European Journal of Soil BiologyEva

European Journal of Soil Biology
Evaluating T-RFLP protocols to sensitively analyze the genetic diversity
and community changes of soil alkane degrading bacteria
Methods
2.1. Evaluation of restriction enzymes for alkB T-RFLP
The BLAST database was searched for either complete or partial
alkB gene sequences with Pseudomonas putida P1 alkB (AJ233397)
and Rhodococcus sp. Q15 alkB1 (AF388182) sequences as references
using the blastn Basic Search Alignment Tool [22]. Results were
counterchecked with the blastx protein database search [23] to
account for nucleotide sequences related to the alkane monooxygenase.
Suitable sequences were aligned with BioEdit [24] using
the ClustalW alignment tool [25]. Only sequences having the
binding sites for the experimentally applied alkB primers (see
section PCR-amplification) were included for further restriction
enzyme selection. The retrieved alignment included 83 sequences
and was manually checked and uploaded to the online program
Restriction Enzyme Picker (REPK) Online v.1.2 [26]. The alignment
was checked for restriction sites of the restriction enzymes giving
highest REPK scores and for the correctness of the proposed fragment
length using the NEB cutter V2.0 online search tool [27]. The
enzymes were ranked as proposed by Engebretson and Moyer [28]
according to (i) the number of total terminal restriction fragments
(i.e. richness of T-RFs) with the constraints that the fragment length
ranged between 50 and 550 bp and a minimum discriminating
length difference of at least three basepairs to account for the
resolution power of the capillary electrophoresis, (ii) the percentage
of sequences with no restriction site for the respective enzyme
as well as (iii) the percentage of sequences with T-RFs < 50 bp.Selected enzymes were finally tested on alkB gene amplicons of
whole community soil DNA extracts from the microcosms (see
microcosms experiment), using different enzyme- (0.1, 1 and 2 U)
and DNA concentrations (50e100 ng for environmental samples).
2.4. DNA extraction and PCR amplification
Whole community DNA from soil samples was extracted as
described by Griffith et al. [30]. DNA of enrichment cultures was
extracted as described by Maher et al. [31] and modified as
described by Giebler et al. [3]. DNA quality and quantity were
determined by agarose gel electrophoresis and spectrophotometrically
(Nanodrop® ND-1000, Peqlab, Germany). The extracts of
individual replicates were pooled prior to community analysis to
take into account the natural variability of the soil cores and
overcoming heterogeneity effects. Alkane monooxygenase (alkB)
genes were amplified in PCR reactions comprising 15e20 ng of
DNA, 1x Taq PCR Master Mix Kit (Qiagen, Hilden, Germany), 0.12%
BSA and 0.1 mM alkB primers [32] with modifications as described
by Schulz et al. [33] (forward primer alkB 1f_deg 50-AAY ACI GCI
CAY GAR CTI GGI CAY AA-30, reverse primer alkB 1r_deg 50-GCR TGR
TGR TCI GAR TGI CGY TG-30). They covered a broad alkB sequence
diversity and were already applied in three former alkB T-RFLP
protocols [10e12]. PCR was carried out in 25 ml (95
C/10 min, 30
cycles: 95
C/45 s, 58.7
C/1 min, 72
C/45 s and final elongation at
72
C/10 min).
16S rRNA genes were amplified using the primers 27f [50-AGA
GTT TGA TCM TGG CTC AG-30 [34]] and 1525r [50-AAG GAG GTG
WTC CAR CC-30 [35]]. PCR mixtures comprised 1x Taq PCR Master
Mix Kit (Qiagen), 0.01 mM primer and 10 ng DNA in a total reaction
volume of 25 ml (94
C/4 min, 30 cycles: 94
C/45 s, 58
C/
30 s, 72
C/1 min, followed by a final elongation: 72
C/10 min).
All PCR were run on a Tetrad 2 thermocycler (BioRad Laboratories,
Munich, Germany). Amplification products were checked
for correct amplicon size (550 bp for alkB gene, 1500 bp for 16S
rRNA gene) with agarose gel electrophoresis, purified with
Wizard® SV Gel and PCR Clean-UP System (Promega, Mannheim,
Germany) and quantified spectrophotometrically (Nanodrop®
ND-1000).
2.5. T-RFLP analyses
Forward primers were labeled with the fluorescence dye 6-
carboxyfluorescein (6-FAM) for PCR amplification prior to T-RFLP
analysis. One hundred ng purified PCR product was digested over
night at 37
C with 2 U HpyCH4V (New England BioLabs, Beverly,
MA, USA) for alkB amplicons or MspI (New England BioLabs) for
16S rRNA gene amplicons. After ethanol precipitation, T-RFLP
analysis was run on an ABI PRISM 3100 genetic analyzer system
using the GeneScan™ 500 ROX™ size standard (both Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA). Capillary injection time was set
at 15 s or 8 s when peak intensities showed off-scale values. Data
were analyzed with GeneMapper V3.7 software (Applied
Biosystems).
T-RFLP analysis of bacterial communities in soils revealed that
alkB gene pools were more sensitive to alkane input than 16S rRNA
gene pools. In our test system, we refrained from examining soil
communities pre-exposed to high amounts of hydrocarbons or
subjected to strong selection pressure for alkane degraders as
would have been the case in contaminated soils [10]. Whereas it
appears straightforward that the functional guild of alkane degraders
responded stronger to alkanes than the entire community,
the overall diversity of alkB genes in soil environments without preexposure
to substantial amounts of alkanes is somewhat surprising.
Depth-related differences in alkB gene T-RF dynamics probably
reflected lower alkane provision in deeper bulk soil, which was
independent of the soil type. The identical mean T-RF richness of
the two soil depths (interface 31 ± 2; bulk soil 32 ± 3) indicated that
different community compositions were responsible for the depth
differentiation. The similarity of alkB communities in the interface
samples regardless of the soil type and an observed correlation
with the litter type suggests a distinct litter influence on alkane
degraders in the underlying soil. Powell et al. [11] likewise observed
on a much greater spatial scale (1 km site distance; 5e100 cm
depth) a combined influence of soil depth and alkane provision (i.e.
total petroleum hydrocarbon content) on the community structure
and composition irrespective of the sampling site. Our findings
therefore suggest that phenomena observed on a large scale with
enormous gradients of environmental factors can equally apply to
smaller scales as analyzed by our microcosm subsampling where
high structural soil heterogeneity might create steep microgradients.
16S rRNA gene-based community profiles reflected the distinct
alkane influence to a minor extent than alkB patterns. Less pronounced
changes could have been expected as alkanes pose only a
minor fraction of the total litter biomass. Thus, the significant
correlation of overall community patterns to alkane provision was
surprising. A somewhat lower resolution power of 16S rRNA gene TRFLP
than functional gene profiling has been observed also in other
studies. Avrahami et al. [41] consistently found that the nirK gene
mirrors shifts in the denitrifying community not observed with 16S
rRNA gene T-RFLP. The gene paralogy of alkB might help to intensify
changes in the guild of alkane degraders, thus, permitting the
detection of relatively small changes within the overall community.
Therefore, targeting functional genes can be advised for following
specific soil ecosystem functions, as 16S rRNA gene T-RFLP might
not allow the discrimination of closely related but physiologically
distinct organisms [8]. Furthermore, single 16S rRNA gene T-RFs
may belong to organisms from different taxa, thus obscuring
changes in the community composition [42]. Likewise, Powell and
colleagues [11] identified influences on the functional community
not reflected by overall bacterial community patterns and
concluded that dominant community members might not carry the
respective catabolic genes.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สมุดรายวันยุโรปของชีววิทยาดินโพรโทคอ T RFLP ประเมิน sensitively วิเคราะห์ความหลากหลายทางพันธุกรรมและการเปลี่ยนแปลงชุมชนของอัลเคนดินลดแบคทีเรียวิธีการ2.1. การประเมินผลของเอนไซม์จำกัดสำหรับ alkB T-RFLPฐานข้อมูลระเบิดถูกค้นหาทั้งหมด หรือบางส่วนลำดับยีน alkB กับ alkB ลี putida P1 (AJ233397)และ sp. Rhodococcus Q15 alkB1 (AF388182) ลำดับเป็นข้อมูลอ้างอิงใช้ blastn พื้นฐานค้นหาตำแหน่งเครื่องมือ [22] ผลลัพธ์ที่ได้counterchecked กับการ blastx โปรตีนฐานข้อมูลค้นหา [23]บัญชีลำดับนิวคลีโอไทด์ที่เกี่ยวข้องกับ monooxygenase อัลเคนลำดับที่เหมาะสมสอดคล้องกับ BioEdit [24] โดยใช้ClustalW ตำแหน่งเครื่องมือ [25] เฉพาะ ลำดับที่มีการผูกสำหรับไพรเมอร์ alkB experimentally ใช้ (ดูส่วนขยาย PCR) ถูกรวมอยู่ในข้อจำกัดเพิ่มเติมการเลือกเอนไซม์ ดึงข้อมูลตำแหน่งรวม 83 ลำดับได้ด้วยตนเองการตรวจสอบ และอัปโหลดไปยังโปรแกรมออนไลน์เอนไซม์จำกัดตัวเลือก (REPK) ออนไลน์ v.1.2 [26] การจัดตำแหน่งตรวจสอบข้อจำกัดการท่องเที่ยวของเอนไซม์จำกัดให้สูงสุด REPK คะแนนและ ความถูกต้องของส่วนนำเสนอความยาวโดยใช้เครื่องมือค้นหาออนไลน์ V2.0 ของตัด NEB [27] ที่เอนไซม์ถูกจัดอันดับเป็นที่เสนอ โดย Engebretson และ Moyer [28]ตามการกระจายตัว (i) จำนวนรวมเทอร์มินัลจำกัด(เช่นร่ำรวย T RFs) ด้วยข้อจำกัดที่ความยาวของส่วนอยู่ในช่วงระหว่าง 50 และ 550 bp และการเหยียดพวกผิวต่ำความแตกต่างความยาวของ basepairs น้อยสามการพลังงานความละเอียดของเส้นเลือดฝอย electrophoresis, (ii) เปอร์เซ็นต์ลำดับกับไซต์ไม่จำกัดสำหรับเอนไซม์เกี่ยวข้องและ (iii) เปอร์เซ็นต์ของลำดับกับ T-RFs < 50 bpสุดท้ายทดสอบเลือกเอนไซม์บน alkB amplicons ยีนของชุมชนดินดีเอ็นเอแยกจาก microcosms (ดูmicrocosms ทดลอง), ใช้แตกต่างกันเอนไซม์- (0.1, 1 และ 2 U)และความเข้มข้นของดีเอ็นเอ (50e100 ng ตัวอย่างสิ่งแวดล้อม)2.4. ดีเอ็นเอแยกและขยาย PCRชุมชนทั้งหมดดีเอ็นเอจากตัวอย่างดินที่ถูกแยกเป็นอธิบายโดยมหานคร Griffith et al. [30] มีดีเอ็นเอของวัฒนธรรมโดดเด่นแยกตามที่อธิบายไว้โดยมาฮิรร้อยเอ็ด al. [31] และปรับเปลี่ยนเป็นอธิบายโดย Giebler et al. [3] ดีเอ็นเอตรวจสอบคุณภาพและปริมาณกำหนด โดย agarose เจ electrophoresis และ spectrophotometrically(Nanodrop ® ND-1000, Peqlab เยอรมนี) บางส่วนของสามารถจำลองแต่ละถูกทางถูกพูก่อนวิเคราะห์ชุมชนเพื่อคำนึงถึงความแปรผันธรรมชาติของแกนดิน และขจัดหมดสิ้นลักษณะพิเศษ heterogeneity Monooxygenase อัลเคน (alkB)ยีนที่ถูกขยายในปฏิกิริยา PCR ประกอบด้วย 15e20 ng ของดีเอ็นเอ PCR x Taq 1 หลักผสมชุด (Qiagen, Hilden เยอรมนี), 0.12%บีเอสเอและ 0.1 มม. alkB ไพรเมอร์ [32] ด้วยการปรับเปลี่ยนดังที่โดย Schulz et al. [33] (ส่งต่อพื้น alkB 1f_deg 50-AAY GCI อะCAY CAY gar คู CTI GGI AA-30 พื้นกลับ alkB 1r_deg 50 GCR TGRTGR TCI TGI GAR คู CGY TG-30) จะครอบคลุมกว้าง alkB ลำดับความหลากหลาย และถูกนำไปใช้แล้วในสามอดีต alkB T-RFLPโพรโทคอล [10e12] PCR ถูกดำเนินการใน 25 ml (95 C/10 min, 30รอบ: C/45 s, 58.7 C/1 นาที 72 C 95/45 s และ elongation ขั้นสุดท้ายที่10 นาที 72 C)ยีน 16S rRNA ถูกขยายโดยใช้ไพรเมอร์ที่ 27f [ตู้ 50GTT TGA TCM TGG CTC AG-30 [34]] และ 1525r [50-เอเอจีปิดปาก GTGWTC รถ CC-30 [35]] น้ำยาผสม PCR ประกอบด้วย 1 x หลัก PCR Taqผสมชุด (Qiagen), 0.01 mM พื้นและดีเอ็นเอ ng 10 ในปฏิกิริยารวมปริมาตร 25 ml (94 C/4 min, 30 รอบ: 94 C/45 s, 58 C /30 s, 72 C/1 นาที ตาม ด้วย elongation ครั้งสุดท้าย: 10 นาที 72 C)PCR ทั้งหมดถูกเรียกใช้บน thermocycler Tetrad 2 (BioRad ปฏิบัติมิวนิค เยอรมัน) ขยายผลิตภัณฑ์ได้ถูกตรวจสอบการแก้ไขขนาด amplicon (550 bp สำหรับยีน alkB, bp 1500 สำหรับ 16Sยีนใน rRNA) ด้วย agarose เจ electrophoresis บริสุทธิ์ที่มี®ช่วยเอสเจและ PCR ล้างระบบ (Promega มาเยอรมนี) และ quantified spectrophotometrically (Nanodrop ®ND-1000)2.5. T-RFLP วิเคราะห์ไพรเมอร์ไปข้างหน้ามีป้าย ด้วยสี fluorescence 6-carboxyfluorescein (6-FAM) สำหรับขยาย PCR ก่อน T-RFLPวิเคราะห์ ผลิตภัณฑ์ PCR ng บริสุทธิ์ร้อยถูกต้องมากกว่าคืนที่ 37 C 2 U HpyCH4V (BioLabs นิวอิงแลนด์ เบเวอร์ลี่MA, USA) alkB amplicons หรือ MspI (นิวอิงแลนด์ BioLabs) สำหรับ16S rRNA ยีน amplicons หลังจากเอทานอลฝน T-RFLPวิเคราะห์ถูกเรียกใช้บนระบบการวิเคราะห์ทางพันธุกรรม ABI ปริซึม 3100ใช้มาตรฐานขนาด GeneScan ™ 500 ROX ™ (ทั้งประยุกต์Biosystems ฟอสเตอร์ City, CA, USA) ตั้งเวลาฉีดเส้นเลือดฝอยที่ 15 s หรือ 8 s เมื่อปลดปล่อยก๊าซสูงสุดแสดงให้เห็นว่าค่าออกขนาดนั้น ข้อมูลได้วิเคราะห์ ด้วยซอฟต์แวร์ GeneMapper V3.7 (ประยุกต์Biosystems)การวิเคราะห์ T-RFLP ของชุมชนจากแบคทีเรียในดินเนื้อปูนเปิดเผยที่กลุ่มยีน alkB อ่อนไหวมากกับอัลเคนเข้ากว่า 16S rRNAยีนสระ ระบบทดสอบของเรา เรา refrained จากการตรวจสอบดินชุมชนก่อนเปิดเผยจำนวนเงินที่สูงของสารไฮโดรคาร์บอน หรือภายใต้ตัวเลือกแรงดันสำหรับ degraders อัลเคนเป็นจะได้รับในดินเนื้อปูนปนเปื้อน [10] ในขณะนั้นปรากฏตรงที่สมาคมการทำงานของอัลเคน degradersตอบแรงกว่า การ alkanes ชุมชนทั้งหมดโดยรวมความหลากหลายของยีน alkB ในสภาพแวดล้อมดินโดย preexposureพบยอดเงินของ alkanes ได้ค่อนข้างน่าแปลกใจความลึกที่เกี่ยวข้องกับผลต่างใน dynamics ยีน T-RF alkB คงอัลเคนส่วนสำรองที่ต่ำลึกจำนวนมากดิน ซึ่งสะท้อนให้เห็นขึ้นอยู่กับชนิดของดิน ความเหมือนกันหมายความว่า T-RF ร่ำรวยระบุความลึกดินสอง (ติดต่อ 31 ± 2 ±ดิน 32 จำนวนมาก 3) ที่ชุมชนต่าง ๆ จนได้รับผิดชอบสำหรับความลึกสร้างความแตกต่าง ชุมชน alkB อินเทอร์เฟซคล้ายคลึงตัวอย่างโดยไม่คำนึงถึงชนิดของดินและความสัมพันธ์ของการสังเกตมีแคร่ชนิดแนะนำแคร่มามีอิทธิพลในอัลเคนdegraders ในดินต้น พาวเวล et al. [11] ในทำนองเดียวกัน สังเกตในระดับพื้นที่มากขึ้นมาก (ระยะทาง 1 km เว็บไซต์ 5e100 ซม.ลึก) อิทธิพลรวมของดินความลึกและอัลเคนเงินสำรองพิเศษรวมเนื้อหาปิโตรเลียมไฮโดรคาร์บอน) ในโครงสร้างชุมชนและองค์ประกอบไม่ว่าไซต์สุ่มตัวอย่าง ผลการวิจัยของเราดังนั้น แนะนำให้ สังเกตปรากฏการณ์บนพื้นที่ขนาดใหญ่ด้วยเท่าเทียมกันสามารถใช้ไล่ระดับสีขนาดมหึมาของปัจจัยสิ่งแวดล้อมเครื่องชั่งน้ำหนักขนาดเล็กเป็นวิเคราะห์ โดยพิภพในของเราที่ subsamplingโครงสร้างดินสูง heterogeneity อาจสร้างชัน microgradientsชุมชนใช้ยีน 16S rRNA ส่วนกำหนดค่าผลแตกต่างกันอัลเคนที่มีผลต่อขอบเขตเล็กกว่ารูปแบบ alkB ไม่ออกเสียงเปลี่ยนแปลงอาจมีการคาดว่าเป็น alkanes เข้ารองเศษชีวมวลรวมแคร่ ดังนั้น สำคัญความสัมพันธ์ของรูปแบบชุมชนโดยรวมถึงบทบัญญัติของอัลเคนมีน่าแปลกใจ กำลังความละเอียดค่อนข้างต่ำของยีน 16S rRNA TRFLPกว่ายีนทำงาน สร้างโพรไฟล์ได้ถูกสังเกตยังในที่อื่น ๆการศึกษา Avrahami et al. [41] อย่างต่อเนื่องพบว่ายีน nirKกระจกเลื่อนในชุมชน denitrifying ไม่สังเกต ด้วย 16SrRNA ยีน T RFLP Paralogy ยีนของ alkB อาจช่วยให้กระชับเปลี่ยนแปลงในกิลด์ของอัลเคน degraders ดังนั้น ที่เอื้ออำนวยการการตรวจค่อนข้างเปลี่ยนแปลงเล็ก ๆ ภายในชุมชนโดยรวมดังนั้น กำหนดเป้าหมายการทำงานของยีนสามารถจะแนะนำให้ดังต่อไปนี้ระบบนิเวศดินเฉพาะหน้าที่ เป็นยีน 16S rRNA T RFLP อาจไม่อนุญาตให้มีการเลือกปฏิบัติของที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดแต่ physiologicallyหมดชีวิต [8] นอกจากนี้ เดี่ยวยีน 16S rRNA T RFsอาจเป็นสิ่งมีชีวิตจาก taxa ที่แตกต่าง obscuring ดังนั้นการเปลี่ยนแปลงในองค์ประกอบชุมชน [42] พาวเวลทำนองเดียวกัน และเพื่อนร่วมงาน [11] ระบุอิทธิพลทำงานชุมชนไม่สะท้อนรูปแบบชุมชนโดยรวมแบคทีเรีย และสรุปว่า สมาชิกชุมชนหลักอาจไม่ดำเนินการยีน catabolic ที่เกี่ยวข้อง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วารสารยุโรปชีววิทยาดิน
ประเมินโปรโตคอล T-RFLP เพื่อละม่อมวิเคราะห์ความหลากหลายทางพันธุกรรม
และการเปลี่ยนแปลงชุมชนของดินเคนย่อยสลายแบคทีเรีย
วิธี
2.1 การประเมินผลของเอนไซม์ข้อ จำกัด สำหรับ alkB T-RFLP
ฐานข้อมูล BLAST ถูกค้นสำหรับทั้งสมบูรณ์หรือบางส่วน
alkB ลำดับยีนกับ Pseudomonas putida P1 alkB (AJ233397)
และ Rhodococcus SP Q15 alkB1 (AF388182) ลำดับเป็นข้อมูลอ้างอิง
โดยใช้ไทด์พื้นฐานการจัดเครื่องมือค้นหา [22] ผลลัพธ์ที่ได้
counterchecked ด้วยการค้นหาฐานข้อมูลโปรตีน blastx [23] เพื่อ
บัญชีสำหรับลำดับเบสที่เกี่ยวข้องกับเคน monooxygenase.
ลำดับที่เหมาะสมถูกสอดคล้องกับ BioEdit [24] โดยใช้
เครื่องมือการจัดตำแหน่ง ClustalW [25] เฉพาะลำดับมี
เว็บไซต์ที่มีผลผูกพันสำหรับไพร alkB ทดลองใช้ (ดู
ส่วน PCR-ขยาย) ถูกรวมสำหรับข้อ จำกัด ต่อ
การเลือกเอนไซม์ การจัดตำแหน่งที่ดึงมารวม 83 ลำดับ
และได้รับการตรวจสอบด้วยตนเองและอัปโหลดไปยังโปรแกรมออนไลน์
จำกัด เอนไซม์ Picker (REPK) v.1.2 ออนไลน์ [26] การจัดตำแหน่งที่
ได้รับการตรวจสอบเว็บไซต์ที่ข้อ จำกัด ของเอนไซม์ข้อ จำกัด การให้
คะแนนสูงสุด REPK และความถูกต้องของชิ้นส่วนที่นำเสนอ
ระยะเวลาในการใช้เครื่องตัด NEB V2.0 เครื่องมือค้นหาออนไลน์ [27]
เอนไซม์ที่ได้รับการจัดอันดับให้เป็นที่เสนอโดย Engebretson และ Moyer [28]
ตาม (ก) จำนวนของชิ้นส่วนข้อ จำกัด รวมขั้ว
(เช่นความมีชีวิตชีวาของ T-RFs) ที่มีข้อ จำกัด ที่มีความยาวส่วน
อยู่ระหว่าง 50 และ 550 bp และแบ่งแยกขั้นต่ำ
ความแตกต่างที่มีความยาวไม่น้อยกว่าสามเบสบัญชีสำหรับ
พลังงานความละเอียดของอิเล็กฝอย (ii) อัตราร้อยละ
ของลำดับกับเว็บไซต์ไม่มีข้อ จำกัด สำหรับการทำงานของเอนไซม์ที่เกี่ยวข้อง
เช่นเดียวกับ (iii) อัตราร้อยละของลำดับกับ T-RFs <50 bp เอนไซม์ .Selected ถูกทดสอบในที่สุด alkB amplicons ยีนของ
ชุมชนของสารสกัดดีเอ็นเอจากดินทั้งจุลภาค (ดู
นิเวศน์จำลองการทดลอง) โดยใช้ enzyme- แตกต่างกัน (0.1, 1 และ 2 U)
และความเข้มข้นของดีเอ็นเอ (50e100 ng สำหรับตัวอย่างสิ่งแวดล้อม).
2.4 สกัดดีเอ็นเอและขยาย PCR
ดีเอ็นเอชุมชนทั้งจากตัวอย่างดินที่ถูกสกัดเป็น
อธิบายโดยริฟฟิ ธ และคณะ [30] ดีเอ็นเอของวัฒนธรรมที่เพิ่มคุณค่าถูก
สกัดตามที่อธิบายไว้โดยเฮอร์และคณะ [31] และแก้ไขตามที่
อธิบายไว้โดย Giebler และคณะ [3] ที่มีคุณภาพและปริมาณดีเอ็นเอถูก
กำหนดโดยข่าวคราว agarose และ spectrophotometrically
(Nanodrop® ND-1000, Peqlab, เยอรมนี) สารสกัดจาก
ซ้ำแต่ละคนมารวมกลุ่มกันก่อนที่จะมีการวิเคราะห์ชุมชนเพื่อ
คำนึงถึงความแปรปรวนของธรรมชาติของแกนดินและ
การเอาชนะผลกระทบแตกต่าง อัลเคน monooxygenase (alkB)
ยีนที่ถูกขยายในปฏิกิริยา PCR ประกอบ 15e20 ศึกษาของ
ดีเอ็นเอ 1x Taq PCR Master Mix Kit (Qiagen, ฮิลเดน, เยอรมนี), 0.12%
BSA และ 0.1 มิลลิไพร alkB [32] มีการปรับเปลี่ยนตามที่อธิบายไว้
โดยชัลส์และคณะ . [33] (ไปข้างหน้าไพร alkB 1f_deg 50 AAY ACI GCI
CAY GAR CTI GGI CAY AA-30, reverse ไพร alkB 1r_deg 50 GCR TGR
TGR TCI GAR TGI CGY TG-30) พวกเขาครอบคลุมลำดับ alkB กว้าง
หลากหลายและถูกนำไปใช้แล้วในสามอดีต alkB T-RFLP
โปรโตคอล [10e12] PCR ได้ดำเนินการใน 25 มล. (95 C / 10 นาที, 30?
รอบ?? 95 C / 45 วินาที, 58.7 C / 1 นาที, 72 C / 45 และการยืดตัวสุดท้ายที่
72 C / 10 นาที)
ยีน 16S rRNA ถูกขยายโดยใช้ไพรเมอร์ที่ 27 [50 AGA
GTT TGA TCM TGG CTC AG-30 [34]] และ 1525r [50 AAG GAG GTG
WTC CAR CC-30 [35]] ผสม PCR ประกอบด้วย 1x Taq PCR โท
ผสม Kit (Qiagen) 0.01 มิลลิไพรเมอร์และ 10 ng ดีเอ็นเอในปฏิกิริยารวม
ปริมาณ 25 มล. (94 C / 4 นาที, 30 รอบ:??? 94 C / 45 วินาที, 58 C /
30 วินาที, 72 C / 1 นาทีตามด้วยการยืดตัวสุดท้าย?. 72 C / 10 นาที)
ทั้งหมดพีซีอาร์ถูกเรียกใช้บน Tetrad 2 เครื่อง thermocycler (BioRad ห้องปฏิบัติการ,
มิวนิค, เยอรมนี) ผลิตภัณฑ์ที่ถูกตรวจสอบการขยาย
ขนาด amplicon ที่ถูกต้อง (550 bp ยีน alkB, 1500 bp สำหรับ 16S
rRNA ยีน) กับเจลอิเล็ก agarose บริสุทธิ์กับ
Wizard®เอเจลและ PCR สะอาดขึ้นระบบ (Promega, Mannheim,
เยอรมนี) และวัด spectrophotometrically ( Nanodrop®
ND-1000).
2.5 T-RFLP วิเคราะห์
ไพรไปข้างหน้ามีป้ายด้วยสีย้อมเรืองแสง 6
carboxyfluorescein (6-FAM) สำหรับการขยาย PCR ก่อนที่จะ T-RFLP
วิเคราะห์ หนึ่งร้อย ng บริสุทธิ์ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกย่อยในช่วง
คืนที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสมี 2 U HpyCH4V (นิวอิงแลนด์ BioLabs เบเวอร์ลี่,
MA, USA) สำหรับ amplicons alkB หรือ MspI (นิวอิงแลนด์ BioLabs) สำหรับ
16S rRNA ยีน amplicons หลังจากที่ฝนเอทานอล T-RFLP
วิเคราะห์ถูกรันบนระบบวิเคราะห์ทางพันธุกรรม ABI PRISM 3100
โดยใช้ Genescan ™ 500 ROX ™ขนาดมาตรฐาน (ทั้ง Applied
Biosystems, ฟอสเตอร์ซิตี้, CA, USA) เวลาฉีดฝอยถูกกำหนด
ที่ 15 วินาทีหรือ 8 เมื่อความเข้มสูงสุดมีค่าปิดระดับ ข้อมูล
ที่ได้มาวิเคราะห์ด้วยซอฟต์แวร์ GeneMapper V3.7 (Applied
Biosystems).
การวิเคราะห์ T-RFLP ของชุมชนแบคทีเรียในดินเปิดเผยว่า
สระว่ายน้ำของยีน alkB มีความไวต่อการป้อนเคนกว่า 16S rRNA
ยีนสระว่ายน้ำ ในระบบการทดสอบของเราเรางดเว้นจากการตรวจสอบดิน
ชุมชนก่อนสัมผัสกับจำนวนเงินที่สูงของสารไฮโดรคาร์บอนหรือ
ภายใต้ความดันเลือกที่แข็งแกร่งสำหรับ degraders เคนเป็น
จะได้รับกรณีที่ปนเปื้อนในดิน [10] โดยที่
ปรากฏตรงไปตรงมาว่าสมาคมการทำงานของ degraders เคน
ตอบสนองที่แข็งแกร่งเพื่ออัลเคนกว่าทั้งชุมชน
โดยรวมความหลากหลายของยีน alkB ในสภาพแวดล้อมของดินโดยไม่ต้อง preexposure
กับจำนวนเงินที่สำคัญของอัลเคนเป็นที่น่าแปลกใจบ้าง.
ความแตกต่างของความลึกที่เกี่ยวข้องใน alkB ยีน T-RF พลวัตอาจจะ
สะท้อนให้เห็นถึงการให้เคนลดลงในดินลึกลงไปเป็นจำนวนมากซึ่งเป็น
อิสระจากชนิดของดิน เหมือนกันหมายถึงความร่ำรวย T-RF ของ
ทั้งสองระดับความลึกของดิน (อินเตอร์เฟซที่ 31 ± 2 ดินเป็นกลุ่ม 32 ± 3) ชี้ให้เห็นว่า
องค์ประกอบชุมชนที่แตกต่างกันมีความรับผิดชอบสำหรับความลึก
แตกต่าง ความคล้ายคลึงกันของชุมชน alkB ในอินเตอร์เฟซ
ตัวอย่างโดยไม่คำนึงถึงชนิดของดินและความสัมพันธ์สังเกต
กับประเภทครอกที่แสดงให้เห็นอิทธิพลครอกที่แตกต่างกันเกี่ยวกับเคน
degraders ในดินต้นแบบ พาวเวลและคณะ [11] สังเกตเช่นเดียวกัน
ในระดับเชิงพื้นที่มากขึ้น (1 กิโลเมตรระยะทางเว็บไซต์; 5e100 ซม.
ความลึก) อิทธิพลรวมของความลึกของดินและการให้เคน (เช่น
ปิโตรเลียมรวมเนื้อหาไฮโดรคาร์บอน) โครงสร้างชุมชน
และองค์ประกอบของเว็บไซต์โดยไม่คำนึงถึงการสุ่มตัวอย่าง ค้นพบของเรา
จึงขอแนะนำว่าปรากฏการณ์ที่สังเกตได้ในขนาดใหญ่ที่มี
การไล่ระดับสีมหาศาลของปัจจัยด้านสิ่งแวดล้อมอย่างเท่าเทียมกันสามารถนำไปใช้กับ
เครื่องชั่งขนาดเล็กเช่นการวิเคราะห์โดย subsampling พิภพของเราที่
แตกต่างของโครงสร้างของดินสูงอาจสร้าง microgradients ชัน.
16S rRNA ยีนตามโปรไฟล์ชุมชนสะท้อนให้เห็นถึงความแตกต่าง
เคน อิทธิพลในระดับเล็กน้อยกว่ารูปแบบ alkB เด่นชัดหัก
การเปลี่ยนแปลงจะได้รับการคาดว่าจะเป็นอัลเคนก่อให้เกิดเพียง
ส่วนเล็กน้อยของชีวมวลครอกทั้งหมด ดังนั้นที่สำคัญ
รูปแบบความสัมพันธ์ของชุมชนโดยรวมเพื่อการจัดหาเคนเป็น
ที่น่าแปลกใจ อำนาจความละเอียดค่อนข้างต่ำของ 16S rRNA ยีน TRFLP
กว่าโปรไฟล์ยีนการทำงานได้รับการสังเกตอื่น ๆ ยังอยู่ใน
การศึกษา Avrahami และคณะ [41] พบอย่างต่อเนื่องว่ายีน nirK
สะท้อนการเปลี่ยนแปลงในชุมชน Denitrifying ไม่ได้สังเกตกับ 16S
rRNA ยีน T-RFLP paralogy ยีนของ alkB อาจช่วยให้กระชับ
การเปลี่ยนแปลงในสมาคมของ degraders เคนจึงอนุญาตให้
การตรวจสอบของการเปลี่ยนแปลงที่ค่อนข้างเล็กภายในชุมชนโดยรวม.
ดังนั้นการกำหนดเป้าหมายการทำงานของยีนที่สามารถให้คำแนะนำต่อไปนี้สำหรับ
ฟังก์ชั่นระบบนิเวศดินที่เฉพาะเจาะจงเช่น 16S rRNA ยีน T-RFLP อาจจะ
ไม่อนุญาตให้มีการเลือกปฏิบัติของที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิด แต่ทางสรีรวิทยา
มีชีวิตที่แตกต่างกัน [8] นอกจาก 16S rRNA ยีนเดียว T-RFs
อาจเป็นสิ่งมีชีวิตจากแท็กซ่าแตกต่างกันจึงปิดบัง
การเปลี่ยนแปลงในองค์ประกอบชุมชน [42] ในทำนองเดียวกันพาวเวลและ
เพื่อนร่วมงาน [11] อิทธิพลที่ระบุในชุมชนของการทำงาน
ไม่ได้สะท้อนจากรูปแบบชุมชนแบคทีเรียโดยรวมและ
ได้ข้อสรุปว่าสมาชิกในชุมชนที่โดดเด่นไม่อาจดำเนิน
ยีน catabolic ที่เกี่ยวข้อง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ยุโรปวารสารดินชีววิทยา
ประเมิน t-rflp โปรโตคอลที่จะ sensitively วิเคราะห์ความหลากหลายทางพันธุกรรมและโครงสร้างของดินการเปลี่ยนแปลงชุมชน


วิธีการย่อยสลายเชื้อโรค 2.1 . การประเมินผลของเอนไซม์สำหรับ alkb t-rflp
ระเบิดฐานข้อมูลค้นหาให้สมบูรณ์หรือบางส่วน
alkb ยีน ลำดับกับ Pseudomonas enrichment P1 alkb ( aj233397 )
rhodococcus sp . และq15 alkb1 ( af388182 ) ลำดับที่อ้างอิง
ใช้ blastn พื้นฐานเครื่องมือค้นหาแนว [ 22 ] ผลลัพธ์ที่ได้
counterchecked blastx โปรตีนกับฐานข้อมูลการค้นหา [ 23 ]
บัญชีลำดับนิวคลีโอไทด์ที่เกี่ยวข้องกับโครงสร้าง monooxygenase .
ลำดับเหมาะสม อยู่ชิดกับ bioedit [ 24 ] การใช้เครื่องมือจัด clustalw
[ 25 ] เฉพาะลำดับมี
เว็บไซต์รวมเพื่อใช้ไพรเมอร์ ( เห็นผล alkb
ส่วน PCR ( ) คือต่อไป
เอนไซม์จำกัดการเลือก การดึงแนวร่วมรวม 83 ลำดับ
และด้วยตนเองตรวจสอบและอัปโหลดไปยังโปรแกรมออนไลน์
เอนไซม์ จำกัด ตัวเลือก ( repk ) เกมออนไลน์ v.1.2 [ 26 ] การตรวจสอบข้อ จำกัด เว็บไซต์

ของเอนไซม์ให้คะแนนสูงสุด repk และความถูกต้องของการเสนอส่วน
ความยาวโดยใช้เอ็นตัด v2.0 เครื่องมือค้นหา [ 27 ]
ไอโซอันดับที่เสนอโดย engebretson และมอยเออร์ [ 28 ]
ตาม ( ผม ) จำนวนรวมเทอร์มินัลจำกัดชิ้นส่วน
( เช่นความอุดมสมบูรณ์ของ t-rfs ) ด้วยข้อจำกัดที่ fragment length
อยู่ระหว่าง 50 และ 550 BP และแบ่งแยก
น้อยความแตกต่างของความยาวอย่างน้อยสามพบบัญชีสําหรับ
มติพลังของผู้ชม ( 2 ) ร้อยละ
ของลำดับด้วยไม่มีข้อ จำกัด เว็บไซต์สำหรับ
เอนไซม์เกี่ยวข้อง ตลอดจน ( 3 ) ร้อยละของลำดับด้วย t-rfs < 50 BP เลือกเอนไซม์ก็ทดสอบบน alkb amplicons
ทั้งหมดของยีน ชุมชนดินดีเอ็นเอ สารสกัดจาก microcosms
( ดูmicrocosms การทดลองใช้เอนไซม์ที่แตกต่างกัน ( 0.1 , 1 และ 2 u )
และ DNA ความเข้มข้น ( 50e100 ng สำหรับตัวอย่างสิ่งแวดล้อม ) .
2.4 . การสกัดดีเอ็นเอและดีเอ็นเอ ( DNA จากตัวอย่างดินทั้งชุมชน

ถูกสกัดเป็นอธิบายโดย Griffith et al . [ 30 ] ดีเอ็นเอของเสริมวัฒนธรรมคือ
สกัดตามที่อธิบายไว้โดย Maher et al . [ 31 ] และดัดแปลงเป็น
อธิบายโดย giebler et al . [ 3 ]คุณภาพและปริมาณดีเอ็นเอถูกกำหนดโดยวิธีเจล
,
( nanodrop นี้® nd-1000 peqlab , เยอรมนี ) สารสกัดจาก
ซ้ำแต่ละตัวก่อนการวิเคราะห์รวมชุมชน
คำนึงถึงความผันแปรตามธรรมชาติของดินและแกน
เอาชนะสามารถผล อัลเคน ( alkb )
monooxygenaseเบสในปฏิกิริยา PCR ประกอบด้วยยีน 15e20 นาโน
DNA PCR ใช้แท็ค Master Mix Kit ( QIAGEN Hilden เยอรมนี , ) , ( 0.12 %
และ 0.1 มิลลิเมตร alkb ไพรเมอร์ [ 32 ] กับการปรับเปลี่ยนตามที่อธิบาย
โดยชูลซ์ et al . [ 33 ] ( ส่งต่อรองพื้น alkb 1f_deg 50-aay ACI GCI
Cay Gar CTI GGI เคย์ aa-30 ย้อนกลับรองพื้น alkb 1r_deg 50-gcr tgr
tgr สบท Gar TGI ระหว่าง tg-30 ) ครอบคลุมกว้าง alkb ลำดับ
ความหลากหลายและมีใช้อยู่แล้วในสามอดีต alkb t-rflp
โปรโตคอล [ 10e12 ] โดยได้ดำเนินการใน 25 ml ( 95
C / 10 นาที , 30
รอบ : 95
C / 45 S , 58.7
C / นาที 1 , 72
C / 45 และยืดตัวสุดท้ายที่
72
C / 10 นาที )
เบส 16S rRNA ยีนขยายโดยใช้ไพรเมอร์ 27f [ 50-aga
gtt TGA TCM tgg CTC ag-30 [ 34 ] ] และ [ 50-aag 1525r มุข GTG
WTC รถ cc-30 [ 35 ] ] ส่วนผสมประกอบด้วย 1 ) อาจารย์
) ทัคผสมชุด ( เพิ่ม ) , 0.01 มม. รองพื้นและ 10 ของปริมาณดีเอ็นเอในปฏิกิริยา
รวม 25 ml ( 94
C / 4 นาที 30 ครั้ง : 94
C / 45 , 58
C /
3 S , 72
C / 1 นาที ตามด้วยการยืด 72
C : สุดท้าย / 10 นาที )
ทั้งหมดทั้งหมดจะถูกรันบนเตแตรด 2 เทอมอไซเคล ์ ( biorad ห้องปฏิบัติการ
มิวนิค เยอรมนี ) ผลิตภัณฑ์ขยายดู
ขนาดและถูกต้อง ( 550 BP สำหรับยีน 16S
alkb 1500 BP สำหรับrRNA ยีน ) กับเจลอิเล็กบริสุทธิ์กับ
เจล SV ®พ่อมดและ PCR ทำความสะอาดระบบ ( promega Mannheim , เยอรมัน ,
) และวัดนี้ ( nanodrop ®

nd-1000 ) 2.5 t-rflp วิเคราะห์
ไปข้างหน้าโดยมีป้ายกับการย้อม 6 -
carboxyfluorescein ( 6-fam ) PCR ( ก่อน t-rflp
การวิเคราะห์ หนึ่งร้อยของบริสุทธิ์ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกย่อยกว่า
คืนที่ 37
C 2 U hpych4v ( อังกฤษ biolabs เบฟเวอรี่
, MA , สหรัฐอเมริกา ) สำหรับ amplicons alkb หรือโดยใช้ ( อังกฤษ biolabs )
เบส 16S rRNA ยีน amplicons . หลังจากตกตะกอนเอทานอล , การวิเคราะห์ t-rflp
ถูกวิ่งบน ABI ปริซึม 3100 ระบบวิเคราะห์ทางพันธุกรรม
ใช้ genescan ™ 500 Rox ™ขนาดมาตรฐาน ( ทั้งใช้
Biosystems ฟอสเตอร์ ซิตี้ , แคลิฟอร์เนีย , สหรัฐอเมริกา เวลาฉีดฝอย
เป็นชุด15 วินาทีหรือ 8 เมื่อความเข้มสูงสุด พบว่าปิดค่าขนาด ข้อมูล วิเคราะห์ข้อมูลด้วยโปรแกรม v3.7
genemapper ประยุกต์ Biosystems

) การวิเคราะห์ t-rflp ชุมชนแบคทีเรียในดิน พบว่า มียีนสระว่ายน้ำ
alkb อ่อนไหวมากกับแอลเคนข้อมูลกว่าเบส 16S rRNA
ยีนสระ ในการทดสอบระบบของเรา เราไม่ทำการตรวจสอบดิน
ชุมชนก่อนสัมผัสกับปริมาณสูงของไฮโดรคาร์บอนหรือ
ภายใต้ความดันเลือกที่แข็งแกร่งสำหรับความสามารถในการย่อยสลายแอลเคนเป็น
จะได้รับกรณี [ 10 ] ในดินปนเปื้อน โดย
ปรากฏที่ตรงไปตรงมาที่สมาคมการทำงานของโครงสร้างที่แข็งแกร่งเพื่อการตอบสนองความสามารถในการย่อยสลาย

กว่าชุมชนทั้งหมด โดยรวม ความหลากหลายของยีนในสภาพแวดล้อมของดินโดยวิธี alkb
ยังคงปริมาณของแอลเคนจะค่อนข้างน่าแปลกใจ
ความลึกที่เกี่ยวข้องกับความแตกต่างใน alkb ยีน t-rf พลศาสตร์อาจสะท้อนโครงสร้างบทบัญญัติในดินล่าง

อิสระเป็นกลุ่มลึก ซึ่งเป็นประเภทของดิน เหมือนกัน หมายถึง ความอุดมสมบูรณ์ ของ t-rf
2 ระดับความลึก ( อินเตอร์เฟซ 31 ± 2 เป็นกลุ่มดิน 32 ± 3 ) พบว่า องค์ประกอบต่าง ๆที่รับผิดชอบชุมชน

ทั้งลึก . ความคล้ายคลึงกันของชุมชน alkb ในอินเตอร์เฟซ
ตัวอย่างโดยไม่คำนึงถึงชนิดของดิน และพบความสัมพันธ์
กับชนิดแคร่แสดงให้เห็นอิทธิพลที่แตกต่างกันบนแคร่แอลเคน
ความสามารถในการย่อยสลายในภายใต้ดิน พาวเวลล์ et al . [ 11 ] และสังเกต
บนมากขึ้นพื้นที่ขนาด 1 กิโลเมตร ระยะทาง 5e100 ซม. ความลึกของเว็บไซต์ ;
) รวมอิทธิพลของความลึกดินและโครงสร้างการจัดการ ( เช่น
ปิโตรเลียมไฮโดรคาร์บอนเนื้อหาทั้งหมด ) ในโครงสร้างชุมชน
และองค์ประกอบนึง 2 เว็บไซต์ การค้นพบของเราจึงแนะนำให้ปรากฏการณ์ที่สังเกต

ในขนาดใหญ่ที่มีมหาศาลไล่ของปัจจัยสิ่งแวดล้อมกันใช้

เครื่องชั่งขนาดเล็กเป็นวิเคราะห์โดยค่าพิภพของเรา ที่สามารถ อาจ สร้าง โครงสร้างดินสูง

16S rRNA ยีน microgradients ชัน ตามชุมชน สะท้อนให้เห็นชัดเจน
โปรไฟล์แอลเคนมีอิทธิพลต่อขอบเขตเล็กน้อยกว่ารูปแบบ alkb . ออกเสียง
น้อยการเปลี่ยนแปลงอาจจะคาดว่าการโพสเพียงเศษส่วนของชีวมวลขยะ
รองทั้งหมด ดังนั้น ความสัมพันธ์ของชุมชนโดยรวมโครงสร้างรูปแบบ

) ก็ไม่แปลก ความละเอียดค่อนข้างลดพลังของเบส 16S rRNA ยีน trflp
กว่าการทำงานของยีนโปรไฟล์ได้รับการตรวจสอบในการศึกษาอื่น ๆ

avrahami et al . [ 41 ] อย่างต่อเนื่องพบว่า เนิร์กยีน
กระจกกะในชุมชนดีไนตริฟายอิง ไม่พบยีน 16S rRNA t-rflp ด้วย
. ยีน paralogy ของ alkb อาจช่วยกระชับ
เปลี่ยนแปลงในกิลด์ของแอลเคนความสามารถในการย่อยสลาย ดังนั้น ให้ตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงที่ค่อนข้างเล็ก

ภายในชุมชนโดยรวม ดังนั้น เป้าหมายการทำงานสามารถรับยีนตาม
หน้าที่ของระบบนิเวศของดินเฉพาะ , เบส 16S rRNA ยีน t-rflp อาจ
ไม่อนุญาตการเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดแต่เรา
แตกต่างสิ่งมีชีวิต [ 8 ] นอกจากนี้ เดียวเบส 16S rRNA ยีน t-rfs
อาจเป็นสิ่งมีชีวิตที่แตกต่างกันและจึงปิดบัง
การเปลี่ยนแปลงในองค์ประกอบของชุมชน [ 42 ] อนึ่ง พาวเวลล์ และเพื่อนร่วมงาน [ 11 ]

หน้าที่ระบุอิทธิพลในชุมชนไม่สะท้อนให้เห็นโดยรวมรูปแบบชุมชนแบคทีเรีย
สรุปได้ว่าสมาชิกชุมชนเด่นอาจจะไม่ถือ
เกี่ยวข้อง catabolic ยีน