Analysis of DNA sequences of severa

Analysis of DNA sequences of several mostly singlecopy
nuclear genes have recently been used to study evolutionary
relationships among closely related fungi. The
multiple gene genealogies are an effective tool for
reconstructing the evolutionary history of pathogenic
fungi. b-tubulin, translation elongation factor 1-a
(EF-1a), calmodulin and actin genes have been used
successfully in delineating relationships between fungi,
including phylogenetic studies of plant-pathogenic fungi
such as Cylindrocarpon destructans (Seifert et al., 2003)
and Fusarium solani f.sp. eumartii (Romberg & Davis,
2007). Phylogenetic analysis based on multiple genes has
been reported for many fungal species, such as Verticillium
dahliae (Collado-Romero et al., 2008), Pyricularia
spp. (Hirata et al., 2007) and Fusarium avenaceum
(Nalim et al., 2009). Recently, Dixon et al. (2009) carried
out phylogenetic analyses using nucleotide
sequences of four genes – the ITS regions of rDNA, two
random hypervariable loci and the actin-encoding gene –
on 143 isolates of Corynespora spp., and showed a lack
of recombination within the species and six statistically
significant phylogenetic lineages among the isolates of
C. cassiicola that correlated with host of origin, pathogenicity
and growth rate, but not with geographic location
of collection.
In Japan, C. cassiicola has caused severe damage on
perilla (Perilla frutescens), cucumber (Cucumis sativus),
tomato (Solanum lycopersicum) and aubergine (Solanum
melongena) crops. It was previously reported that corynespora
blight occurred on sweet pepper (Capsicum annuum)
in Kochi prefecture, Japan (Shimomoto et al.,
2008), and has spread through the western areas of
Japan, leading to massive losses in sweet pepper production.
The exact characterization and understanding of the
genetic diversity of isolates of plant-pathogenic fungi are
key elements for ecological and epidemiological analysis
of the pathogens and developing disease-control systems
against them. Previously, pathogenic variation was
shown among isolates from Kochi prefecture on perilla,
cucumber, tomato, aubergine and sweet pepper (data not
shown). However, information regarding phylogenetic
and genetic diversity of Japanese isolates of C. cassiicola
remains unclear.
In this study, to develop a method for discrimination of
isolates virulent to sweet pepper among Japanese isolates
of C. cassiicola, based on their pathogenic and genetic
variation, we first constructed the pathogenic profiles of
Japanese C. cassiicola isolates were first constructed by
dividing the isolates into seven groups based on their
pathogenicity on perilla, cucumber, tomato, aubergine
and sweet pepper. They were then divided into three
phylogenetic groups, multigene phylogenetic group
(MP)-A, MP-B and MP-C, by multigene phylogenetic
analysis based on nucleotide sequences of the b-tubulin,
EF-1a, calmodulin and actin genes. Because isolates
virulent to sweet pepper were placed in MP-B and MP-C,
a specific and sensitive method was developed to discriminate
them from other isolates within MP-B and MP-C by
RAPDanalysis.
Materials and methods
Fungal isolates
Sixty-four isolates of C. cassiicola from different hosts
and geographical locations in Japan, and a Netherlands
isolate (CBS162Æ60), a USA isolate (ATCC64204) and an
Indian isolate (ATCC26316) were analysed in this study
(Table 1). All isolates were purified with single spores to
ensure genetic uniformity and were cultured on potato
dextrose agar (PDA; DIFCO Laboratories).
Pathogenicity tests
Sweet pepper (cv. Kyonami), aubergine (cv. Senryo No.
2), tomato (cv. Momotaro), cucumber (cv. ZQ-7) and
perilla (cv. Aochirimen-Shiso) seedlings were grown in
pots containing commercial soil (Tsuchitaro, Sumitomo
Forestry) in a greenhouse at 25 ± 5C for 6 weeks.
Inocula were prepared by scraping the mycelium from
10-day-old PDA cultures and suspending them in sterile
distilled water (Shimomoto et al., 2008). The resulting
spore suspensions were filtered through double layers of
cheesecloth, and then adjusted to 104 spores mL)1. The
test plants were inoculated with 5 mL spore suspension
per plant by spraying. Control plants were treated with
sterile distilled water. Eight plants for each of the isolates
were used for the pathogenicity tests. Following inoculation,
plants were incubated for 48 h under 100%relative
humidity at 25C and then grown in a glasshouse at
25 ± 5C. Disease symptoms in inoculated leaves were
observed for 7 days after inoculation. Isolates were considered
virulent when expanding lesions in inoculated
leaves were observed, and avirulent when no lesion or
nonexpanding pinpoint lesions in inoculated leaves were
observed. Nonexpanding pinpoint lesions were certified
as the hypersensitive response, because observation
under a microscope showed no extension of penetration
hyphae in inoculated leaves, which were cut into sections,
decolorized with 99% methyl-alcohol, and then stained
with 0Æ1%cotton-blue.
DNA ext

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Analysis of DNA sequences of several mostly singlecopynuclear genes have recently been used to study evolutionaryrelationships among closely related fungi. Themultiple gene genealogies are an effective tool forreconstructing the evolutionary history of pathogenicfungi. b-tubulin, translation elongation factor 1-a(EF-1a), calmodulin and actin genes have been usedsuccessfully in delineating relationships between fungi,including phylogenetic studies of plant-pathogenic fungisuch as Cylindrocarpon destructans (Seifert et al., 2003)and Fusarium solani f.sp. eumartii (Romberg & Davis,2007). Phylogenetic analysis based on multiple genes hasbeen reported for many fungal species, such as Verticilliumdahliae (Collado-Romero et al., 2008), Pyriculariaspp. (Hirata et al., 2007) and Fusarium avenaceum(Nalim et al., 2009). Recently, Dixon et al. (2009) carriedout phylogenetic analyses using nucleotidesequences of four genes – the ITS regions of rDNA, tworandom hypervariable loci and the actin-encoding gene –on 143 isolates of Corynespora spp., and showed a lackof recombination within the species and six statisticallysignificant phylogenetic lineages among the isolates ofC. cassiicola that correlated with host of origin, pathogenicityand growth rate, but not with geographic locationof collection.In Japan, C. cassiicola has caused severe damage onperilla (Perilla frutescens), cucumber (Cucumis sativus),มะเขือ (Solanum lycopersicum) และมะเขือ (Solanumพืช melongena) มันมีก่อนหน้านี้รายงานว่า corynesporaยากลำบากที่เกิดขึ้นในพริกหวาน (พริก annuum)ในโคจิ ญี่ปุ่น (Shimomoto et al.,2008), และมีแพร่กระจายผ่านพื้นที่ตะวันตกของญี่ปุ่น การนำไปสู่การขาดทุนมหาศาลในการผลิตพริกหวานคุณลักษณะที่แน่นอนและความเข้าใจในการมีพันธุกรรมที่แยกของเชื้อราก่อโรคพืชองค์ประกอบที่สำคัญสำหรับการวิเคราะห์ทางระบาดวิทยา และระบบนิเวศเชื้อโรคและควบคุมโรคพัฒนาระบบจากนั้น ก่อนหน้านี้ รูปแบบทำให้เกิดโรคได้แสดงระหว่างแยกจากจังหวัดโคจิบน perilla ไพลแตงกวา มะเขือเทศ มะเขือ และพริกหวาน (ข้อมูลไม่แสดง) อย่างไรก็ตาม ข้อมูลเกี่ยวกับ phylogeneticและพันธุกรรมญี่ปุ่นแยกของ C. cassiicolaยังคงไม่ชัดเจนในการศึกษานี้ การพัฒนาวิธีการปฏิบัติของแยก virulent กับพริกหวานในญี่ปุ่นแยกของ C. cassiicola ตามของตนทำให้เกิดโรค และพันธุกรรมเปลี่ยนแปลง เราก่อนสร้างโพรไฟล์การก่อโรคของแยก cassiicola C. ญี่ปุ่นถูกสร้างขึ้นครั้งแรกโดยหารแยกเป็น 7 กลุ่มตามของพวกเขาpathogenicity อยู่บน perilla ไพล แตงกวา มะเขือเทศ มะเขือและพริกหวาน พวกเขาถูกแบ่งออกเป็นสามแล้วphylogenetic กลุ่ม กลุ่ม phylogenetic multigene(MP) -A, B MP และ MP-C โดย multigene phylogeneticวิเคราะห์ตามลำดับของนิวคลีโอไทด์ของ b-tubulinEF-1a, calmodulin and actin genes. Because isolatesvirulent to sweet pepper were placed in MP-B and MP-C,a specific and sensitive method was developed to discriminatethem from other isolates within MP-B and MP-C byRAPDanalysis.Materials and methodsFungal isolatesSixty-four isolates of C. cassiicola from different hostsand geographical locations in Japan, and a Netherlandsisolate (CBS162Æ60), a USA isolate (ATCC64204) and anIndian isolate (ATCC26316) were analysed in this study(Table 1). All isolates were purified with single spores toensure genetic uniformity and were cultured on potatodextrose agar (PDA; DIFCO Laboratories).Pathogenicity testsSweet pepper (cv. Kyonami), aubergine (cv. Senryo No.2), tomato (cv. Momotaro), cucumber (cv. ZQ-7) andperilla (cv. Aochirimen-Shiso) seedlings were grown inpots containing commercial soil (Tsuchitaro, SumitomoForestry) in a greenhouse at 25 ± 5C for 6 weeks.Inocula were prepared by scraping the mycelium from10-day-old PDA cultures and suspending them in steriledistilled water (Shimomoto et al., 2008). The resultingspore suspensions were filtered through double layers ofcheesecloth, and then adjusted to 104 spores mL)1. Thetest plants were inoculated with 5 mL spore suspensionper plant by spraying. Control plants were treated withsterile distilled water. Eight plants for each of the isolateswere used for the pathogenicity tests. Following inoculation,พืชได้รับการกก h 48 ญาติภายใต้ 100%ความชื้นที่ 25 C แล้ว ปลูกในเรือนกระจกสำหรับปลูกต้นไม้ที่25 ± 5 c โรคอาการในใบ inoculatedสังเกต 7 วันหลัง inoculation แยกพิจารณาว่าinoculated virulent เมื่อขยายแผลในใบได้สังเกต และ avirulent เมื่อไม่มีแผล หรือมีแผลเฉพาะจุด nonexpanding ในใบ inoculatedปฏิบัติ แผลแน่นอน nonexpanding ได้รับการรับรองเป็นการตอบสนอง ผิวแพ้ง่ายเนื่องจากการสังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์แสดงให้เห็นว่าไม่มีส่วนขยายของการเจาะhyphae ในใบ inoculated ซึ่งถูกตัดเป็นส่วนต่าง ๆdecolorized ด้วยเมทิลแอลกอฮอล์ 99% และการย้อมสีแล้วมี 0Æ1% ฝ้ายสีฟ้าต่อดีเอ็นเอ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การวิเคราะห์ดีเอ็นเอของหลาย singlecopy ส่วนใหญ่
ยีนนิวเคลียร์เมื่อเร็ว ๆ นี้ได้รับการใช้ในการศึกษาวิวัฒนาการ
ความสัมพันธ์ระหว่างเชื้อราเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิด
วงศ์วานว่านเครือของยีนหลายเป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพสำหรับ
การฟื้นฟูประวัติศาสตร์วิวัฒนาการของที่ทำให้เกิดโรค
เชื้อรา B-tubulin แปลยืดตัวปัจจัย 1-A
(EF-1a) calmodulin และโปรตีนยีนได้ถูกนำมาใช้
ประสบความสำเร็จในโทบี้ความสัมพันธ์ระหว่างเชื้อรา
รวมถึงการศึกษาวิวัฒนาการของเชื้อราพืชที่ทำให้เกิดโรค
เช่น destructans Cylindrocarpon (Seifert et al., 2003)
และ Fusarium solani f.sp. eumartii (Romberg และเดวิส,
2007) phylogenetic วิเคราะห์บนพื้นฐานของยีนหลายได้
รับการรายงานสำหรับสายพันธุ์ของเชื้อราเป็นจำนวนมากเช่น Verticillium
dahliae (Collado-Romero et al., 2008) Pyricularia
spp (Hirata et al., 2007) และ Fusarium avenaceum
(Nalim et al., 2009) เมื่อเร็ว ๆ นี้ดิกสัน, et al (2009) ดำเนินการ
ออก phylogenetic วิเคราะห์โดยใช้เบื่อหน่าย
ลำดับสี่ยีน - ภูมิภาคของ rDNA สอง
ตำแหน่ง hypervariable สุ่มและการแสดงออกของยีนโปรตีนเข้ารหัส -
143 ไอโซเลท Corynespora SPP และแสดงให้เห็นถึงการขาด.
ของการรวมตัวกันในชนิดและหก สถิติ
lineages phylogenetic อย่างมีนัยสำคัญในหมู่ไอโซเลทของ
ซี cassiicola ที่มีความสัมพันธ์กับโฮสต์ของแหล่งกำเนิดโรค
และอัตราการเจริญเติบโต แต่ไม่ได้มีที่ตั้งทางภูมิศาสตร์
ของคอลเลกชัน.
ในประเทศญี่ปุ่นซี cassiicola ได้ก่อให้เกิดความเสียหายอย่างรุนแรงใน
งา (ชิโซะ) แตงกวา (Cucumis sativus)
มะเขือเทศ (Solanum lycopersicum) และ มะเขือ (Solanum
melongena) พืช มันเป็นก่อนหน้านี้มีรายงานว่า corynespora
ทำลายที่เกิดขึ้นในพริกหวาน (พริกหวาน)
ในจังหวัด Kochi ญี่ปุ่น (Shimomoto et al.,
2008) และได้แพร่กระจายผ่านพื้นที่ทางตะวันตกของ
ประเทศญี่ปุ่นที่นำไปสู่การสูญเสียที่ยิ่งใหญ่ในการผลิตพริกหวาน.
แม่นตรง ลักษณะและความเข้าใจใน
ความหลากหลายทางพันธุกรรมของเชื้อของเชื้อราที่ทำให้เกิดโรคพืชเป็น
องค์ประกอบที่สำคัญสำหรับการวิเคราะห์ระบบนิเวศและระบาดวิทยา
ของเชื้อโรคและการพัฒนาระบบการควบคุมโรค
กับพวกเขา ก่อนหน้านี้การเปลี่ยนแปลงที่ทำให้เกิดโรคได้รับการ
แสดงในหมู่ไอโซเลทจากจังหวัด Kochi ใน perilla,
แตงกวามะเขือเทศมะเขือและพริกหวาน (ข้อมูลไม่
แสดง) อย่างไรก็ตามข้อมูลเกี่ยวกับวิวัฒนาการ
และความหลากหลายทางพันธุกรรมของเชื้อญี่ปุ่นซี cassiicola
ยังไม่ชัดเจน.
ในการศึกษานี้จะพัฒนาวิธีการในการเลือกปฏิบัติของ
สายพันธุ์รุนแรงพริกหวานท่ามกลางสายพันธุ์ญี่ปุ่น
ซี cassiicola บนพื้นฐานที่ทำให้เกิดโรคและพันธุกรรมของพวกเขา
เปลี่ยนแปลง ครั้งแรกที่เราสร้างโปรไฟล์ที่ทำให้เกิดโรคของ
ญี่ปุ่นซีไอโซเลท cassiicola ถูกสร้างขึ้นเป็นครั้งแรกโดย
แบ่งออกเป็นเจ็ดไอโซเลทกลุ่มอยู่บนพื้นฐานของพวกเขา
ก่อให้เกิดโรคใน perilla, แตงกวา, มะเขือเทศมะเขือ
และพริกหวาน พวกเขาจะถูกแบ่งออกเป็นสาม
กลุ่มสายวิวัฒนาการ multigene กลุ่ม phylogenetic
(MP) -A, MP-B และ MP-C โดย phylogenetic multigene
วิเคราะห์ตามลำดับเบสของ B-tubulin,
EF-1A, calmodulin และยีนโปรตีน เพราะแยก
รุนแรงพริกหวานถูกวางไว้ใน MP-B และ MP-C
เป็นวิธีที่เฉพาะเจาะจงและที่สำคัญได้รับการพัฒนาในการแยกแยะ
ออกจากสายพันธุ์อื่น ๆ ภายใน MP-B และ MP-C โดย
RAPDanalysis.
วัสดุและวิธีการ
เชื้อรา
หกสิบสี่สายพันธุ์ ซี cassiicola จากครอบครัวที่แตกต่างกัน
และสถานที่ทางภูมิศาสตร์ในประเทศญี่ปุ่นและเนเธอร์แลนด์
แยก (CBS162Æ60) ประเทศสหรัฐอเมริกาแยก (ATCC64204) และ
แยกของอินเดีย (ATCC26316) ถูกนำมาวิเคราะห์ในการศึกษานี้
(ตารางที่ 1) ไอโซเลททั้งหมดถูกทำให้บริสุทธิ์ด้วยสปอร์เดียวเพื่อ
ให้มั่นใจความสม่ำเสมอทางพันธุกรรมและการเพาะเลี้ยงในมันฝรั่ง
dextrose agar (PDA; Difco ห้องปฏิบัติการ).
การทดสอบการเกิดโรค
พริกหวาน (CV Kyonami.) มะเขือ (CV Senryo ฉบับที่.
2) มะเขือเทศ (CV โมโมทาโร่. ) แตงกวา (CV. ZQ-7) และ
งา (CV. Aochirimen-Shiso) ต้นกล้าปลูกใน
กระถางที่มีดินเชิงพาณิชย์ (Tsuchitaro, Sumitomo
ป่าไม้) ในเรือนกระจกที่ 25 ± 5 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 6 สัปดาห์.
Inocula ถูกจัดทำขึ้นโดย ขูดเส้นใยจาก
วัฒนธรรม PDA 10 วันเก่าและระงับพวกเขาในการฆ่าเชื้อ
น้ำกลั่น (Shimomoto et al., 2008) ส่งผลให้
สปอร์แขวนลอยถูกกรองผ่านชั้นสองเท่าของ
ผ้าและจากนั้นปรับให้สปอร์ 104 มิลลิลิตร) 1
พืชทดสอบถูกเชื้อกับสปอร์ขนาด 5 ml ระงับ
ต่อต้นโดยการฉีดพ่น พืชควบคุมได้รับการรักษาด้วย
น้ำกลั่นผ่านการฆ่าเชื้อ แปดพืชสำหรับแต่ละเชื้อ
ถูกนำมาใช้สำหรับการทดสอบการเกิดโรค ต่อไปนี้การฉีดวัคซีน,
พืชถูกบ่มเป็นเวลา 48 ชั่วโมงภายใต้ญาติ 100%
ความชื้นอยู่ที่ 25 องศาเซลเซียสและจากนั้นปลูกในเรือนกระจกที่
25 ± 5 องศาเซลเซียส อาการของโรคในใบเพาะเชื้อที่มี
การเฝ้าระวัง 7 วันหลังจากการฉีดวัคซีน ที่แยกได้รับการพิจารณา
ความรุนแรงเมื่อขยายแผลในเชื้อ
ใบถูกตั้งข้อสังเกตและ avirulent เมื่อไม่มีแผลหรือ
nonexpanding แผลระบุในใบเชื้อถูก
ตั้งข้อสังเกต Nonexpanding แผลระบุได้รับการรับรอง
เป็นตอบสนองเสียวเพราะสังเกต
ภายใต้กล้องจุลทรรศน์แสดงให้เห็นว่าไม่มีส่วนขยายของการเจาะ
เส้นใยในใบเชื้อซึ่งถูกตัดออกเป็นส่วน
decolorized กับ 99% เมธิลแอลกอฮอล์แล้วย้อมสี
ด้วยผ้าฝ้ายสีฟ้า0Æ1%.
ดีเอ็นเอ ต่อ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การวิเคราะห์ลำดับดีเอ็นเอของหลาย singlecopy เป็นส่วนใหญ่นิวเคลียร์ยีนที่ได้รับเมื่อเร็ว ๆนี้ใช้ในการศึกษาวิวัฒนาการความสัมพันธ์ระหว่างเชื้อราอย่างใกล้ชิดที่เกี่ยวข้อง ที่สำมะโนครัวเชื้อสายจีนหลายเป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพสำหรับจากวิวัฒนาการประวัติศาสตร์ เชื้อโรคเชื้อรา b-tubulin แปลยืดตัวปัจจัยกระเทียมดอง( ef-1a ) และมีการใช้ actin ยีนแคลโมดูลินเรียบร้อยแล้วในอธิบายความสัมพันธ์ระหว่างเชื้อรารวมทั้งศึกษาชนิดของเชื้อราที่ก่อโรคในพืชเช่น cylindrocarpon destructans ( ไซเฟิร์ท et al . , 2003 )Fusarium solani และเหมาะ eumartii ( รอมเบิร์ก & เดวิส2007 ) การวิเคราะห์ยีนได้ ซึ่งขึ้นอยู่กับหลายมีรายงานสำหรับชนิดของเชื้อราได้หลายอย่าง เช่น จำแนกชนิดdahliae ( COLLADO Romero et al . , 2008 ) , เชื้อราspp . ( ฮิราตะ et al . , 2007 ) และ Fusarium avenaceum( nalim et al . , 2009 ) เมื่อเร็ว ๆนี้ ดิกซัน และคณะ ( 2009 ) อุ้มจากการวิเคราะห์ phylogenetic โดยใช้ลำดับเบสลำดับ 4 ยีน ) ของภูมิภาคด้วย สองออกของแบบสุ่มและ actin การเข้ารหัสยีนจำกัดบน 143 จำนวน corynespora spp . และพบว่าขาดของการ ภายใน ชนิด และ หก สถิติวิวัฒนาการของสายพันธุ์ของทางเชื้อชาติC . cassiicola ที่มีความสัมพันธ์กับการโฮสต์ต้นทางและการเจริญเติบโต แต่ไม่ใช่กับที่ตั้งทางภูมิศาสตร์ของคอลเลกชันในญี่ปุ่น , C . cassiicola ได้ก่อให้เกิดความเสียหายรุนแรงในชิโสะ ( Perilla frutescens ) , แตงกวา ( ต้นแตงกวา )มะเขือเทศ ( ไม่สามารถจะยอมรับได้ lycopersicum ) และมะเขือ ( โซลานัมmelongena ) พืช มีรายงานว่า ก่อนหน้านี้ที่ corynesporaความเสียหายที่เกิดขึ้นในพริกหยวก ( พริก annuum )ใน Kochi Prefecture , ญี่ปุ่น ( shimomoto et al . ,2008 ) และได้แพร่กระจายผ่านทางตะวันตก พื้นที่ของญี่ปุ่น ที่นำไปสู่ความสูญเสียมหาศาลในการผลิตพริกหวานมีลักษณะที่แน่นอนและความเข้าใจของความหลากหลายทางพันธุกรรมของสายพันธุ์ของเชื้อราก่อโรคพืชองค์ประกอบหลักในการวิเคราะห์ทางนิเวศวิทยาและระบาดวิทยาการควบคุมโรคของเชื้อโรค และพัฒนาระบบกับพวกเขา ก่อนหน้านี้ การก่อโรค คือแสดงระหว่างสายพันธุ์จาก Kochi จังหวัดใน perillaแตงกวา , มะเขือเทศ , มะเขือและพริกหวาน ( ข้อมูลไม่แสดง ) อย่างไรก็ตาม ข้อมูลเกี่ยวกับวิวัฒนาการความหลากหลายทางพันธุกรรมของเชื้อและญี่ปุ่น cassiicola Cยังไม่ชัดเจนในการศึกษานี้ได้พัฒนาวิธีการเลือกปฏิบัติสายพันธุ์รุนแรงกับพริกหวานสายพันธุ์ของญี่ปุ่นบริษัท ซี. cassiicola ขึ้นอยู่กับพันธุกรรมของโรคและรูปแบบแรกที่เราสร้างโปรไฟล์ของเชื้อโรคญี่ปุ่น cassiicola สายพันธุ์เป็นครั้งแรกที่สร้างขึ้นโดย Cแบ่งออกเป็น 7 กลุ่ม ตามไอโซเลทก้ำบน perilla , แตงกวา , มะเขือเทศ , มะเขือและพริกหวาน พวกเขาถูกแบ่งออกเป็นสามกลุ่มยืนยัน multigene ชนิดกลุ่ม( MP ) - , mp-b และ mp-c โดย multigene วิวัฒนาการการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ของ b-tubulin ,ef-1a คาลโมดูลิน , actin และยีน เพราะไอโซเลทรุนแรงกับพริกหวานอยู่ใน mp-b mp-c และ ,วิธีการที่เฉพาะเจาะจงและอ่อนไหวถูกพัฒนาขึ้นเพื่อแยกแยะจากอื่น ๆจากภายในและ mp-b mp-c โดยrapdanalysis .วัสดุและวิธีการแยกเชื้อราหกสิบสี่สายพันธุ์ของ cassiicola จากโฮสต์ที่แตกต่างกันและทางภูมิศาสตร์ที่ตั้งอยู่ในญี่ปุ่นและเนเธอร์แลนด์แยก ( cbs162 กู้ 60 ) , สหรัฐอเมริกา ( atcc64204 ) และการแยกอินเดีย ( atcc26316 ) แยกวิเคราะห์ในการศึกษานี้( ตารางที่ 1 ) ทุกสายพันธุ์เป็นบริสุทธิ์กับสปอร์เดียวพันธุกรรมและให้ความสม่ำเสมอโดยเลี้ยงบนมันฝรั่งDextrose Agar ( PDA ; ห้องปฏิบัติการ difco )การทดสอบความสามารถในการทำให้เกิดโรคพริกหวานพันธุ์ kyonami ) , มะเขือพันธุ์ senryo ไม่2 ) , มะเขือเทศพันธุ์ โมโมทาโร่ ) , แตงกวา ( พันธุ์ zq-7 ) และใช้พันธุ์ aochirimen Shiso ) ต้นกล้าปลูกในกระถางที่มีดินเชิงพาณิชย์ ( tsuchitaro ราคาถูกวนศาสตร์ ) ในเรือนกระจกที่ 25 ± 5C เป็นเวลา 6 สัปดาห์inocula เตรียมขูดเส้นใยจาก10 วัน วัฒนธรรมเก่า และแขวนไว้ใน PDA เป็นหมันน้ำกลั่น ( shimomoto et al . , 2008 ) ที่เกิดขึ้นสปอร์แขวนลอยถูกกรองผ่านชั้น 2 ของผ้าและจากนั้นปรับ 104 สปอร์มิลลิลิตร ) ที่พืชทดสอบปลูกเชื้อด้วย 5 ช่วงล่างสปอร์มิลลิลิตรต่อพืชโดยการฉีดพ่น รักษาด้วยพืชควบคุมปลอดเชื้อ น้ำกลั่น แปดพืชของแต่ละไอโซเลทถูกใช้สำหรับการสอบ ต่อไปนี้การฉีดวัคซีน ,พืชที่ถูกบ่ม 48 ชั่วโมง ใน 100% สัมพัทธ์ความชื้นที่ 25C แล้วปลูกในเรือนกระจกที่25 ± 5C . อาการโรคในใบพืชสังเกตได้ใน 7 วันหลังจากปลูกเชื้อ แยกพิจารณาเมื่อขยายเชื้อรุนแรงแผลในใบที่พบ และ avirulent เมื่อไม่มีแผล หรือnonexpanding ระบุรอยโรคในใบพืชสังเกต nonexpanding ระบุรอยโรคที่ได้รับการรับรองเป็น การตอบสนองไวเกิน เพราะสังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์พบว่า ไม่มีการได้เชื้อ ) ในใบที่ถูกตัดเป็นส่วนล้างสีด้วย 99% เมทิลแอลกอฮอล์ แล้วเปื้อน0 กู้ 1% ผ้าฝ้ายสีฟ้าดีเอ็นเอ