2.6. Cell differentiation in vitroA

2.6. Cell differentiation in vitro
After culturing hADSCs in each scaffold, the total amount
of sulfated-glycosaminoglycan (s-GAG) was quantitatively determined
by modified 1,9-dimethylmethylene blue (DMMB) dye
method using shark chondroitin sulfate C as a standard. The samples
were first digested with papain for 48 h at 60 ◦C in buffer
solution (pH 6.8) composed of 0.1 M NaH2PO4, 5 mM Na2EDTA, and
5 mM cysteine hydrochloride. The dye solution was prepared by
dissolving 16 mg of DMMB in 1000 ml of DW containing glycine
(3.04 g), NaCl (2.37 g) and 0.1 M HCl (95 ml). An aliquot (40 l) of
each sample digested with papain was transferred to a 96-well
plate and 200 l of DMB reagent was added to each sample. After
mixing by pipetting, the absorbance was measured at 525 nm on a
microplate reader

For reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)
assay of related mRNA, total RNA was extracted from the cultured
hADSCs using TRIzol reagent (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA)
according to the manufacturer’s instructions. RNA pellets were dissolved
in 30 l of RNase free water, and total RNA content and
purity were determined spectrophotometrically at a wavelength
of 260 nm using a NanoDrop spectrophotometer (ND-1000, Nanodrop
Technologies, Wilmington, DE, USA). Strands of cDNA were
synthesized using Maxime RT PreMix Kit (Intron Biotechnology,
Seongnam, Korea) with 1 g of total RNA. Expression levels of
the following genes were examined: aggrecan (ACAN) and collagen
type II (COL2A1). Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as a housekeeping gene. The primers used in this
study are shown in Table 1. PCR reactions were conducted under
following conditions: 5 min at 94 ◦C, 35 cycles of 30 s at 95 ◦C, 30 s
at 60 ◦C, and 1 min at 72 ◦C, and 10 min of final extension at 72 ◦C.
PCR products were loaded into 1.5% of agarose gel for electrophoresis
and they were stained with GelRed

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.6 ความแตกต่างของเซลล์ในหลอดทดลองหลังจากเลี้ยง hADSCs นั่งร้านในแต่ละจำนวนของซัลเฟต-glycosaminoglycan (s-GAG) ได้กำหนดปริมาณโดยการปรับเปลี่ยน1,9-dimethylmethylene สีฟ้า (DMMB) สีย้อมวิธีการใช้C chondroitin ซัลเฟตฉลามเป็นมาตรฐาน กลุ่มตัวอย่างที่ถูกย่อยครั้งแรกกับปาเปนเวลา 48 ชั่วโมงที่ 60 ◦Cในบัฟเฟอร์การแก้ปัญหา(pH 6.8) ประกอบด้วย 0.1 M NaH2PO4 5 มิลลิ Na2EDTA และ5 มิลลิไฮโดรคลอไร cysteine วิธีการแก้ปัญหาสีย้อมที่ได้รับการจัดทำขึ้นโดยการละลาย 16 มิลลิกรัม DMMB 1000 มล. ของใบสำคัญแสดงสิทธิอนุพันธ์ที่มีไกลซีน (3.04 กรัม) โซเดียมคลอไรด์ (2.37 กรัม) และ 0.1 M HCl (95 มล.) หาร (40 ลิตร) ของแต่ละตัวอย่างย่อยด้วยปาเปนถูกย้ายไป 96 หลุมจานและ200? ลิตรน้ำยา DMB ถูกบันทึกอยู่ในแต่ละตัวอย่าง หลังจากผสมโดยปิเปต, การดูดกลืนแสงที่ถูกวัดที่ 525 นาโนเมตรบนอ่านmicroplate สำหรับถอดความโพลิเมอร์ปฏิกิริยาลูกโซ่ย้อนกลับ (RT-PCR) ทดสอบของ mRNA ที่เกี่ยวข้องรวม RNA ถูกสกัดจากเพาะเลี้ยงhADSCs ใช้น้ำยา Trizol (Invitrogen คอร์ป, คาร์ลส , CA, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต อาร์เอ็นเอเม็ดละลายใน 30 ลิตร RNase น้ำฟรีและเนื้อหา RNA รวมและความบริสุทธิ์ได้รับการพิจารณาspectrophotometrically ที่ความยาวคลื่น260 นาโนเมตรโดยใช้ spectrophotometer NanoDrop (ที่ ND-1000 Nanodrop Technologies, Wilmington, DE, สหรัฐอเมริกา) เส้นของยีนที่ถูกสังเคราะห์โดยใช้ Maxime RT พรีมิกซ์ Kit (Intron เทคโนโลยีชีวภาพซองเกาหลี) โดย 1 กรัมของอาร์เอ็นเอรวม ระดับการแสดงออกของยีนดังต่อไปนี้มีการตรวจสอบ: aggrecan (ACAN) และคอลลาเจนชนิดที่สอง(COL2A1) dehydrogenase glyceraldehyde-3-ฟอสเฟต (GAPDH) ถูกใช้เป็นยีนดูแลทำความสะอาด ไพรเมอร์ที่ใช้ในการนี้การศึกษาได้แสดงไว้ในตารางที่ 1 ปฏิกิริยา PCR ได้ดำเนินการภายใต้เงื่อนไขดังต่อไปนี้: 5 นาทีที่ 94 ◦C 35 รอบของ 30 วินาทีที่ 95 ◦C, 30 วินาทีที่60 ◦Cและ 1 นาทีที่ 72 ◦ C และ 10 นาทีสุดท้ายของการขยายที่ 72 ◦C. ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกโหลดลง 1.5% ของเจล agarose สำหรับข่าวคราวและพวกเขาก็ย้อมด้วยสีGelRed

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.6 การเปลี่ยนสภาพของเซลล์ในหลอดทดลอง
หลังจากเพาะเลี้ยง hadscs ในแต่ละห้างยอดรวม
ของซัลเฟตโชว์มียัวร์เลิฟ ( s-gag ) คือปริมาณกำหนด
โดยดัดแปลง 1,9-dimethylmethylene สีฟ้า ( dmmb ) วิธีการย้อม
ใช้ฉลาม chondroitin ซัลเฟต C เป็นมาตรฐาน ตัวอย่าง
ถูกย่อยด้วยเอนไซม์ปาเปน 48 H ที่ 60 ◦ C ในสารละลายบัฟเฟอร์
( pH 6.8 ) ประกอบด้วย nah2po4 na2edta 0.1 M , 5 มม.
ไฮโดรคลอไรด์และกรดอะมิโน 5 มิล สารละลายสีย้อมถูกเตรียมโดยละลาย
16 มิลลิกรัม ใน 1 , 000 มิลลิลิตร dmmb DW ประกอบด้วย Glycine
( 3.04 กรัม ) , เกลือ ( 2.37 กรัม ) และ 0.1 M HCl ( 95 ml ) เป็นส่วนลงตัว ( 40  L )
แต่ละตัวอย่างย่อยด้วยเอนไซม์ปาเปน ถูกโอนไปยังจานและ 96 ดี
 200 ลิตร DMB ใช้ถูกเพิ่มเข้าไปในแต่ละตัวอย่าง หลังจาก
ผสมโดย pipetting , ค่าวัดที่ 525 นาโนเมตรบน
พื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทยอ่าน

สำหรับปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสแบบย้อนกลับ ( RT-PCR )
) ที่เกี่ยวข้องกับยีน อาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกสกัดจากเลี้ยง
hadscs ใช้ trizol Reagent ( Invitrogen คอร์ป , Carlsbad , CA , USA )
ตามคำแนะนำของผู้ผลิต อาร์เอ็นเอ เม็ดละลายในน้ำ 30 ลิตร
 เลสฟรีและเนื้อหาทั้งหมดและ
.ความบริสุทธิ์เป็นนี้ที่ความยาวคลื่น 260 nm ใช้
nanodrop Spectrophotometer ( nd-1000 nanodrop
, เทคโนโลยี , Wilmington , DE , USA ) เส้นดีเอ็นเอสังเคราะห์โดยใช้ชุดรวมเป็น
RT แม็กซิม ( iNtRON เทคโนโลยีชีวภาพ
Seongnam , เกาหลีใต้ ) กับ 1  กรัมของ RNA ทั้งหมด ระดับการแสดงออกของยีนและศึกษา
ต่อไปนี้ : aggrecan ( acan ) และคอลลาเจนชนิดที่ 2 (
col2a1 )glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ( gapdh ) ถูกใช้เป็นแม่บ้านของยีน ไพรเมอร์ที่ใช้ในการศึกษา
จะแสดงในตารางที่ 1 ปฏิกิริยา PCR ได้ดำเนินการภายใต้เงื่อนไขต่อไปนี้ :
5 นาทีที่ 94 ◦ C 35 รอบ 30 s 95 ◦ C 30 S
ที่ 60 ◦ C และ 1 นาทีที่ 72 ◦ C , และ 10 นาทีของการสุดท้ายที่ 72 ◦ C .
) ผลิตภัณฑ์ที่ถูกโหลดลง 1.5 % ของเจลสำหรับ อิเล็กโตรโฟรีซิส
และพวกเขาก็ถูกย้อมด้วย gelred