Materials and methodsCollection, id

Materials and methods
Collection, identification, and culture of symbiotic bacteria of
entomopathogenic nematodes
Symbiotic bacteria were isolated from entomopathogenic Heterorhabditis
spp. nematodes collected from soil from various regions in
Korea. Isolated bacteria were streaked onto NBTA medium agar
supplemented with 0.025% (wt./vol.) bromothymol blue and 0.004%
(wt./vol.) triphenyl tetrazolium chloride. Broth cultures were grown
from a single primary phase colony in 5YS medium (5% yeast extract,
0.5% NaCl, 0.05% K2HPO4, 0.05% NH4H2PO4, 0.02% MgSO4.7H2O) on a
shaker (180 rpm) at 28 °C.
Isolated symbiotic bacteria were identified by nucleotide sequence
analysis of 16S ribosomal DNA (rDNA). The universal primer set used
was a forward 27F (5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′) and a
reverse 1492R (5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′). Polymerase chain
reactions (PCR) were performed with genomic DNA as a template in a
total volume of 50 μl containing 10 mMTris–HCl (pH 8.3), 50 mMKCl,
2 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 0.2 pmol of each primer, and Taq DNA
polymerase (Takara, Japan). PCR products were sequenced by a DNA
sequencing company (SolGent, Korea) and nucleotide similarity was
searched using the BLASTN program in NCBI. The nucleotide
sequences were aligned using ClustalW2 in EBI (www.ebi.ac.uk/
Tools/clustalw2). Five Photorhabdus strains were identified and
named J3, J4, J5, J6, and J7 (Table 1). A colony of P. luminescens ssp.
laumondii TT01 (KACC 12283) was procured from the Korean
Agricultural Culture Collection (KACC) and was used as a control. A
colony of Escherichia coli DH5a (Stratagene, La Jolla, CA, USA) was
used as another control.
Insects
The colonies of P. interpunctella and G. mellonella were kept at
27±2 °C, 70%±5% relative humidity, and a 16 h light and 8 h dark
(16L:8D) photoperiodic cycle. Larvae were reared in a plastic box
(15×15×10 cm3) with an artificial diet consisting of wheat bran,
pollen, honey, glycerin, and water (1:1:0.3:0.3:0.15, wt./vol.) (Aye
et al., 2004). Larvae of C. pipiens pallens and L. caesar were
collected at Kyungpook National University campus (Daegu, Korea).

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการ
เก็บบัตรประจำตัวและวัฒนธรรมของแบคทีเรียชีวภาพของ
ไส้เดือนฝอยแมลง
ชีวภาพแบคทีเรียที่แยกได้จากแมลง Heterorhabditis
เอสพีพี ไส้เดือนฝอยที่เก็บได้จากดินจากภูมิภาคต่าง ๆ ใน
เกาหลี เชื้อแบคทีเรียที่แยกได้ลายบน NBTA วุ้นกลาง
เสริมด้วย 0.025% (โดยน้ำหนัก. / ฉบับ.) bromothymol สีฟ้าและ 0.004%
(โดยน้ำหนัก. / ฉบับ.) triphenyl tetrazolium คลอไรด์ วัฒนธรรมน้ำซุปได้เติบโต
จากการเป็นอาณานิคมเดียวขั้นตอนหลักใน 5YS ปานกลาง (สารสกัดจากยีสต์ 5%
0.5% โซเดียมคลอไรด์ 0.05% K2HPO4, 0.05% NH4H2PO4 0.02% MgSO4.7H2O) ใน
เครื่องปั่น (180 รอบต่อนาที) วันที่ 28 ° C
แยก ชีวภาพแบคทีเรียโดยระบุว่าลำดับนิวคลีโอ
วิเคราะห์ 16S โซมอลดีเอ็นเอ (rDNA) ชุดไพรเมอร์สากลที่ใช้
เป็นไปข้างหน้า 27F (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3 ') และ
1492R ย้อนกลับ (5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3 ') ลูกโซ่โพลิเมอร์
ปฏิกิริยา (PCR) ได้รับการดำเนินการกับดีเอ็นเอเป็นแม่แบบใน
ปริมาณรวมของ 50 ไมโครลิตรที่มี 10 mMTris-HCl (pH 8.3), 50 mMKCl,
2 มิลลิ MgCl2, 0.2 มิลลิ dNTPs 0.2 pmol ของแต่ละประถมศึกษาและ Taq ดีเอ็นเอ
โพลิเมอร์ (Takara, ญี่ปุ่น) ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์มีลำดับขั้นตอนโดยดีเอ็นเอ
บริษัท ลำดับ (SolGent เกาหลี) และเบสที่คล้ายคลึงกันได้รับการ
ค้นหาโดยใช้โปรแกรม BLASTN ใน NCBI เบื่อหน่าย
ลำดับถูกจัดชิดโดยใช้ ClustalW2 ใน EBI (www.ebi.ac.uk/
เครื่องมือ / clustalw2) ห้าสายพันธุ์ Photorhabdus ถูกระบุและ
ชื่อ J3, J4, J5, J6 และ J7 (ตารางที่ 1) อาณานิคมของพีเอสเอส luminescens
laumondii TT01 (KACC 12283) ได้รับการจัดหาจากเกาหลี
การเกษตรวัฒนธรรมสะสม (KACC) และถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุม
อาณานิคมของ Escherichia coli DH5a (Stratagene, La Jolla, CA, USA) ได้รับการ
ใช้เป็นตัวควบคุมอื่นที่
แมลง
อาณานิคมของพี interpunctella และ G. mellonella ถูกเก็บไว้ที่
27 ± 2 ° C, 70% ± 5% ความชื้นสัมพัทธ์ และแสง 16 ชั่วโมงและ 8 ชั่วโมงมืด
(16L: 8) วงจร photoperiodic ตัวอ่อนได้รับการเลี้ยงดูในกล่องพลาสติก
(15 × 15 × 10 cm3) กับอาหารเทียมซึ่งประกอบด้วยรำข้าวสาลี,
เกสร, น้ำผึ้ง, กลีเซอรีนและน้ำ (1: 1: 0.3: 0.3:.. 0.15, น้ำหนัก / ปริมาตร) ( Aye
et al., 2004) ตัวอ่อนของ C. pipiens pallens ลิตรและซีซาร์ถูก
เก็บที่มหาวิทยาลัยมหาวิทยาลัยแห่งชาติ Kyungpook (Daegu, Korea)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการ
คอลเลกชัน รหัส และวัฒนธรรมของชนิดของแมลงที่ตาย

แบคทีเรียไส้เดือนฝอยชนิดแบคทีเรียที่แยกได้จากแมลงที่ตาย heterorhabditis
spp . ไส้เดือนฝอย ที่รวบรวมได้จากดินจากภูมิภาคต่างๆใน
เกาหลี แยกแบคทีเรียลายลงบน nbta ขนาดกลางวุ้น
อาหาร 0.025% ( น้ำหนัก / ปริมาตร ) อิฐทนไฟ และ 0.004 %
( น้ำหนัก / ฉบับtetrazolium ) ไตรฟีนิลคลอไรด์ ซุปวัฒนธรรมปลูก
จากอาณานิคมเฟสหลักเดียวใน 5ys ขนาดกลาง ( 5% ยีสต์สกัด
0.5% NaCl 0.05 % k2hpo4 0.05 % NH4H2PO4 0.02 % mgso4.7h2o ) บน
กระปุก ( 180 rpm ) ที่ 28 องศา แยกชนิด
แบคทีเรียถูกระบุโดยการวิเคราะห์ลำดับนิวคลีโอไทด์ของ 16S ไรโบโซมอลดีเอ็นเอ
( ด้วย ) ไพรเมอร์ใช้
สากลชุดเป็น 27f ไปข้างหน้า ( 5 ’ - aga gtt TGA TCC tgg CTC ag-3 School ) และ
กลับ 1492r ( 5 ’ - ไม่แทคซีทีที gtt ACG ทำ t-3 School ) ปฏิกิริยาลูกโซ่ ( PCR )
ปฏิกิริยาได้กับ genomic DNA เป็นแม่แบบใน
ปริมาณ 50 μลิตร บรรจุ 10 mmtris – HCl ( pH 8.3 ) , 50 mmkcl
ชุด , 2 มม. , 0.2 มม. dntps 0.2 pmol ของแต่ละสี และดีเอ็นเอพอลิเมอเรส
แทค ( Takara , ญี่ปุ่น ) ผลิตภัณฑ์ PCR เป็นลำดับเบสดีเอ็นเอ
โดยการจัดลำดับบริษัท ( solgent เกาหลี ) และลำดับเบสความเหมือนคือ
ค้นหาโดยใช้โปรแกรม blastn ใน ncbi . การใช้ลำดับนิวคลีโอไทด์
ชิด clustalw2 ในกุ้ง ( www.ebi . ac.uk /
/ เครื่องมือ clustalw2 ) 5 photorhabdus สายพันธุ์ พบชื่อ J3
j4 j6 ที่สุด , , , , และ j7 ( ตารางที่ 1 ) อาณานิคมของหน้า luminescens ssp .
laumondii tt01 ( kacc 12283 ) คือ procured จากเกาหลี
วัฒนธรรมการเกษตรที่รวบรวม ( kacc ) และถูกใช้เป็นตัวควบคุม เป็นโคโลนีของเชื้อ Escherichia coli dh5a
( stratagene , La Jolla , CA , USA ) ถูกใช้เป็นตัวควบคุมอีก
.
แมลง
อาณานิคมของหน้า interpunctella G mellonella ไว้ที่ 27 ±
2 / c 70 % ± 5 % ความชื้น และ 16 H และ H (
8 แสงมืด 16L : 8D ) รอบ photoperiodic . ตัวอ่อนถูกเลี้ยงดูใน
กล่องพลาสติก( 15 × 15 × 10 cm3 ) ด้วยอาหารเทียม ประกอบด้วย รำข้าวสาลี
เกสร น้ำผึ้ง กลีเซอรีนและน้ำ ( 1:1:0.3:0.3: 0.15 โดยน้ำหนัก / ปริมาตร ) ( ใช่
et al . , 2004 ) ตัวอ่อนของ pipiens pallens และ ซีซาร์ถูกเก็บในวิทยาเขตของมหาวิทยาลัยแห่งชาติ kyungpook

( แทกู , เกาหลีใต้ )