกระดาษและล้างด้วยน้ำกลั่นที่ 30 μ L คู่ 50 ° C เป็นเวลา 3 นาทีน้ำจะถูกลบออกและเพิ่มส่วนผสม ( phusion เลือดโดยตรงชุด ; finnzymes นี่ โป , ฟินแลนด์ ) ถูกเติมโดยตรงตัวอย่าง การแก้ไขมาตรฐานโปรโตคอล PCR ซ้อนกันใช้สำหรับการประเมินและการสกุล - เผ่าพันธุ์ - เฉพาะดีเอ็นเอภายในสูงบริเวณอนุรักษ์ของหน่วยย่อยเล็ก ( ซื่อ ) rRNA ยีน ( 6 , 7 , 8 ) ไพรเมอร์ใช้ต่อไปนี้ :rplu1 / rplu5 สำหรับรัง 1 ปฏิกิริยาและ rplu3 / rplu4 สำหรับชนิดเฉพาะรัง 2 amplifications . เมื่อใดก็ตามที่สกุลเฉพาะรัง 2 PCR พบผลลัพธ์ที่เป็นบวก ตามเผ่าพันธุ์ - เฉพาะรังที่ 2 โดยการใช้ระบุชนิด rfal1 / rfal2 ( หน้าปารั ) rviv1 / rviv2 ( หน้าไวแวกซ์ ) rmal1 / rmal2 ( หน้าไข้จับสั่น ) rova1 / rplu2 ( หน้ารูปไข่ ) , และ pmk8 / pmkr9 ( หน้า knowlesi )ไพรเมอร์ ซึ่งทั้งหมดได้จาก microsynth AG ( balgach , สวิตเซอร์แลนด์ ) .

50 μผมรัง 1 ปฏิกิริยาผสม ซึ่งรวม 25 μ L 2 ×บัฟเฟอร์และเลือด phusion ( ซึ่งรวม 200 μ M deoxynucleoside ไตรฟ เฟต [ dntps ] และ 3 มิลลิเมตร MgCl2 ) 1 μ L ( 2 u ) ดีเอ็นเอพอลิเมอเรสในเลือด phusion และ 5 μ L ของแต่ละสี ( rplu1 rplu5 μและ 10 เมตร ) สร้างตามคู่มือของผู้ผลิต ( 2 )ดีเอ็นเอเกิดที่ 98 ° C เป็นเวลา 4 นาที ตามด้วย 25 รอบขยาย ( annealing 65 ° C เป็นเวลา 2 นาที ; ขยาย , 72 ° C เป็นเวลา 2 นาที ; ( 94 ° C เป็นเวลา 1 นาที ) หลังจาก 25 รอบ นามสกุล สุดท้ายทำที่ 72 ° C เป็นเวลา 4 นาทีโดยใช้เพนดอร์ฟ mastercycler ส่วนบุคคล ( เพนดอร์ฟ AG , ฮัมบูร์ก , เยอรมนี )ที่อุณหภูมิการอบอ่อน ตั้งใจใช้ TM เครื่องคิดเลขในเว็บไซต์ของผู้ผลิต ( https://www.finnzymes.fi/tm_determination.html ) ( 2 ) ผลตรวจรัง 1 ผลิตภัณฑ์ไฟฟ้าที่ 1000 × G สำหรับ 3 นาที ปริมาณ 2.5 μ l ผลิตภัณฑ์รังนก 1 ( เดียวกันในมาตรฐานที่ซ้อนกันและซ้อนกันโดยตรงโดย PCR ) จำนวน 25 - μผมรัง 2 แบบผสม ( gotaq PCR promega หลัก , ระบบMadison , WI )

รู้จักบวกควบคุมตัวอย่างและนิวเคลียสน้ำฟรี เช่น ควบคุมเชิงลบที่ใช้แต่ละวิธี Amplification . รังนก 2 ) ผลิตภัณฑ์ โดยใช้เจลกับโรส 2% และทิเดียมโบรไมด์ . .



ต่อไปก่อน ส่วนมาตรฐานและเทคนิคซ้อนกัน

โดยวิธีการแก้ไข chelex โดยใช้ชุดเลือด instagene ( ไบโอ ราดห้องปฏิบัติการ , Hercules ,แคลิฟอร์เนีย ) ถูกใช้เพื่อสกัดดีเอ็นเอจากจุดเลือดบนกระดาษกรอง เลือดจุด 4 มม. ถูกเจาะออก และแช่ค้างคืนใน 100 μลิตรฟอสเฟตในน้ำเกลือ ( PBS ) ที่อุณหภูมิ 4 องศา การสกัดดีเอ็นเอแสดงในวันต่อไปนี้ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( 1 ) ตัวอย่างบริสุทธิ์สองครั้งกับ instagene เมทริกซ์และเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 20 ° C −

จนการประมวลผลต่อไปแม่แบบ 5 μผมใช้ 50 μผมรัง 1 ปฏิกิริยาผสม ( gotaq PCR หลักของระบบ promega เมดิสัน , WI ) ภายใต้เงื่อนไขต่อไปนี้ : 5 μ L ของแต่ละสี ( 10 μ M ) , 125 μ M แต่ละชุด dntp 2 มม. และ 1 U ของ gotaq DNA polymerase

รังนก 2 ปฏิกิริยาและเพิ่มเติมวิธีการ ( กับข้อยกเว้นของ 3 ขั้นตอนของ PCR ตรงรัง 1 ผลิตภัณฑ์ ) เป็นเหมือนมาตรฐาน - และโดยตรงด้วย PCR เทคนิคที่กล่าวถึงข้างต้น