To identify spots of interest, gel

To identify spots of interest, gel spots were excised and wash with washing solution(25 mM ammonium bicarbonate in 50% vl Gel pieces were dried in the speedvac and treated with 0.2 Hg of trypsin. After complete tryptic digestion, peptides were extracted from gel networks by the addition of extraction(0.1% TFA in 50x acetonitrile) and ultrasonication for 30 min at 30 sc. Supernatant gel pieces were evaporated in the speedvac(Bachofer, Reutingen, Germany) concentrator and analyzed by Nano Lc-Ms/Ms, which was performed on an Agilent 1100 Series nano-LC and LTQ-mass spectrometer(Thermo Electron, San Jose, CA) (Cho et al. 2005) The capillary column used for LC-MSIMS analysis(150 mm x 0.075 mm) was obtained from Proxeon(Odense M. Denmark) and slurry packed in house with Magic C18 stationary phase(5 um, pore size of 100 A: Michrom Bioresources, Auburn, CA). Mobile phase A for the LC separation was 0.1% formic acid in deionized water, while mobile phase B was G.1x formic acid in acetonitrile. The chromatography gradient was set up to give a linear increase from 5% B to 35% B in 50 min, from 403 B to 603 B in 20 min, and from 60% Bto 80% Bin 5 min.The flow rate was maintained at 300 nLmin after splitting. Mass spectra were acquired using data-dependent acquisition with full mass scan(400-1800 mlz) followed by MSMS scans, Each MSHMS scan acquired was an average of 1 microscan on the LTQ, The tempera- ture of the ion transfer tube was controlled at 200 ec, and the spray was 1.5-2.0 kv. The normalized collision energy was set at 352 for MS/MS. Mass tolerances of 1.5 Da and 0.8 Da were used for pre- cursor and fragment ions, respectively. For protein identification, MASCOT ion score of >30 was used as the criterion. Peptides were allowed to be variably oxidized at methionine residues and to be variably carboxyamidomethylated and carboxy methylated at cysteine residues.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เพื่อระบุจุดที่น่าสนใจ เจมีสรรพสามิต และล้างซักโซลูชัน (แอมโมเนียมไบคาร์บอเนต 25 มม. 50% vl ชิ้นเจแห้งในการ speedvac และรักษา ด้วย Hg 0.2 ของทริปซิน หลังจากย่อยอาหาร tryptic สมบูรณ์ เปปไทด์ถูกสกัดจากเครือข่ายเจ โดยสกัด (0.1% TFA ใน 50 x acetonitrile) และระเหยในหัว speedvac (Bachofer, Reutingen เยอรมนี) และวิเคราะห์โดย Nano Lc Ms/Ms ซึ่งดำเนินการบนชุด Agilent 1100 นาโน-LC และมวล LTQ สเปกโตรมิเตอร์ (เทอร์โมอิเล็กตรอน San Jose ultrasonication 30 นาทีที่ 30 ชิ้น Supernatant เจ sc. , CA) (Cho et al. 2005) คอลัมน์ฝอยที่ใช้สำหรับวิเคราะห์ LC MSIMS (150 x 0.075 มม.) ได้รับจาก Proxeon(Odense M. Denmark) และสารละลายบรรจุในบ้าน ด้วยระยะนิ่งมายากล C18 (5 um รูขุมขนขนาด 100 a: Michrom ทรัพยากรชีวภาพ สี CA) เคลื่อนระยะ A สำหรับการแยก LC คือ 0.1% กรดฟอร์มิกในจุน้ำ ในขณะที่โทรศัพท์มือถือระยะ B G.1x กรดฟอร์มิกใน acetonitrile การไล่ระดับสี chromatography ถูกกำหนดขึ้นเพื่อให้การเพิ่มเชิงเส้น จาก 5% B เป็น 35% B 50 นาที จาก 403 B ไป 603 B ใน 20 นาที และ 60% Bto 80% ช่อง 5 นาที อัตราการไหลถูกเก็บรักษาไว้ที่ 300 nLmin หลังจากการแบ่ง มวลสเปกตรัมที่ได้รับมาใช้ซื้อขึ้นอยู่กับข้อมูลที่ มีมวลเต็มแกน (400-1800 mlz) ตาม ด้วยสแกนไบเทคได้ MSHMS แต่ละแกนมาเฉลี่ย 1 microscan ในการ LTQ, ture สีฝุ่นท่อส่งไอออนควบคุมที่ 200 ec และสเปรย์ 1.5-2.0 kv มาตรฐานแรงกระแทกถูกตั้งไว้ที่ 352 สำหรับ MS/นางสาว มวลใช้สำหรับก่อนเคอร์เซอร์และส่วนไอออน ความคลาดเคลื่อนของ 1.5 Da และ 0.8 Da ตามลำดับ สำหรับโปรตีน มิ่งขวัญไอออนคะแนน > 30 ถูกใช้เป็นเกณฑ์ เปปไทด์ได้รับอนุญาต เพื่อจะออกซิไดซ์ที่ตกค้างเมไทโอนีนมีเมฆ และจะมีเมฆ carboxyamidomethylated และคาร์บ๊อกซี่ที่ methylated ที่ตกค้าง cysteine

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เพื่อระบุจุดที่น่าสนใจจุดเจลถูกตัดทิ้งและล้างด้วยสารละลายซักผ้า (25 มิลลิเมตรแอมโมเนียมไบคาร์บอเนตใน 50% VL ชิ้นเจลแห้งใน speedvac และรับการรักษาด้วย 0.2 ปรอทของ trypsin. หลังจากการย่อยอาหาร tryptic สมบูรณ์เปปไทด์สกัดจากเครือข่ายเจล โดยนอกเหนือจากการสกัด (0.1% TFA ใน 50x acetonitrile) และ ultrasonication เวลา 30 นาทีวันที่ 30 เอสซี. ชิ้นเจลใสถูกระเหยใน speedvac (Bachofer, Reutingen, เยอรมนี) หัวและวิเคราะห์โดยนาโน LC-MS / นางสาวซึ่งเป็น ดำเนินการใน Agilent 1100 ซีรี่ส์ Nano-LC และสเปกโตรมิเตอร์ LTQ มวล (เทอร์โมอิเลคตรอน, San Jose, CA) (Cho et al. 2005) คอลัมน์ฝอยใช้ในการวิเคราะห์ LC-MSIMS (150 mm x 0.075 มิลลิเมตร) ที่ได้รับจาก Proxeon (เอ็มโอเดนเซเดนมาร์ก) และสารละลายบรรจุในบ้านที่มีเวทมนตร์ C18 เฟส (5 อืมขนาดรูขุมขน 100 A: Michrom ทรัพยากรชีวภาพ, ออเบิร์นแคลิฟอร์เนีย). เฟสมือถือสำหรับการแยก LC เป็น 0.1% กรดในน้ำปราศจากไอออน, ในขณะที่มือถือเฟส B เป็น G.1x กรดใน acetonitrile. ลาดโครมาถูกจัดตั้งขึ้นเพื่อให้การเพิ่มขึ้นของการเชิงเส้นจาก 5% B 35% B ใน 50 นาทีจาก 403 B ไป 603 B ในอีก 20 นาทีและจาก 60% BTO 80% ถัง 5 อัตราการไหล min.The ถูกเก็บรักษาไว้ที่ 300 nLmin หลังจากที่แยก สเปกตรัมมวลที่ได้มาโดยใช้ข้อมูลที่ได้มาขึ้นอยู่กับมวลด้วยการสแกนเต็มรูปแบบ (400-1800 MLZ) ตามด้วยการสแกน MSMS แต่ละ MSHMS สแกนได้มาเป็นค่าเฉลี่ยของ 1 Microscan บน LTQ ที่อุณหภูมิของหลอดถ่ายโอนไอออนที่ถูกควบคุม 200 EC และสเปรย์เป็น 1.5-2.0 KV พลังงานชนปกติถูกกำหนดไว้ที่ 352 สำหรับ MS / MS ความคลาดเคลื่อนมวลของดา 1.5 และ 0.8 ดาถูกนำมาใช้ก่อนเคอร์เซอร์และชิ้นส่วนอิออนตามลำดับ สำหรับการระบุโปรตีนคะแนนไอออน MASCOT ของ> 30 ถูกใช้เป็นเกณฑ์ เปปไทด์ได้รับอนุญาตให้ออกซิไดซ์ที่แตกตกค้าง methionine และได้รับการ carboxyamidomethylated แตกและ Carboxy methylated ที่ cysteine ​​ตกค้าง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เพื่อระบุจุดที่น่าสนใจจุดถูกตัดและล้างด้วยเจลล้างหน้า โซลูชั่น ( 25 มิลลิเมตร แอมโมเนียมไบคาร์บอเนตใน 50% 6 ชิ้น เจลแห้งในทำให้และรักษาด้วย 0.2 HG ของเอนไซม์ . หลังจากการย่อย อาหารสมบูรณ์ เปปไทด์สกัดจากเครือข่ายเจลโดยนอกเหนือจากการสกัดระดับ 0.1% ใน 50x ไน ) และ ultrasonication สำหรับ 30 นาทีที่ 30 ม. สูงเจลชิ้นถูกระเหยในทำให้ ( bachofer reutingen , Germany ) หัวใช้นาโน LC MS / MS ซึ่งแสดงบน Agilent 1100 ชุดนาโน LC และ ltq แมสสเปกโตรมิเตอร์ ( Thermo Electron , San Jose , CA ) ( โช et al . 2005 ) คอลัมน์ C ใช้ในการวิเคราะห์ lc-msims ( 150 มม. x 0.075 มิลลิเมตร ) ซึ่งได้จาก proxeon ( เดนมาร์ก Odense เมตร ) น้ำที่บรรจุในบ้านด้วยเวทมนตร์ c18 เครื่องเขียนเฟส ( 5 อืม ขนาดรูพรุนของ 100 : michrom ทรัพยากรชีวภาพ , สีน้ำตาล , CA ) เฟสเคลื่อนที่สำหรับ LC แยกเป็น 0.1% กรดในน้ำคล้ายเนื้อเยื่อประสาน ในขณะที่มือถือเฟส B g.1x กรดในไน . โครมาโทกราฟีลาดถูกตั้งค่าให้เพิ่มขึ้นโดยตรงจาก 5 % B 35 % B 50 นาทีจาก 403 B ไป B ใน 20 นาทีและจาก 60% BTO 80% บิน 5 นาที อัตราการไหลไว้ที่ 300 nlmin หลังจากแยก มวลสเปกตรัมที่ได้มาโดยใช้ข้อมูลการสแกนเต็มรูปแบบขึ้นอยู่กับมวล ( 400-1800 mlz ) รองลงมา คือ msms สแกน , สแกนแต่ละ mshms ได้มาเฉลี่ย 1 ไมโครสแกนบน ltq , สีฝุ่น - ture ของการถ่ายโอนไอออนหลอดถูกควบคุมไว้ที่ 200 EC และพ่น 1.5-2.0 กิโล . มาตรฐานการชนพลังงานเท่ากับ 352 สำหรับ MS / นางสาวมวลค่าความคลาดเคลื่อนของ 1.5 ดาและ 0.8 ดานำมาก่อนเคอร์เซอร์และจำเพาะไอออน ตามลำดับ ชนิดโปรตีน สำหรับรายละเอียดของคะแนน > 30 ใช้เป็นเกณฑ์ เปปไทด์ได้อยู่ด้านหน้าออกซิไดซ์ที่ยังมีตกค้างและจะเปลี่ยน carboxyamidomethylated และคาร์บ methylated ที่ซิสเตอีนตกค้าง