Figures 3, 4, 5 and 6 show schemati

Figures 3, 4, 5 and 6 show schematic maps of plasmid
pSacB_delta_/dhA, pSacB_delta_pf/D, pSacB_delta_pfiA, and pSacB_delta_pckA,
respectively. The plasmid pSacB_alaD (SEQ ID NO:14) was constructed containing the 5'-
5 and 3'- flanking regions of the pflD gene of Basfia succiniciproducens which bordered the
alaD gene of Geobacillus stearothermophilus XL65-6. The alaD gene was ordered from
DNA2.0. The plasmid pSacB_alaD can be used for introducing alaD gene in the pflD gene
locus of Basfia succiniciproducens. Figure 2 depicts a schematic map of plasmid
pSacB_alaD (SEQ ID NO:14).
10
In the plasmid sequence of pSacB (SEQ ID NO:13) the sacB-gene is contained from bases 2380-3801. The sacB-promotor is contained from bases 3802-4264. The chloramphenicol gene is contained from base 526-984. The origin of replication for E. coil (ori EC) is contained from base 1477-2337 (see fig. 1).
15
In the plasmid sequence of pSacB_alaD (SEQ ID NO: 14) the 5' flanking region of the pflD gene, which is homologous to the genome of Basfia succiniciproducens, is contained from bases 4-1574, while the 3' flanking region of the pflD gene, which is homologous to the
genome of Basfia succiniciproducens, is contained from bases 2694-4194. The alaD gene 20 is contained from bases 1575 - 2693. The sacB gene is contained from bases 6466-7887.
The sacB โปรโมเตอร์ is contained from bases 7888-8350. The chloramphenicol gene is
contained from base 4612-5070. The origin of replication for E. coil (ori EC) is contained
from base 5563-6423 (cf. Fig. 2).

25 In the plasmid sequence of pSacB_delta_/dhA (SEQ ID NO: 15) the 5' flanking region of the
/dhA-gene, which is homologous to the genome of Basfia succiniciproducens, is contained from bases 1519-2850, while the 3' flanking region of the /dhA-gene, which is homologous to the genome of Basfia succiniciproducens, is contained from bases 62-1518. The sacB-
gene is contained from bases 5169-6590. The sacB-โปรโมเตอร์ is contained from bases 30 6591-7053. The chloramphenicol gene is contained from base 3315-3773. The origin of
replication for E. coll(ori EC) is contained from base 4266-5126 (see fig. 3).

In the plasmid sequence of pSacB_delta_pfID (SEQ ID NO:16) the 5' flanking region of the
pflD gene, which is homologous to the genome of Basfia succiniciproducens, is contained 35 from bases 1533-2955, while the 3' flanking region of the pflD gene, which is homologous to
the genome of Basfia succiniciproducens, is contained from bases 62-1532. The sacB gene
is contained from bases 5256-6677. The sacB โปรโมเตอร์ is contained from bases 6678-
7140. The chloramphenicol gene is contained from base 3402-3860. The origin of
replication for E. coli(on EC) is contained from base 4353-5213 (see fig. 4).
40
In the plasmid sequence of pSacB_delta_pf/A (SEQ ID NO:17) the 5' flanking region of the pf/A-gene, which is homologous to the genome of Basfia succiniciproducens, is contained
from bases 1506-3005, while the 3' flanking region of the pflA-gene, which is homologous to the genome of Basfia succiniciproducens, is contained from bases 6-1505. The sacB-gene is contained from bases 5278-6699. The sacB-โปรโมเตอร์ is contained from bases 6700-
7162. The chioramphenicol gene is contained from base 3424-3882. The origin of 5 replication for E. coli(ori EC) is contained from base 4375-5235 (see fig. 5).

In the plasmid sequence of pSacB_delta_pckA (SEQ ID NO:18) the 5' flanking region of the pckA gene, which is homologous to the genome of Basfia succiniciproducens, is contained from bases 5281-6780, while the 3' flanking region of the pckA gene, which is homologous
10 to the genome of Basfia succiniciproducens, is contained from bases 3766-5265. The sacB
gene is contained from bases 1855-3276. The sacB โปรโมเตอร์ is contained from bases
3277-3739. The chioramphenicol gene is contained from base 1-459. The origin of
replication for E. coil (ori EC) is contained from base 952-1812 (see fig. 6).

15 Example 3: Generation of improved succinate alanine strains

a) Basfia succiniciproducens DD1 was transformed as described above with the
pSacB_delta_/dhA and "Campbelled in" to yield a "Campbell in" strain. Transformation and integration into the genome of Basfia succiniciproducens was confirmed by PCR
20 yielding bands for the integrational event of the plasmid into the genome of Basfia
succiniciproducens.
The "Campbell in" strain was then "Campbelled out" using agar plates containing ซูโครส as a counter selection medium, selecting for the loss (of function) of the sacB gene. Therefore, the "Campbell in" strains were incubated in 25-35 ml of non selective
25 medium (BHI containing no antibiotic) at 37°C, 220 rpm over night. The overnight
culture was then streaked onto freshly prepared BHI containing ซูโครส plates (10%,
no antibiotics) and incubated overnight at 37°C ("first ซูโครส transfer"). Single colony
obtained from first transfer were again streaked onto freshly prepared BH

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ตัวเลข 3, 4, 5 และ 6 แสดงแผนที่แผนผังวงจรของ plasmidpSacB_delta_/ดี เอชเอ pSacB_delta_pf/D, pSacB_delta_pfiA และ pSacB_delta_pckAตามลำดับ PSacB_alaD plasmid (ลำดับ ID ไม่: 14) ถูกสร้างขึ้นประกอบด้วยแบบ 5'-5 และ 3-flanking ภูมิภาคของยีน pflD ของ succiniciproducens Basfia ที่ล้อมรอบตัว ยีน alaD ของ Geobacillus stearothermophilus XL65-6 สั่งจากยีน alaD DNA2.0. plasmid pSacB_alaD ใช้สำหรับแนะนำยีน alaD ในยีน pflD โลกัสโพล Basfia succiniciproducens รูปที่ 2 มีภาพแผนที่แผนผังวงจรของ plasmid pSacB_alaD (ลำดับ ID ไม่: 14)10ลำดับ plasmid ของ pSacB (ลำดับ ID ไม่: 13) ประกอบด้วยยีน sacB จากฐาน 2380-3801 SacB-promotor อยู่จากฐาน 3802-4264 ประกอบด้วยยีน chloramphenicol จากฐาน 526-984 จุดเริ่มต้นของการจำลองแบบสำหรับ E. ขด (ori EC) อยู่จากฐาน 1477-2337 (ดู fig. 1)15ในลำดับ plasmid ของ pSacB_alaD (ลำดับ ID ไม่: 14) 5' ของยีน pflD ซึ่งเป็น homologous กับกลุ่มของ Basfia succiniciproducens, flanking อยู่จากฐาน 4-1574 ในขณะ 3' flanking ภูมิภาคของยีน pflD ซึ่งเป็น homologous เพื่อกลุ่มของ Basfia succiniciproducens มีอยู่จากฐาน 2694-4194 ยีน alaD 20 อยู่จากฐาน 1575-2693 ประกอบด้วยยีน sacB จากฐาน 6466-7887 SacB โปรโมเตอร์อยู่จากฐาน 7888-8350 มียีน chloramphenicol อยู่จากฐาน 4612-5070 ประกอบด้วยจุดเริ่มต้นของการจำลองแบบสำหรับ E. ขด (ori EC) จากฐาน 5563-6423 (cf. Fig. 2)25 ในลำดับ plasmid ของ pSacB_delta_/ดี เอชเอ (ลำดับ ID ไม่: 15) 5' flanking ภูมิภาค/dhA-gene ซึ่งเป็น homologous กับกลุ่มของ Basfia succiniciproducens มีอยู่จากฐาน 1519-โม ในขณะ 3' flanking ภูมิภาคของ /dhA-gene ซึ่งเป็น homologous กับกลุ่มของ Basfia succiniciproducens อยู่จากฐาน 62-1518 SacB-ยีนมีอยู่จากฐาน 5169-6590 SacB-โปรโมเตอร์อยู่จากฐาน 30 6591-7053 ประกอบด้วยยีน chloramphenicol จากฐาน 3315-3773 ต้นกำเนิดของจำลองสำหรับ E. coll (ori EC) อยู่จากฐาน 4266-5126 (ดู fig. 3)ในลำดับ plasmid ของ pSacB_delta_pfID (ลำดับ ID ไม่: 16) 5' flanking ภูมิภาค ยีน pflD ซึ่งเป็น homologous กับกลุ่มของ Basfia succiniciproducens มี 35 อยู่จากฐาน 1533-2955 ในขณะ 3' flanking ภูมิภาคของยีน pflD ซึ่งเป็น homologous เพื่อ กลุ่มของ Basfia succiniciproducens มีอยู่จากฐาน 62-1532 ยีน sacB ตั้งอยู่จากฐาน 5256-6677 SacB โปรโมเตอร์อยู่จากฐาน 6678- 7140.ยีน chloramphenicol มีอยู่จากฐาน 3402-3860 ต้นกำเนิดของ จำลองสำหรับ E. coli (ใน EC) อยู่จากฐาน 4353-5213 (ดู fig. 4) 40ในลำดับที่ plasmid ของ pSacB_delta_pf/A (ลำดับ ID ไม่: 17) 5' flanking ภูมิภาค pf/A-ยีน ซึ่งเป็น homologous กับกลุ่มของ Basfia succiniciproducens อยู่จากฐานปี 1506-3005 ในขณะ 3' flanking ภูมิภาคของการ pflA-ยีน ซึ่งเป็น homologous กับกลุ่มของ Basfia succiniciproducens อยู่จากฐาน 6 เลนา ประกอบด้วยยีน sacB จากฐาน 5278-6699 SacB-โปรโมเตอร์อยู่จากฐาน 6700-7162 ยีน chioramphenicol.อยู่จากฐาน 3424-3882 จุดเริ่มต้นของการจำลองแบบที่ 5 สำหรับ E. coli (ori EC) อยู่จากฐาน 4375-5235 (ดู fig. 5)ใน plasmid ที่ ประกอบด้วยลำดับของ pSacB_delta_pckA (ลำดับ ID ไม่: 18) 5' ของยีน pckA ซึ่งเป็น homologous กับกลุ่มของ Basfia succiniciproducens, flanking จากฐาน 5281-6780 ในขณะ 3' flanking ภูมิภาคของยีน pckA ซึ่งเป็น homologous10 การจีโนมของ Basfia succiniciproducens มีอยู่จากฐาน 3766-5265 SacBยีนมีอยู่จากฐาน 1855-3276 SacB โปรโมเตอร์อยู่จากฐาน3277-3739 การประกอบด้วยยีน chioramphenicol จากฐาน 1-459 ต้นกำเนิดของจำลองสำหรับ E. ขด (ori EC) อยู่จากฐาน 952-1812 (ดู fig. 6)ตัวอย่างที่ 15 3: รุ่น succinate ปรับปรุงสายพันธุ์อะลานีน) Basfia succiniciproducens DD1 ถูกแปลงตามที่อธิบายไว้ข้างต้นด้วยการpSacB_delta_/ดี เอชเอและ "Campbelled ใน" ต้องใช้ "Campbell ใน" ให้ การเปลี่ยนแปลงและรวมเป็นกลุ่ม Basfia succiniciproducens ได้รับการยืนยัน โดย PCR20 ผลผลิตวงสำหรับเหตุการณ์ integrational ของ plasmid ที่เป็นกลุ่มของ Basfiasucciniciproducensพันธุ์ "Campbell ใน" ถูกแล้ว "Campbelled ออก" โดยใช้แผ่น agar ที่ประกอบด้วยซูโครสเป็นเคาน์เตอร์เลือกสื่อ การเลือกสำหรับการสูญเสีย (ฟังก์ชัน) ของยีน sacB ดังนั้น สายพันธุ์ "Campbell ใน" ถูก incubated ใน 25-35 ml ของไม่เลือกกลาง 25 (BHI ที่ประกอบด้วยยาปฏิชีวนะไม่) ที่ 37° C, 220 รอบต่อนาทีข้ามคืน แอร์พอร์ตโอเวอร์ไนท์วัฒนธรรมแล้วมีลายบน BHI ลิ้มประกอบด้วยซูโครสแผ่น (10%ยาปฏิชีวนะไม่) และ incubated ที่ 37 ° C ค้างคืน ("แรกซูโครสโอน") โคโลนีเดี่ยวรับจากแรก โอนได้อีกลายลง BH ลิ้ม