1. IntroductionAffinity chromatogra

1. Introduction
Affinity chromatography is the science of separation of biomolecules based on their specific interactions to solid phase-coupled ligands. Because of its ability to enrich selective targets, affinity chromatography has remained a mainstay technique in separation chemistry [1] and [2]. Early approaches of protein isolation and purification has used affinity-partition as the last step in downstream processing. However, recent strategies have shifted this paradigm towards affinity chromatography as a single-step platform for molecular separation and detection [3] and [4]. Antibody and other proteinous affinity reagents have shown great potential in affinity separation of biomolecules that needs high level of purity. Antibody-based affinity chromatography or immunoaffinity chromatography preliminarily consists of an antibody-immobilized solid support over which target molecule is retained and purified in a selective manner using specific and strong binding of antibody to its target. However, the requirement of a pure and highly active antibody has remained an issue in preparation of immunoaffinity matrix. The presence of host contaminants as well the denaturation susceptibility of antibody preparation of an immunoaffinity chromatography can lead to non-selective or reduced target enrichment. Though antibodies can be purified to higher grades, most of them are prone to denaturation upon their ambient or prolonged storage. Moreover, the requirement of live hosts for antibody production has made them a costly reagent. Batch-to-batch production variability is another shortcoming of using antibodies in separation chemistry. Some non-proteinous ligands such as ions, enzyme substrates and other organic and inorganic molecules have proved to be affordable substitutes to antibody-based affinity reagents to enrich and purify broader range of targets. Nevertheless, they are less specific than antibodies compromising the purity of the end product. Therefore, it is necessary to develop affinity reagent that overcomes the limitations of conventional affinity reagent without compromising its target specificity and purity of the product.

Aptamers, a category of synthetic oligonucleotides that have target recognition and binding properties similar to that of antibodies, have emerged as chemical antibodies, a promising alternate to biologically-produced conventional antibodies [5]. Due to their high affinity and specificity, aptamers have gained an increasing utility in analytical, biosensing, diagnostic and therapeutic applications [6], [7] and [8]. In analytical applications aptamers are used as affinity ligand or labelled probe to isolate, purify or analyse the aptamer–protein complexes [9], [10], [11], [12], [13] and [14]. Recently, we have reported an aptamer that targets Concanavalin A with an affinity of ∼172 nmole L−1[15]. The developed Con A aptamer (Con A aptabody) is highly specific and can differentiate Con A from other lectins. Owing to such high affinity and specificity, herein, we have used the Con A aptabody to develop an aptamer-based method for separation and purification of Con A. As the conventional procedures of Con A purification are cumbersome, time consuming and often yield less due to involvement of multiple purification steps; development of an aptamer-affinity chromatography would provide a proficient method of Con A isolation and purification [16] and [17].

Therefore, the prime objective of this study is to develop an efficient, robust and scalable aptamer-based methodology that can work as a stand-alone platform to isolate and purify Con A with concomitant reduction in purification time, labour and cost. The developed aptamer-affinity chromatography of the present study consists of a Con A aptabody functionalized solid phase that selectively retains and purify Con A. Preparation of aptamer-functionalized affinity matrix, elution standardization, scale-up and robustness of the method are discussed. The method is validated by performing affinity purification of Con A from jack bean (Canavalia ensiformis) seeds.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

1. บทนำAffinity chromatography is the science of separation of biomolecules based on their specific interactions to solid phase-coupled ligands. Because of its ability to enrich selective targets, affinity chromatography has remained a mainstay technique in separation chemistry [1] and [2]. Early approaches of protein isolation and purification has used affinity-partition as the last step in downstream processing. However, recent strategies have shifted this paradigm towards affinity chromatography as a single-step platform for molecular separation and detection [3] and [4]. Antibody and other proteinous affinity reagents have shown great potential in affinity separation of biomolecules that needs high level of purity. Antibody-based affinity chromatography or immunoaffinity chromatography preliminarily consists of an antibody-immobilized solid support over which target molecule is retained and purified in a selective manner using specific and strong binding of antibody to its target. However, the requirement of a pure and highly active antibody has remained an issue in preparation of immunoaffinity matrix. The presence of host contaminants as well the denaturation susceptibility of antibody preparation of an immunoaffinity chromatography can lead to non-selective or reduced target enrichment. Though antibodies can be purified to higher grades, most of them are prone to denaturation upon their ambient or prolonged storage. Moreover, the requirement of live hosts for antibody production has made them a costly reagent. Batch-to-batch production variability is another shortcoming of using antibodies in separation chemistry. Some non-proteinous ligands such as ions, enzyme substrates and other organic and inorganic molecules have proved to be affordable substitutes to antibody-based affinity reagents to enrich and purify broader range of targets. Nevertheless, they are less specific than antibodies compromising the purity of the end product. Therefore, it is necessary to develop affinity reagent that overcomes the limitations of conventional affinity reagent without compromising its target specificity and purity of the product.Aptamers, a category of synthetic oligonucleotides that have target recognition and binding properties similar to that of antibodies, have emerged as chemical antibodies, a promising alternate to biologically-produced conventional antibodies [5]. Due to their high affinity and specificity, aptamers have gained an increasing utility in analytical, biosensing, diagnostic and therapeutic applications [6], [7] and [8]. In analytical applications aptamers are used as affinity ligand or labelled probe to isolate, purify or analyse the aptamer–protein complexes [9], [10], [11], [12], [13] and [14]. Recently, we have reported an aptamer that targets Concanavalin A with an affinity of ∼172 nmole L−1[15]. The developed Con A aptamer (Con A aptabody) is highly specific and can differentiate Con A from other lectins. Owing to such high affinity and specificity, herein, we have used the Con A aptabody to develop an aptamer-based method for separation and purification of Con A. As the conventional procedures of Con A purification are cumbersome, time consuming and often yield less due to involvement of multiple purification steps; development of an aptamer-affinity chromatography would provide a proficient method of Con A isolation and purification [16] and [17].Therefore, the prime objective of this study is to develop an efficient, robust and scalable aptamer-based methodology that can work as a stand-alone platform to isolate and purify Con A with concomitant reduction in purification time, labour and cost. The developed aptamer-affinity chromatography of the present study consists of a Con A aptabody functionalized solid phase that selectively retains and purify Con A. Preparation of aptamer-functionalized affinity matrix, elution standardization, scale-up and robustness of the method are discussed. The method is validated by performing affinity purification of Con A from jack bean (Canavalia ensiformis) seeds.

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

1 . บทนำ
ขี้รังแคเป็นวิทยาศาสตร์ของการแยกสารชีวโมเลกุลขึ้นอยู่กับปฏิสัมพันธ์ที่เฉพาะเจาะจงของพวกเขาแข็งระยะคู่ลิแกนด์ . เพราะความสามารถในการเพิ่มเป้าหมายการเลือก , ขี้รังแค ยังคงเป็นแกนนำเทคนิคเคมี [ แยก 1 ] และ [ 2 ]ก่อนวิธีการแยกโปรตีนและการใช้พาร์ทิชันโดยใช้เป็นขั้นตอนสุดท้ายในกระบวนการปลายน้ำ อย่างไรก็ตาม กลยุทธ์ ล่าสุดได้เปลี่ยนกระบวนทัศน์นี้ต่อขี้รังแคเป็นแพลตฟอร์มสำหรับการแยกโมเลกุลและการตรวจสอบในขั้นตอนเดียว [ 3 ] และ [ 4 ]แอนติบอดี และสารเคมีอื่น ๆสามารถ proteinous ได้แสดงศักยภาพที่ดีในการแยกทางของชีวโมเลกุลที่ความต้องการระดับของความบริสุทธิ์แอนติบอดีจากขี้รังแค หรือ immunoaffinity Chromatography เบื้องต้นประกอบด้วยแอนติบอดีต่อการสนับสนุนที่แข็งแกร่งซึ่งโมเลกุลเป้าหมายยังคงอยู่และทำให้บริสุทธิ์ในการลักษณะการใช้ที่เฉพาะเจาะจงและแข็งแรงมีผลผูกพันต่อเป้าหมายของตน อย่างไรก็ตาม ความต้องการของบริสุทธิ์สูงปราดเปรียวแอนติบอดี และยังคงมีปัญหาในการเตรียม immunoaffinity เมทริกซ์การปรากฏตัวของสารปนเปื้อนเจ้าภาพรวมทั้งกลุ่มของแอนติบอดี ( การเตรียมการของ immunoaffinity chromatography สามารถนำไปสู่การลดเป้าหมายการแสวงหาหรือ . แม้ว่าแอนติบอดีสามารถแยกเกรดที่สูงขึ้น ส่วนใหญ่ของพวกเขา มักจะ ปกติ ( เมื่อเก็บรักษาเป็นเวลานานของพวกเขา นอกจากนี้ความต้องการของโฮสต์อยู่เพื่อผลิตแอนติบอดีที่ได้ทำให้พวกเขาสารเคมีราคาแพง ชุดของการผลิตชุดเป็นอีกจุดอ่อนของการใช้แอนติบอดีในเคมีแยก บางองค์กร เช่น proteinous ลิแกนด์ไอออนเอนไซม์สารอาหารและโมเลกุลอินทรีย์และอนินทรีอื่น ๆได้พิสูจน์แล้วว่าเป็น ราคาไม่แพงแทนแอนติบอดีจากสารเคมีเพื่อเพิ่มความสามารถให้ช่วงกว้างของเป้าหมาย อย่างไรก็ตาม พวกเขาจะเฉพาะเจาะจงน้อยกว่าแอนติบอดีสูญเสียความบริสุทธิ์ของผลิตภัณฑ์สุดท้าย ดังนั้นมันเป็นสิ่งจำเป็นที่จะพัฒนาความสัมพันธ์ที่เอาชนะข้อ จำกัด ของสารเคมีที่ใช้ทางปกติโดยไม่สูญเสียเป้าหมายเฉพาะเจาะจงและความบริสุทธิ์ของผลิตภัณฑ์ .

แอปตาเมอร์ หมวดของโอลิโกนิวคลีโอไทด์สังเคราะห์ที่มีการยอมรับเป้าหมายและคุณสมบัติในการจับกันของแอนติบอดีได้กลายเป็นสารแอนติบอดีสัญญาอื่นเพื่อผลิตแอนติบอดีชีวภาพแบบ [ 5 ] เนื่องจากตะบอยและความจำเพาะของแอปตาเมอร์ได้รับการเพิ่มอรรถประโยชน์ในการวิเคราะห์ biosensing วินิจฉัย และการรักษา [ 6 ] [ 7 ] และ [ 8 ] ในงานวิเคราะห์แอปตาเมอร์ใช้เป็นพี่น้องกัน ) หรือป้ายโพรบแยก ฟอก หรือวิเคราะห์ aptamer –โปรตีนเชิงซ้อน [ 9 ][ 10 ] [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ] และ [ 14 ] เมื่อเร็ว ๆนี้เราได้รายงาน aptamer ที่เป้าหมายถูกกับความสัมพันธ์ของ∼ 172 ที่มี L − 1 [ 15 ] พัฒนา aptamer โกง ( โกง aptabody ) เป็นเฉพาะเจาะจงอย่างมากและสามารถแยกคอน จากเหล็ก อื่น ๆ เนื่องจากกลุ่มดังกล่าวมีความจำเพาะสูง ในที่นี้เราได้ใช้โกง aptabody พัฒนา aptamer ตามวิธีการแยกและการทำให้บริสุทธิ์ con A เป็นขั้นตอนปกติของ con ฟอกจะยุ่งยาก , เสียเวลาและมักจะน้อยกว่าผลผลิตเนื่องจากมีส่วนร่วมของขั้นตอนการฟอกหลาย ;