2. Materials and methods2.1. Bacter

2. Materials and methods
2.1. Bacterial strains and culture conditions
X. axonopodis pv. citri and X. campestris pv. campestris strain
8004 were kindly provided by Dr. A. Castagnaro (EEAOC, Argentina)
and Dr. A. Vojnov (Centro César Milstein, Argentina), respectively.
Bacteria were grown at 28 ◦C in Peptone–Yeast extract–Malt extract
(PYM) nutrient medium (5 g/L Bacto-peptone, 3 g/L Bacto-yeast
extract and 3 g/L Bacto-Malt extract), supplemented with d-glucose
to a final concentration of 1% (w/v). For growth on plates, PYM was
solidified with 1.5% (w/v) agar to make PYM-A. For in planta assays,
one single colony was chosen, transferred to liquid PYM medium
and grown overnight at 200 rpm on a rotary shaker at 28 ◦C. Bacterial
cells were harvested by centrifugation and resuspended in
10 mM MgCl2 to a final concentration of 1
×
105 c.f.u./ml.
2.2. Growth inhibition assays
Growth inhibition of X. axonopodis and X. campestris by synthetic
dermaseptin (MALWKTMLKKLGTMALHAGKAALGAAADTISQGTQ)
was assayed according to Osusky et al. (2005). Briefly, 90 l of
bacterial culture in PYM liquid medium (1
×
107 cells/ml) were
incubated in Eppendorf tubes containing 10 l of dermaseptin
dilutions. Control incubation containing only water was included.
Incubations were performed at 25 ◦C for 4 h under continuous shaking,
diluted in PYM medium and spread on PYM-A plates. Colony
counting for each treatment was performed after incubation for
48 h at 28 ◦C.
2.3. Genetic constructions
A DNA cassette containing the dermaseptin coding sequence
from Phyllomedusa sauvagii, the Cauliflower mosaic virus 35S promoter,
the Tobacco mosaic virus  enhancer, the esporamine
pre-peptide signal peptide (apoplastic export signal) and the nopaline
synthase transcription termination sequence (Rivero et al.,
2012) was sub-cloned at the Hind III site of the pBIN19sgfp binary
vector (Chiu et al., 1996). The resulting construction was named
pBIN19sgfp-Der (Fig. 2a). Transformation with the pBIN19sgfp
vector allows the selection of transgenic callus in kanamycincontaining
medium or by direct visualization of GFP expression.
2.4. Plant transformation
Internodal explants were obtained from of 6 to 12-old
month sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck cv. Pineapple)
seedlings grown in greenhouse conditions. The stem segments
employed for transformation were approximately 1-cm long. For
transformation, explants were co-cultivated with Agrobacterium
tumefaciens (EHA105 strain) carrying the pBIN19sgfp-Der construction.
Transformants were selected in Murashige and Skoog
medium containing 100 mg/L kanamycin and the regenerating
buds were subsequently screened under a stereomicroscope for
GFP fluorescence. Positive shoot tips were in vitro grafted on
decapitated seedlings of Troyer citrange (Poncirus trifoliata (L.)
Raf.
×
C. sinensis (L.) Osbeck) as previously described (Pe˜na et al.,
1995). After 3–4 weeks, scions were preliminarily screened by
PCR for presence of the dermaseptin and GFP sequences using
the specific primer pairs Der-Fw (5-tggctctttggaagactatgc-3)
and Der-Rv (5-gctgatactatttctcaaggaactcaa-3), and GFP-Fw (5-
atggtgagcaagggcgagga-3) and GFP-Rv (5-ggaccatgtgatcgcgcttc-
3), respectively. Then, positive plantlets were side-grafted on
vigorous 6-month-old rough lemon (Citrus jambhiri Lush) rootstocks
and grown in a growth chamber at 26 ◦C under a 16 h-light
photoperiod.
2.5. Leaf infiltration assays
Bacterial suspensions of A. tumefaciens (5
×
106 c.f.u./ml) and X.
axonopodis pv. citri (1
×
105 c.f.u./ml) were infiltrated at the abaxial
surface of fully expanded Nicotiana benthamiana leaves according
to the procedure reported by Metz et al. (2005). The experiment
was repeated 3 times and each assay included 5 plants. Infiltrations
were carried out on 3 leaves per plant.
2.6. RNA extraction and RT-PCR analysis
For RNA extraction, 200 mg of transgenic and control sweet
orange leaves were ground under liquid nitrogen in TRiZOL Reagent
(Invitrogen). RNA samples were resuspended in 50 l of RNasefree
water and incubated with RQ1 RNase-Free DNase (Promega)
to remove DNA traces prior to RT-PCR. cDNA synthesis was performed
using the iScript cDNA Synthesis kit (Bio Rad Laboratories).
A PCR assay lacking reverse transcriptase was performed as a
control for DNA contamination. Expression of the dermaseptin
sequence in transgenic plants was assessed using the Der-Fw and
Der-Rv primers. The actin B coding sequence, used as internal control,
was detected using the Act-Fw (5-tggtcgtaccaccggtattgtgtt-3)
and Act-Rv (5-tcacttgcccatcaggaagctcat-3) primers. Twenty-four
cycles were performed for both transcripts and analyzed by electrophoresis
in agarose gel 2%.
2.7. Southern blot analysis
Total DNA was extracted from leaves as described by Dellaporta
et al. (1984). The DNA (10 g) was digested with Bgl II (Fermentas),
electrophoresed in a 0.8% agarose gel and blotted onto Hybond
N+ Nylon membranes (Amersham). Specific DNA sequences were
detected by hybridization with a 32P-labeled DNA probe comprising
the complete dermaseptin sequence. Labeling of the probe was
performed by random priming using a Prime-a-Gene kit (Promega).
Pre-hybridization and hybridization were carried out at 63 ◦C in
Church’s hybridization solution (Church and Gilbert, 1984) for
2 and 16 h, respectively. After hybridization, membranes were
washed in 2×
SSC, 0.1% SDS for 15 min at room temperature, then
in the same solution for 15 min at 63 ◦C, and finally wash in 0.2×
SSC, 0.1% SDS at 63 ◦C for 15 min. The blots were then exposed to Xray
film or analyzed using the Storm 840 PhosphorImager system
(Amersham).
2.8. In planta infection assays and statistical analysis
Transgenic and non-transgenic sweet orange plants were propagated
by grafting on Rough lemon rootstocks. Non-transgenic
plants were used as controls. All leaves used in infection assays
were of the same age and physiological condition. Infection assays
with sweet orange plants were performed in a growth chamber
at 26 ◦C and a 16 h-light photoperiod. Inoculation with X.
axonopodis pv. citri (1
×
105 c.f.u./ml) was performed using the
method reported by Yang et al. (2010) with minor modifications.
To this end, leaf abaxial surfaces were previously punctured
with sterile needles at two adjacent areas located at both sides
of the leaf midvein. Each area comprised 8 punctures separated
from each other by 2-mm distance. Bacterial suspension was
sprayed on the abaxial surface of leaves from a distance of 3 cm.
Each punctured area was sprayed three times at short intervals.
Each assay included 9–12 fully expanded leaves per each transgenic
plant and assays were repeated 3 times. Observations of
canker disease symptoms were made using a hand-held magnifier
and were photographed using a 2000-C stereomicroscope
(Zeiss). Frequency of canker formation is expressed as (total canker
number/total punctures)
×
100. In addition, according to the number
of canker developed, each individual leaf was classified as low
(1–4 cankers), moderate (5–8 cankers) or high (9–16 cankers) infection
categories. Results were shown as the percentage of leaves
belonging to each infection category for corresponding transgenic
plant.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 สายพันธุ์แบคทีเรียและสภาพวัฒนธรรม
กำแพงแสน x. อัพ pv citri และ x. อัพ campestris pv ต้องใช้ campestris
8004 ได้กรุณาโดยอ.ดร. Castagnaro (EEAOC อาร์เจนตินา)
และดร. A. Vojnov (เซ็นโทร César Milstein อาร์เจนติน่า), ตามลำดับ.
แบคทีเรียถูกปลูกที่ 28 ◦C ใน Peptone – ยีสต์สกัดมอลต์ extract
(PYM) ธาตุอาหารปานกลาง (5 g/L Bacto-peptone 3 g/L Bacto-ยีสต์
สารสกัดและ 3 g/L Bacto-มอลต์สกัด), เสริม ด้วย d-กลูโคส
กับความเข้มข้นสุดท้าย 1% (w/v) สำหรับการเจริญเติบโตบนแผ่น PYM ได้
หล่อกับ agar 1.5% (w/v) ให้อ. PYM สำหรับใน assays ลเวียมานอร์,
หนึ่งเลือกโคโลนีเดี่ยว โอนย้ายของเหลวปานกลาง PYM
และแอร์พอร์ตโอเวอร์ไนท์ปลูกที่ 200 รอบต่อนาทีในเชคเกอร์โรตารี่ที่ 28 ◦C แบคทีเรีย
เก็บเกี่ยว โดย centrifugation และ resuspended ในเซลล์
10 มม. MgCl2 จะเข้มข้นสุดท้าย 1
การ
105 c.f.u./ml.
2.2 Assays ยับยั้งการเจริญเติบโต
ยับยั้งการเจริญเติบโตของ x. อัพกำแพงแสนและ x. อัพ campestris โดยหนังสังเคราะห์
dermaseptin (MALWKTMLKKLGTMALHAGKAALGAAADTISQGTQ)
ถูก assayed ตาม Osusky et al. (2005) สั้น ๆ 90 l
PYM เหลวปานกลางวัฒนธรรมแบคทีเรีย (1
การ
107 เซลล์/มล.) ถูก
incubated ใน Eppendorf หลอดประกอบด้วย 10 l dermaseptin
dilutions ฟักตัวควบคุมที่ประกอบด้วยเฉพาะน้ำที่รวม
ดำเนินที่ 25 ◦C สำหรับ h 4 ภายใต้การสั่นต่อเนื่อง Incubations
แตกออกในกลาง PYM และแพร่กระจายบนแผ่น PYM A อาณานิคม
นับสำหรับทำทรีตเมนท์หลังจากฟักตัวใน
h 48 ที่ 28 ◦C
2.3 พันธุกรรมก่อสร้าง
อับดีเอ็นเอประกอบด้วย dermaseptin รหัสลำดับ
จาก Phyllomedusa sauvagii โปรโมเตอร์ 35S ไวรัสกะหล่ำกระเบื้องโมเสค,
เพิ่มยาสูบ esporamine
เพปไทด์สัญญาณก่อนเพปไทด์ (apoplastic ส่งสัญญาณ) และ nopaline
ลำดับสิ้น transcription synthase (Rivero et al.,
2012) ถูกย่อยโคลนที่ไซต์เดนไฮนด์ III ของ pBIN19sgfp ไบนารี
เวกเตอร์ (Chiu et al., 1996) ชื่อว่าก่อสร้างได้
pBIN19sgfp-แดร์ (Fig. 2a) การแปลงกับการ pBIN19sgfp
เวกเตอร์ให้เลือกถั่วเหลืองให้ใน kanamycincontaining
กลาง หรือแสดงภาพประกอบเพลงโดยตรงของ GFP นิพจน์
2.4 พืชแปลง
Internodal explants ได้รับมาจากของเก่า 6 ถึง 12-
เดือนหวานส้ม (ส้ม sinensis L. Osbeck พันธุ์สับปะรด)
กล้าไม้ที่ปลูกในเรือนกระจก ส่วนก้าน
จ้างสำหรับแปลงได้ประมาณ 1 ซม.ยาว สำหรับ
แปลง explants ได้ร่วมปลูกอโกรแบคทีเรียม
tumefaciens (ต้องใช้ EHA105) ดำเนินการก่อสร้าง pBIN19sgfp Der.
Transformants เลือก Murashige และ Skoog
สื่อกานามัยซิน 100 mg/L และการสร้างใหม่
อาหารก็มาฉายภายใต้ stereomicroscope สำหรับ
GFP fluorescence เคล็ดลับบวกยิงถูกใน grafted บน
decapitated กล้าไม้ของทรอยเออร์ citrange (Poncirus trifoliata (L.)
Raf.
การ
C. sinensis (L.) Osbeck) อธิบายไว้ก่อนหน้านี้เป็น (Pe˜na et al.,
1995) หลังจาก 3 – 4 สัปดาห์ scions ถูก preliminarily ฉายโดย
PCR สำหรับของ dermaseptin และ GFP ลำดับใช้
รองพื้นเฉพาะจับคู่แดร์ Fw (5 - tggctctttggaagactatgc-3)
Der Rv และ (5 - gctgatactatttctcaaggaactcaa-3), และ GFP Fw (5-
atggtgagcaagggcgagga-3) และ GFP Rv (5 - ggaccatgtgatcgcgcttc-
3), ตามลำดับ แล้ว plantlets บวกถูก grafted ด้านบน
คึกคักอายุ 6 เดือนที่หยาบมะนาว (ส้ม jambhiri ลัช) rootstocks
และเติบโตในหอเจริญเติบโตที่ 26 ◦C ภายใต้ 16 ไฟ h
ชั่วโมง.
2.5 ใบแทรกซึม assays
ฟโรแบคทีเรียของ A. tumefaciens (5
การ
106 c.f.u./ml) และ x. อัพ
กำแพงแสนวิศวกรรม citri (1
การ
105 c.f.u./ml) ได้ถูกแทรกซึมใน abaxial
ผิว benthamiana Nicotiana ขยายเต็มใบตาม
กระบวนงานที่รายงานโดยเม็ตซ์ et al. (2005) ทดลอง
ทำซ้ำ 3 ครั้งและวิเคราะห์แต่ละรวมพืช 5 Infiltrations
ได้ดำเนินการใน 3 ใบต่อโรงงาน
2.6 สกัดอาร์เอ็นเอและการวิเคราะห์ของ RT-PCR
สกัดในอาร์เอ็นเอ 200 มิลลิกรัมของถั่วเหลือง และควบคุมหวาน
ใบไม้สีส้มถูกพื้นดินภายใต้ไนโตรเจนเหลวใน TRiZOL Reagent
(Invitrogen) ตัวอย่างของอาร์เอ็นเอมี resuspended ใน 50 l RNasefree
น้ำ และ incubated กับ RQ1 ฟรี RNase DNase (Promega)
จะลบร่องรอยดีเอ็นเอก่อน RT-PCR ทำการสังเคราะห์ cDNA
ใช้ cDNA iScript สังเคราะห์ชุด (ห้องปฏิบัติการชีวภาพ Rad) .
A PCR assay ขาด transcriptase กลับทำเป็นแบบ
ควบคุมการปนเปื้อน DNA ค่าของการ dermaseptin
ลำดับในพืชถั่วเหลืองถูกประเมินโดยใช้ Der Fw และ
Der Rv ไพรเมอร์ แอกติน B รหัสลำดับที่ ใช้เป็นตัวควบคุมภายใน,
พบใช้ Fw บัญญัติ (5 - tggtcgtaccaccggtattgtgtt-3)
และไพรเมอร์ (5 - tcacttgcccatcaggaagctcat-3) พระราชบัญญัติ-Rv ยี่สิบสี่
รอบสำหรับทั้งใบแสดงผลดำเนินการ และวิเคราะห์ โดย electrophoresis
ใน agarose เจล 2%
2.7 คืนในตาภาคใต้วิเคราะห์
รวมดีเอ็นเอที่สกัดจากใบตามที่อธิบายไว้ โดย Dellaporta
et al. (1984) ดีเอ็นเอ (10 g) ถูกต้องกับ Bgl II (Fermentas),
electrophoresed ในวุ้น agarose 0.8% และ blotted บน Hybond
เยื่อหุ้มไนลอน N (Amersham) ได้ลำดับดีเอ็นเอเฉพาะ
พบ โดย hybridization กับการป้าย 32P ดีเอ็นเอโพรบประกอบด้วย
ลำดับ dermaseptin สมบูรณ์ ติดฉลากของโพรบถูก
ดำเนินการ โดยใช้ชุดนายกเป็นยีน (Promega) ด้วยสุ่ม
hybridization ก่อนและ hybridization ได้ดำเนินการใน 63 ◦C ใน
โบสถ์ของโซลูชันการ hybridization (คริสตจักรและกิลเบิร์ต 1984) สำหรับ
2 และ 16 h ตามลำดับ หลังจาก hybridization เยื่อหุ้มถูก
ล้างในฟิลด์ 2
SSC, 0.1% SDS ใน 15 นาทีที่อุณหภูมิห้อง แล้ว
ในโซลูชันเดียวกันสำหรับ 15 นาทีที่ 63 ◦C และสุดท้าย ล้างด้วย 0.2 ×
SSC, 0.1% SDS ที่ ◦C 63 สำหรับ 15 นาที กันบล็อทได้สัมผัสกับ Xray แล้ว
ฟิล์ม หรือวิเคราะห์โดยใช้ระบบพายุ 840 PhosphorImager
(Amersham) .
2.8 Assays ลเวียมานอร์ติดเชื้อและการวิเคราะห์ทางสถิติ
ถั่วเหลือง และถั่ว เหลืองไม่หวานส้มพืชถูกเผยแพร่
โดย grafting บน rootstocks หยาบมะนาว ไม่ใช่ถั่วเหลือง
พืชถูกใช้เป็นตัวควบคุม ใบทั้งหมดที่ใช้ในการติดเชื้อ assays
อยู่ยุคเดียวกันและสภาพสรีรวิทยา เชื้อ assays
ด้วยพืชส้มหวานดำเนินในหอเจริญเติบโต
ที่ 26 ◦C และชั่วโมงไฟ h 16 Inoculation กับ x. อัพ
กำแพงแสนวิศวกรรม citri (1
การ
105 c.f.u./ml) ทำโดยใช้
วิธีรายงานโดย Yang et al. (2010) โดยปรับเปลี่ยนเล็กน้อย.
เพื่อการนี้ ใบไม้ abaxial ผิวเคยแฟบ
กับกอซเข็มที่สองพื้นที่ติดอยู่ทั้งสองด้าน
ของ midvein ใบ แต่ละพื้นที่ประกอบด้วย 8 punctures คั่น
กันโดยระยะทาง 2 mm ระงับเชื้อแบคทีเรียถูก
ฉีดพ่นบนพื้นผิวของใบไม้จากระยะไกลของ 3 cm. abaxial
แต่ละพื้นที่แฟบถูกพ่นสามครั้งในช่วงสั้น
วิเคราะห์แต่ละรวม 9 – 12 ใบขยายทั้งหมดสำหรับแต่ละถั่วเหลือง
assays และพืชถูกทำซ้ำ 3 ครั้ง ข้อสังเกต
ทำอาการโรค canker ใช้'แว่นขยาย'มือถือ
และถูกถ่ายภาพโดยใช้ stereomicroscope
(Zeiss) 2000 C ความถี่ของการกำเนิด canker จะแสดงเป็น (รวม canker
รวมจำนวน punctures)
การ
100 นอกจากนี้ ตามจำนวน
ของ canker พัฒนา แต่ละใบแต่ละถูกจัดประเภทเป็นต่ำ
(cankers 1-4), ปานกลาง (5 – 8 cankers) หรือการติดเชื้อสูง (9-16 cankers)
ประเภท ผลลัพธ์ที่แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของใบ
ของแต่ละประเภทติดเชื้อตรงถั่วเหลือง
โรงงาน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2 วัสดุและวิธีการ
2.1 สายพันธุ์และเงื่อนไขในการเพาะเลี้ยงเชื้อแบคทีเรีย
เอ็กซ์ axonopodis pv citri และ X. campestris pv สายพันธุ์ campestris
8004 ได้ให้ความกรุณาโดยดร A. Castagnaro (EEAOC, อาร์เจนตินา)
และดร A. Vojnov (Centro César Milstein, อาร์เจนตินา) ตามลำดับ
แบคทีเรียมีปลูกอยู่ที่ 28 ◦Cในสารสกัดจากสารสกัดจากมอลต์เปปโตน-ยีสต์
(PYM ) สารอาหารขนาดกลาง (5 กรัม / ลิตร Bacto-เปปโตน, 3 กรัม / ลิตร Bacto ยีสต์
สกัดและ 3 กรัม / ลิตร Bacto มอลต์สกัด) เสริมด้วย D-กลูโคส
ที่มีความเข้มข้นสุดท้ายของ 1% (w / v) สำหรับการเจริญเติบโตบนจานพิมเป็น
ผลึกกับ 1.5% (w / v) วุ้นจะทำให้ PYM- ในการตรวจพืช,
อาณานิคมหนึ่งเดียวที่ได้รับเลือกย้ายไปกลาง PYM ของเหลว
และเติบโตในชั่วข้ามคืนที่ 200 รอบต่อนาทีในเครื่องปั่นหมุนที่ 28 ◦C แบคทีเรีย
เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงและ resuspended ใน
10 มิลลิ MgCl2 ที่ความเข้มข้นสุดท้ายของ 1
×
105 cfu / ml
2.2 การเจริญเติบโตของการตรวจการยับยั้ง
การยับยั้งการเจริญเติบโตของ axonopodis เอ็กซ์และ X. campestris โดยสังเคราะห์
dermaseptin (MALWKTMLKKLGTMALHAGKAALGAAADTISQGTQ)
ได้รับการวิเคราะห์ตาม Osusky และคณะ (2005) สั้น ๆ , 90? ลิตร
วัฒนธรรมแบคทีเรียใน PYM อาหารเหลว (1
×
107 เซลล์ / มิลลิลิตร) ได้รับการ
บ่มในหลอด Eppendorf มี 10? ลิตร dermaseptin
เจือจาง บ่มเพาะการควบคุมที่มีน้ำเพียงถูกรวม
ได้ดำเนินการฟักตัวของเชื้อที่ 25 ◦C 4 ชั่วโมงภายใต้การสั่นสะเทือนอย่างต่อเนื่อง
เจือจางใน PYM ขนาดกลางและแพร่กระจายบนจาน PYM- อาณานิคม
นับสำหรับแต่ละการรักษาได้รับการดำเนินการหลังจากการบ่มสำหรับ
48 ชั่วโมงวันที่ 28 ◦C
2.3 การก่อสร้างทางพันธุกรรม
ดีเอ็นเอเทปคาสเซ็ทที่มี dermaseptin รหัสลำดับ
จาก Phyllomedusa sauvagii, กะหล่ำไวรัส 35S ก่อการ
ไวรัสยาสูบ? เพิ่ม, esporamine
เปปไทด์ก่อนเปปไทด์สัญญาณ (สัญญาณการส่งออก apoplastic) และ nopaline
ลำดับยกเลิกการถอดความเทส (ริเว et al.,
2012) เป็นย่อยโคลนที่เว็บไซต์หลังที่สามของไบนารี pBIN19sgfp
เวกเตอร์ (ชิว et al. 1996 ) การก่อสร้างที่เกิดขึ้นเป็นชื่อ
pBIN19sgfp-ฟอนเดอร์ (รูปที่ 2a). การเปลี่ยนแปลงที่มี pBIN19sgfp
เวกเตอร์ให้เลือกหลากหลายทั้งแคลลัสพันธุ์ใน kanamycincontaining
กลางหรือโดยการสร้างภาพโดยตรงในการแสดงออก GFP
2.4 การเปลี่ยนแปลงพืช
Internodal ชิ้นส่วนที่ได้รับจากของ 6-12 อายุ
เดือนสีส้มหวาน (ส้มเนซิสลิตร ​​Osbeck Cv. สับปะรด)
ต้นกล้าปลูกในสภาพเรือนกระจก ส่วนก้าน
ที่ใช้สำหรับการเปลี่ยนแปลงมีความยาวประมาณ 1 เซนติเมตร สำหรับ
การเปลี่ยนแปลงชิ้นส่วนได้ร่วมปลูกกับ Agrobacterium
tumefaciens (สายพันธุ์ EHA105) แบก pBIN19sgfp-เดก่อสร้าง
Transformants ได้รับการคัดเลือกในอาหารสูตร
ขนาดกลางที่มี 100 มิลลิกรัม / ลิตร KANAMYCIN และปฏิรูป
ตาถูกคัดกรองมาภายใต้กล้องจุลทรรศน์สำหรับ
GFP เรืองแสง เคล็ดลับการถ่ายภาพเชิงบวกอยู่ในหลอดทดลองปลูกใน
ต้นกล้าหัวของ Troyer citrange (Poncirus trifoliata (L. )
Raf
×
เนซิสซี (L. ) Osbeck) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Pe~na et al.,
1995) หลังจาก 3-4 สัปดาห์ตราหน้าถูกคัดกรองเบื้องต้นโดย
วิธี PCR สำหรับการปรากฏตัวของ dermaseptin และ GFP ลำดับโดยใช้
คู่ไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงเด-ส่งต่อ (5? -tggctctttggaagactatgc-3?)
และเดอร์-RV (5? -gctgatactatttctcaaggaactcaa-3?) และ GFP-ส่งต่อ (5 -
? atggtgagcaagggcgagga-3) และ GFP-RV (? 5 -ggaccatgtgatcgcgcttc-
3) ตามลำดับ จากนั้นต้นบวกด้านกราฟต์ที่
แข็งแรงมะนาวหยาบ (ส้ม jambhiri สุรา) ต้นตอ 6 เดือนอายุ
และการเจริญเติบโตในห้องการเจริญเติบโตที่ 26 ◦Cภายใต้ 16 ชั่วโมงแสง
แสง
2.5 ใบตรวจการแทรกซึม
ของสารแขวนลอยแบคทีเรีย A. tumefaciens (5
×
106 cfu / ml) และเอ็กซ์
axonopodis pv citri (1
×
105 cfu / ml) ได้แทรกซึมเข้าไปอยู่ในที่ abaxial
พื้นผิวของการขยายตัวได้อย่างเต็มที่ Nicotiana benthamiana ใบตาม
ขั้นตอนที่รายงานโดยซ์และคณะ (2005) การทดลอง
ซ้ำ 3 ครั้งและแต่ละทดสอบรวม ​​5 พืช แฝงตัว
ถูกดำเนินการในวันที่ 3 ใบต่อต้น
2.6 สกัดอาร์เอ็นเอและการวิเคราะห์ RT-PCR
สำหรับการสกัดอาร์เอ็นเอ 200 มิลลิกรัมของยีนและการควบคุมหวาน
ใบสีส้มถูกพื้นดินภายใต้ไนโตรเจนเหลวใน Trizol Reagent
(Invitrogen) ตัวอย่าง RNA ถูก resuspended ใน 50 ลิตร RNasefree
น้ำและบ่มกับ RQ1 RNase ฟรี DNase (Promega)
เพื่อลบร่องรอยดีเอ็นเอก่อนที่จะ RT-PCR ยีนสังเคราะห์ได้รับการดำเนินการ
โดยใช้ชุด iScript ยีนสังเคราะห์ (Bio แรดห้องปฏิบัติการ)
วิธี PCR ขาด transcriptase ย้อนกลับได้ดำเนินการตาม
การควบคุมการปนเปื้อนดีเอ็นเอ การแสดงออกของ dermaseptin
ลำดับในพืชดัดแปรพันธุกรรมได้รับการประเมินโดยใช้ฟอนเดอร์-ส่งต่อและ
ไพรเมอร์เดอร์-Rv ลำดับโปรตีน B เข้ารหัสใช้เป็นระบบการควบคุมภายใน
ที่ตรวจพบโดยใช้พระราชบัญญัติ-ส่งต่อ (5? -tggtcgtaccaccggtattgtgtt-3?)
และพระราชบัญญัติ-RV (5? -tcacttgcccatcaggaagctcat-3?) ไพรเมอร์ ยี่สิบสี่
รอบได้ดำเนินการสำหรับการถอดเสียงทั้งสองและวิเคราะห์โดย electrophoresis
ใน agarose เจล 2%
2.7 การวิเคราะห์ blot ใต้
ทั้งหมดถูกสกัดดีเอ็นเอจากใบตามที่อธิบาย Dellaporta
et al, (1984) ดีเอ็นเอ (10? กรัม) ถูกย่อยด้วย Bgl II (Fermentas)
electrophoresed ในเจล agarose 0.8% และเปื้อนบน Hybond
เยื่อ N + ไนล่อน (Amersham) ลำดับดีเอ็นเอที่เฉพาะเจาะจงได้รับการ
ตรวจพบโดยการผสมข้ามพันธุ์กับ 32P ป้ายสอบสวนดีเอ็นเอที่ประกอบไปด้วย
ลำดับ dermaseptin สมบูรณ์ การติดฉลากของวัดได้รับการ
ดำเนินการโดยใช้รองพื้นแบบสุ่ม Prime-ยีนชุด (Promega)
ก่อนการผสมพันธุ์และการผสมข้ามพันธุ์ได้ดำเนินการที่ 63 ◦Cใน
การแก้ปัญหาการผสมข้ามพันธุ์คริสตจักร (โบสถ์และกิลเบิร์ 1984) สำหรับ
2 และ 16 ชั่วโมง, ตามลำดับ หลังจากผสมพันธุ์เยื่อถูก
ล้างใน 2 ×
SSC, 0.1% SDS เป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิห้องแล้ว
ในการแก้ปัญหาเดียวกันสำหรับ 15 นาทีที่ 63 ◦Cและในที่สุดก็ล้างใน 0.2 ×
SSC, 0.1% SDS ที่ 63 ◦Cสำหรับ 15 นาที blots ได้สัมผัสแล้ว Xray
ภาพยนตร์หรือวิเคราะห์โดยใช้พายุ 840 ระบบ PhosphorImager
(Amersham)
2.8 ในการตรวจการติดเชื้อของพืชและการวิเคราะห์ทางสถิติ
ยีนและไม่พันธุ์พืชส้มหวานได้รับการขยายพันธุ์
โดยการปลูกถ่ายอวัยวะบนต้นตอมะนาวหยาบ ไม่ใช่พันธุ์
พืชถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุม ใบทั้งหมดที่ใช้ในการตรวจการติดเชื้อ
อยู่ในวัยเดียวกันและสภาพทางสรีรวิทยา การตรวจการติดเชื้อ
กับพืชส้มหวานได้ดำเนินการในห้องการเจริญเติบโต
ที่ 26 ◦Cและแสง 16 ชั่วโมงแสง การฉีดวัคซีนกับเอ็กซ์
axonopodis pv citri (1
×
105 cfu / ml) ได้รับการดำเนินการโดยใช้
วิธีการรายงานโดยยางและคณะ (2010) ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย
ด้วยเหตุนี้พื้นผิว abaxial ใบถูกเจาะก่อนหน้านี้
กับเข็มผ่านการฆ่าเชื้อที่สองพื้นที่ที่อยู่ติดตั้งอยู่ที่ด้านข้างทั้งสอง
ของ midvein ใบ แต่ละพื้นที่ประกอบด้วย 8 เข็มแยกออก
จากกันโดย 2 มมระยะทาง ระงับเชื้อแบคทีเรียได้รับการ
ฉีดพ่นบนพื้นผิวของใบ abaxial จากระยะ 3 ซม
พื้นที่เจาะแต่ละคนได้ฉีดพ่นครั้งที่สามในช่วงเวลาสั้น ๆ
แต่ละทดสอบรวม ​​9-12 ใบขยายตัวได้เต็มที่ต่อแต่ละพันธุ์
พืชและการตรวจซ้ำ 3 ครั้ง การสังเกต
อาการโรคแคงเกอร์ที่ถูกสร้างขึ้นโดยใช้แว่นขยายมือถือ
และถูกถ่ายภาพโดยใช้กล้องขยาย 2000 C
(Zeiss) ความถี่ของการก่อโรคแคงเกอร์จะแสดงเป็น (เปื่อยทั้งหมด
/ จำนวนเข็มทั้งหมด)
×
100 นอกจากนี้ตามจำนวน
ของเปื่อยพัฒนาแต่ละใบแต่ละบุคคลได้รับการจัดเป็นระดับต่ำ
(1-4 เข้าเฝือก), ปานกลาง (5-8 เข้าเฝือก) หรือสูง (9-16 เข้าเฝือก) การติดเชื้อ
ประเภท ผลลัพธ์ที่ได้แสดงเป็นร้อยละของใบ
ที่อยู่ในประเภทการติดเชื้อแต่ละสอดคล้องพันธุ์
พืช

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . สายพันธุ์แบคทีเรียและวัฒนธรรมเงื่อนไข
x axonopodis PV . citri และ X . campestris pv . การศึกษาความเครียด
8004 ได้กรุณาให้โดย ดร. castagnaro ( eeaoc , อาร์เจนตินา และ ดร. vojnov )
( Centro C é sar มิลสไตน์ , อาร์เจนตินา ) ตามลำดับ
แบคทีเรียปลูกที่ 28 ◦ extract สารสกัดจากยีสต์ –ซี ( malt extract
( พิม ) ( สารอาหาร ( 5 กรัม / ลิตร Bacto extract ,3 กรัมต่อลิตรและสารสกัดจากยีสต์
Bacto 3 กรัม / ลิตร Bacto malt extract ) เสริมด้วยดี กูลโคส
กับความเข้มข้นสุดท้าย 1% ( w / v ) สำหรับการเติบโตในแผ่น พิมถูก
แข็งกับ 1.5 % ( w / v ) วุ้นให้ pym-a. สำหรับใช้ใน planta
เดียว , อาณานิคมถูกเลือกย้ายของเหลวพิมกลาง
และเติบโตค้างคืนที่ 200 รอบต่อนาทีในเครื่องปั่นหมุนที่ 28 ◦แบคทีเรีย
Cเซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวโดย 3 ใน 10 มิลลิเมตร และ resuspended
ชุดเพื่อความเข้มข้นสุดท้าย 1

105 × c.f.u. / มล.
2.2 . การใช้สารยับยั้งการเจริญเติบโตของ axonopodis
X และ X . campestris โดย dermaseptin สังเคราะห์

( malwktmlkklgtmalhagkaalgaaadtisqgtq ) ซีรั่มตาม osusky et al . ( 2005 ) สั้น ๆ , 90  l
เพาะเชื้อในอาหารเหลว ( 1 ×พิม

107 เซลล์ / มิลลิลิตร
เลี้ยงในหลอดบรรจุ 10 ลิตรเพนดอร์ฟ  dermaseptin
เจือจาง . การควบคุมระยะเวลาที่มีเพียงน้ำรวม
incubations จำนวน 25 ◦องศาเซลเซียสเป็นเวลา 4 ชั่วโมง ภายใต้สั่นอย่างต่อเนื่อง
เจือจางในพิมกลางและการแพร่กระจายบนแผ่น pym-a . อาณานิคม
นับสำหรับการรักษาแต่ละแสดงหลังจากบ่มเป็นเวลา 48 ชั่วโมง 28 ◦
.
2.3 โครงสร้างทางพันธุกรรม
ดีเอ็นเอที่มีลำดับ
จากเทป dermaseptin phyllomedusa sauvagii การเข้ารหัส , กะหล่ำดอกฝังไวรัส 35s โปรโมเตอร์
ยาสูบทำด้วยโมเสคไวรัส  Enhancer , esporamine
Pre เปปไทด์เปปไทด์สัญญาณ ( สัญญาณการส่งออก apoplastic ) และโนปาลีน
และถอดความการลำดับ ( รีเวโร et al . ,
2012 ) เป็นยีนที่ย่อยด้วยเอนไซม์ Hind III เว็บไซต์ของ pbin19sgfp ไบนารี
เวกเตอร์ ( Chiu et al . ,1996 ) ผลการตั้งชื่อ
pbin19sgfp เดอร์ ( รูปที่ 2A ) การเปลี่ยนแปลงกับ pbin19sgfp
เวกเตอร์ช่วยให้เลือกต้นแคลลัสใน kanamycincontaining
ขนาดกลางหรือโดยการแสดงโดยตรงในการแสดงออกของ GFP .
2.4 . การเพาะเลี้ยงพืช
internodal ได้จาก 6 ถึง 12 เดือนเก่า
หวานส้ม ( ส้มเช้ง . osbeck พันธุ์ สับปะรด )
ต้นกล้าที่ปลูกในสภาพโรงเรือน ลำต้นส่วน
ในแปลงประมาณ 1-cm ยาว สำหรับการเพาะเลี้ยงอยู่
,
( Agrobacterium tumefaciens ร่วมปลูกด้วยถ่ายยีนพบในสายพันธุ์ EHA105 เมื่อย ) แบก pbin19sgfp der ก่อสร้าง
transformants คัดเลือกในอาหารสูตร Murashige and Skoog
BAP ความเข้มข้น 100 มก. / ล. และ regenerating
เหตุผลตาจัดการคัดกรองภายใต้ stereomicroscope สำหรับ
GFP เรืองแสงด้วย เคล็ดลับในการยิงบวกกราฟต์บน
ตัดหัว ต้นอ่อนของส้มทร เยอร์ซิเตรนจ์ ( poncirus trifoliata ( L . )
RAF
×
c ไซแนนซิส ( L . ) osbeck ) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( PE ˜ na et al . ,
1995 ) หลังจาก 3 – 4 สัปดาห์ มีประกันฯ โดยการแสดงตนของ dermaseptin
PCR และลำดับการใช้ GFP
เฉพาะคู่ไพรเมอร์เดอร์ FW ( 5  - tggctctttggaagactatgc-3  )
แล้วก็ RV ( 5  - gctgatactatttctcaaggaactcaa-3  ) และ GFP FW ( 5  -
atggtgagcaagggcgagga-3  ) และ GFP RV ( 5  - ggaccatgtgatcgcgcttc -
3  ) ตามลำดับ แล้ว โดยในด้านบวกคือ ต้นแข็งแรง หยาบ มะนาว ( ส้ม
6 เดือน jambhiri เขียวชอุ่ม ) ต้นตอ
และโตในการเจริญเติบโตไม่มี ที่ 26 ◦ C ภายใต้แสง 16 h-light
.
2.5การแทรกซึมของแบคทีเรียช่วงล่างของใบ )
5

A . tumefaciens × 106 c.f.u. / มิลลิลิตร ) และ X .
axonopodis PV . citri ( 1 × 105

c.f.u. / ml ) แทรกซึมอยู่ที่พื้นผิวซื้อสิทธิ์ขายเสียง
อย่างเต็มที่ขยายขนะ benthamiana ใบไม้ตาม
วิธีการรายงานโดย Metz et al . ( 2005 ) การทดลอง
ทำซ้ำ 3 ครั้ง และแต่ละวิธีมี 5 โรงงาน บุกรุก
ได้ดำเนินการใน 3 ใบต่อต้น
2.6 การสกัด DNA และ
การวิเคราะห์ RT-PCR เพื่อการสกัด DNA , 200 มิลลิกรัมของยีนและการควบคุมใบส้มหวาน
คือพื้นดินใต้ไนโตรเจนเหลวใน trizol รีเอเจนต์
( Invitrogen ) ตัวอย่าง RNA ถูก resuspended 50  l rnasefree
น้ำและบ่มด้วย rq1 เลสฟรีตรวจหา ADNase ( promega )
เพื่อลบร่องรอยดีเอ็นเอ ก่อนนี้ การสังเคราะห์ cDNA า
การใช้ iscript การสังเคราะห์ cDNA Kit ( ห้องปฏิบัติการราดไบโอ ) : PCR assay ขาด reverse transcriptase ถูกดำเนินการเป็น
ควบคุมการปนเปื้อน DNA การแสดงออกของยีนในพืช dermaseptin
ลำดับและใช้ der FW
เดอร์ RV และรองพื้น การ actin B ลำดับนะครับ ใช้เป็นระบบควบคุมภายใน ถูกตรวจพบใช้ทำ FW
( 5  - tggtcgtaccaccggtattgtgtt-3  )
และทำ RV ( 5  - tcacttgcccatcaggaagctcat-3  ) รองพื้น ยี่สิบสี่
รอบได้ทั้งบันทึกและวิเคราะห์โดยวิธีอิเล็กโทรโฟรีซีสในเจล 2 %
.
2.7 . เปรอะเปื้อน
ภาคใต้รวมการวิเคราะห์ดีเอ็นเอจากใบตามที่อธิบายไว้โดย dellaporta
et al . ( 1984 ) ดีเอ็นเอ ( 10  g ) ตัดด้วย BGL II ( fermentas )
electrophoresed ในเจล ( 0.8% hybond
เปื้อนบนและเอ็นไนล่อนหุ้ม ( ชาม ) เฉพาะลำดับ DNA มีเบสกับ 32p
พบว่าดีเอ็นเอโพรบประกอบด้วย
ลำดับ dermaseptin สมบูรณ์ การแสดงฉลากของการสอบสวนคือ
ขับร้องโดยรองพื้นสุ่มโดยใช้ prime-a-gene Kit ( promega )
( ก่อนทำและทดลองที่ 63 ◦ C
โซลูชั่น hybridization ของโบสถ์ ( คริสตจักรและกิลเบิร์ต , 1984 )
2 และ 16 ชั่วโมงตามลำดับ หลังจาก hybridization membranes )
ซัก 2 ×
SSC 0.1% เป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิห้องแล้ว
ในวิธีเดียวกันสำหรับ 15 นาทีที่ 63 ◦ C , และสุดท้าย ซัก 0.2 ×
SSC 0.1% SDS ที่ 63 ◦เป็นเวลา 15 นาทีแล้วเปิดรับ Xray
blots หรือภาพยนตร์โดยใช้พายุ 840 phosphorimager ระบบ
( ชาม ) .
2.8 . ในการติดเชื้อและ
planta ) สถิติที่ใช้ในการวิเคราะห์ข้อมูลการแสดงออกของยีน และไม่หวาน ส้มปลูกขยายพันธุ์โดยตอนกิ่งมะนาวบนต้นตอ
หยาบ ไม่ดัดแปลงพันธุกรรม
พืชใช้เป็นตัวควบคุม ทุกใบใช้ในการติดเชื้อ )
ก็อายุเท่ากันและเงื่อนไขทางสรีรวิทยา การติดเชื้อ )
กับพืชส้มหวาน มีการปฏิบัติในการ◦ห้อง
ที่ 26 องศาเซลเซียส และไม่ไวต่อช่วงแสง 16 h-light . ใช้กับ X .
axonopodis PV . citri ( 1 ×

105 c.f.u. / ml ) คือการใช้
วิธีรายงานโดยหยาง et al . ( 2010 ) ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย
จบเรื่องนี้ ใบซื้อสิทธิ์ขายเสียงพื้นผิวที่เคยเจาะด้วยเข็มปลอดเชื้อที่ติดกัน

สองพื้นที่อยู่ทั้งสองด้านของใบ เส้นกึ่งกลางใบไม้ . แต่ละพื้นที่ประกอบด้วย 8 เจาะแยก
จากแต่ละอื่น ๆโดย 2-mm ระยะทาง
bacterial suspension คือฉีดพ่นบนพื้นผิวที่อยู่ห่างจากแกนของใบ จากระยะทาง 3 ซม.
แต่ละพื้นที่ถูกพ่นทะลุสามครั้งในช่วงเวลาสั้น ๆ รวม 9 – 12
แต่ละการทดสอบอย่างเต็มที่ขยายใบต่อต้นพืชและวิธี =
แต่ละซ้ำ 3 ครั้ง สังเกตอาการของโรคแคงเกอร์ได้

ใช้แว่นขยายมือถือและได้ถ่ายภาพโดยใช้ 2000-c stereomicroscope
( เสริม )ความถี่ของการเกิดเปื่อยจะแสดงเป็น ( รวมเปื่อย
จำนวนรวมเจาะ ) ×

100 นอกจากนี้ ตามจํานวน
ของเทสลาพัฒนาแต่ละใบแต่ละตามน้อย
( 1 – 4 cankers ) ปานกลาง ( 5 – 8 cankers ) หรือสูง ( 9 - 16 cankers ) ประเภทของการติดเชื้อ

ผลลัพธ์ที่ได้แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของใบ
เป็นของแต่ละประเภทสำหรับการติดเชื้อที่จำลอง
พืช