Total genomic DNA was extracted usi

Total genomic DNA was extracted using HiPurATM bacterial
and yeast genomic DNA Isolation Kits (Himedia,
India). PCR amplification and sequencing of 16S rRNA
gene was carried out in a 25 l reaction mixture. Using
general primers 27F 5
-AGAGTTTGATCCTGGCTGAG-3 and 1541R 5
-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 with the following
conditions, template DNA denaturation at 94 ◦C for
5 min followed by 30 cycles at 94 ◦C for 1 min, annealing
at 55 ◦C for 1 min, extension at 72 ◦C for 2 min, final
step was carried out at 72 ◦C for 5 min and then 4 ◦C till
infinity using PCR Gene Amp 9700 (Applied Biosystems,
USA). DNA template replaced with sterile water was used
as negative control. The amplified (approx. 1000 bp) 16S
rRNA gene was then purified using QIAquick Gel Extraction
Spin Kit (QIAGEN, Germany). The purified PCR products
were bi-directionally sequenced using both forward and
reverse primers in a sequencer Genetic Analyzer (ABI 3130 Applied Biosystems, USA) with Big Dye (3.1) terminator
protocol. Sequencing was performed using 20 l reaction
mixture containing about 50 ng DNA template (PCR product),
1 pmol of sequencing primer, 3.5 l(5×) big dye buffer
and 1 l big dye. This was carried out by denaturation
step at 96 ◦C for 5 min, followed by 30 cycles at 96 ◦C for
10 s, 55 ◦C for 10 s and final step at 96 ◦C for 5 min. Post
reaction cleanup was carried outto remove unwanted matters
including unincorporated dye terminators by using
125 mM EDTA, 3 M sodium acetate and 70% ethanol and
then air dried at room temperature for 45 min before
keeping at −20 ◦C. 10 l formamide was added and then
Fi denaturation step was carried out at 96 ◦C for 2 min then
immediately kept in ice before loading into the sequencer
plate. Sequencing was performed using Genetic Analyzer
ABI 3130XL (Applied Biosystems, California, USA).

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ดีเอ็นเอทั้งหมดถูกสกัดโดยใช้ HiPurATM แบคทีเรีย
และยีสต์ดีเอ็นเอชุดแยก (HIMEDIA,
อินเดีย) ขยาย PCR และการหาลำดับเบสของ 16S rRNA
ยีนได้ดำเนินการในผสมปฏิกิริยา 25 ลิตร การใช้
ไพรเมอร์ทั่วไป 27F 5?
-AGAGTTTGATCCTGGCTGAG-3? และ 1541R 5?
-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3? มีดังต่อไป
เงื่อนไข denaturation ดีเอ็นเอแม่แบบที่ 94 ◦Cสำหรับ
5 นาทีตามด้วย 30 รอบที่ 94 ◦Cเป็นเวลา 1 นาที, การอบ
ที่อุณหภูมิ 55 ◦Cเป็นเวลา 1 นาทีส่วนขยายที่ 72 ◦Cเป็นเวลา 2 นาทีสุดท้าย
ขั้นตอนที่ได้รับการดำเนินการ ที่ 72 ◦Cเป็นเวลา 5 นาทีแล้ว 4 ◦Cจนถึง
อินฟินิตี้โดยใช้วิธี PCR ของยีนแอมป์ 9700 (Applied Biosystems,
USA) แม่แบบดีเอ็นเอแทนที่ด้วยน้ำหมันถูกนำมาใช้
เป็นตัวควบคุมเชิงลบ ขยาย. (ประมาณ 1,000 bp) 16S
rRNA ยีนบริสุทธิ์แล้วใช้ QIAquick เจลสกัด
ปั่น Kit (QIAGEN, เยอรมนี) ผลิตภัณฑ์ PCR บริสุทธิ์
ถูกสองทิศทางติดใจใช้ทั้งข้างหน้าและ
ย้อนกลับไพรเมอร์ในซีเควนทางพันธุกรรมวิเคราะห์ (ABI 3130 Applied Biosystems, ประเทศสหรัฐอเมริกา) กับบิ๊กย้อม (3.1) เทอร์มิ
โปรโตคอล ลำดับได้รับการดำเนินการโดยใช้ 20 ลิตรปฏิกิริยา
ส่วนผสมที่มีประมาณ 50 ศึกษาดีเอ็นเอแม่แบบ (ผลิตภัณฑ์ PCR)
1 pmol ของไพรลำดับ 3.5 ลิตร (5 ×) กันชนสีย้อมใหญ่
และ 1 ลิตรสีย้อมใหญ่ นี้ได้ดำเนินการโดย denaturation
ขั้นตอนที่ 96 ◦Cเป็นเวลา 5 นาทีตามด้วย 30 รอบที่ 96 ◦Cสำหรับ
10 วินาที, 55 ◦C 10 และขั้นตอนสุดท้ายที่ 96 ◦Cเป็นเวลา 5 นาที โพสต์
การล้างปฏิกิริยาได้ดำเนิน outto ลบเรื่องที่ไม่พึงประสงค์
รวมถึงจุดสิ้นสุดย้อมหน่วยงานโดยใช้
EDTA มิลลิ 125, 3 M โซเดียมอะซิเตทและเอทานอล 70% และ
จากนั้นอากาศแห้งที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 45 นาทีก่อนที่จะ
เก็บรักษาที่อุณหภูมิ -20 ◦C 10 ลิตร Formamide ถูกเพิ่มเข้ามาและจากนั้น
ขั้นตอนที่สูญเสียสภาพธรรมชาติ Fi ได้ดำเนินการที่ 96 ◦Cเป็นเวลา 2 นาทีจากนั้น
เก็บไว้ได้ทันทีในน้ำแข็งก่อนที่จะโหลดลงในซีเควน
แผ่น ลำดับได้รับการดำเนินการโดยใช้การวิเคราะห์ทางพันธุกรรม
ABI 3130XL (Applied Biosystems, แคลิฟอร์เนียสหรัฐอเมริกา)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

รวมจีโนมดีเอ็นเอโดยใช้แบคทีเรียและยีสต์ hipuratm
ดีเอ็นเอแยกอิสระ ( himedia
, อินเดีย ) การขยาย PCR และการหาลำดับเบสของยีน 16S rRNA
ได้ดําเนินการใน 25 ลิตรปฏิกิริยาผสม ที่ใช้โดยทั่วไป 27f 
5
- agagtttgatcctggctgag-3 และ  1541r 5 
-
aaggaggtgatccagccgca-3  กับเงื่อนไขต่อไปนี้ , แม่แบบดีเอ็นเอ ( ที่ 94 ◦ C
5 นาที ตามด้วย 30 รอบเป็นเวลา 1 นาทีที่ 94 ◦ annealing
55 ◦องศาเซลเซียสนาน 1 นาทีที่ 72 ◦ส่วนขยาย C 2 นาที ขั้นตอนสุดท้ายคือการ◦
72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที และ 4 ◦ C จนถึง
Infinity ยีนใช้ PCR ) 9700 ( Applied Biosystems
, สหรัฐอเมริกา ) แม่แบบดีเอ็นเอ แทนที่ด้วยน้ำหมันใช้
ควบคุมลบ ไพร ( ประมาณ 1 , 000 BP (
)rRNA ยีนก็บริสุทธิ์ใช้ qiaquick เจลสกัด
ปั่นชุด ( เพิ่ม , เยอรมัน ) และ PCR ผลิตภัณฑ์
เป็นบี directionally นี้ใช้ทั้งไปข้างหน้าและย้อนกลับลำดับทางพันธุกรรมในดีเอ็นเอ
Analyzer ( ABI 3130 Applied Biosystems , USA ) สีใหญ่ ( 3.1 ) โปรโตคอล Terminator

ลำดับการใช้ 20 ลิตรปฏิกิริยา
ผสมที่ประกอบด้วยประมาณ 50 นาโนดีเอ็นเอแม่แบบ ( ผลิตภัณฑ์ PCR )
,1 pmol ของการรองพื้น , 3.5 ลิตร ( 5 × ) ใหญ่สีเฟอร์
และย้อม 1 ผมใหญ่ นี้ได้ดำเนินการตามขั้นตอนที่ 96 (
◦องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที ตามด้วย 30 รอบ 96 ◦ C
10 , 55 ◦ C 10 และขั้นตอนสุดท้ายที่ 96 ◦องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีล้างปฏิกิริยาโพสต์
ได้ด outto ลบที่ไม่พึงประสงค์ รวมทั้งเรื่อง

125 คนเหล็กย้อมหน่วยงานโดยใช้ อืม EDTA , โซเดียมอะซีเตท 3 M และเอทานอล 70% และ
แล้วอากาศแห้งที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 45 นาทีก่อน
รักษา 20 −◦ C 10 ลิตร Formamide เพิ่มแล้ว
fi ( ขั้นตอนดำเนินการที่ 96 ◦ C 2 นาทีแล้ว
ทันทีเก็บไว้ในน้ำแข็งก่อนที่จะโหลดเป็นลำดับ
จาน ลำดับการใช้พันธุกรรมวิเคราะห์
ABI 3130xl ( Applied Biosystems , California , USA ) .