Enzyme assayThe extraction was perf

Enzyme assay
The extraction was performed according to the method of Ozeki
et al. (1987) with some modifications. The following procedures for
protein extraction were conducted at 4
C. Grape skin (3 g) was
ground with a mortar and pestle in liquid nitrogen until a fine powder
was obtained. The skin powder was homogenized with 15 ml of
a 250 mM TRIS–HCl buffer (pH 7.5) containing 10 mM polyethylene
glycol 3400, 20 mM Na-diethyldithiocarbamate, 2 mM
dithiothreitol, and 14 mM of 2-mercaptoethanol. After centrifugation
of the homogenate at 9400 g for 20 min, 1 g of Dowex 134 (HClform,
equilibrated with the same buffer as above) was added to the
supernatant. The supernatant was incubated for 20 min on ice with
gentle stirring and centrifuged again at 4900 g for 5 min. Solid
ammonium sulphate was added to the supernatant to achieve 30%
saturation, and the mixture was centrifuged at 9400 g for 10 min.
Protein was precipitated from the supernatant by adding ammonium
sulphate to 70% final saturation, and the sample was centrifuged at
9400 g for 30 min. The protein pellet was resuspended in 2.5 ml of
a 25 mM TRIS–HCl buffer (pH 7.5). The extract was passed through
a PD10 column (Sephadex G-25, GE Healthcare, Amersham, Bucks,
UK) equilibrated with a 25 mM TRIS–HCl buffer (pH 7.5). The
desalted crude extract was used as the enzyme solution in the
following enzyme assay. The method of Ford et al. (1998) was
employed with some modifications for the analysis of UFGT activity.
The reaction mixture consisted of 100 ll of a 100 mM TRIS–HCl
buffer (pH 8.0), 10 mM polyethylene glycol 3400, 20 mM
Na-diethyldithiocarbamate, 2 mM dithiothreitol, and 14 mM of
2-mercaptoethanol, 0.1 mM cyanidin chloride, 10 mM UDP-glucose,
and 100 ll of an enzyme solution. The assay mixture was incubated
for 6 min at 30
C. The reaction was terminated by adding 150 ll of
5% HCl. The quantity of the product, namely cyanidin 3-glucoside
was measured using HPLC at 520 nm. One unit of UFGT was
defined as the production of 1 mol of cyanidin 3-glucoside per
second, and UFGT activity was expressed as kat g
1 protein. The
protein concentration was determined using the Bio-Rad Quick Start
kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) based on the Bradford technique.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วิเคราะห์เอนไซม์สกัดได้ดำเนินการตามวิธีการของ Ozekial. ร้อยเอ็ด (1987) ด้วยการปรับเปลี่ยนบางอย่าง ขั้นตอนต่อไปนี้ได้ดำเนินการสกัดโปรตีนที่ค. 4 ถูกผิวองุ่น (3 กรัม)พื้นดินกับครก และ pestle ในไนโตรเจนเหลวจนเป็นผงละเอียดได้รับ ผงผิวถูก homogenized เป็นกลุ่มกับ 15 ml ของเป็น 250 มม.ตรี – HCl บัฟเฟอร์ (pH 7.5) มี 10 มม.เอทิลีนglycol 3400 นา diethyldithiocarbamate, 2 มม. 20 มม.dithiothreitol และ 14 มม.ของ 2 mercaptoethanol หลังจาก centrifugationของ homogenate ที่ 9400 g สำหรับ 20 นาที 1 กรัมของ Dowex 134 (HClformequilibrated กับบัฟเฟอร์เดียวกับข้างบน) ถูกเพิ่มไปsupernatant Supernatant ถูก incubated สำหรับ 20 นาทีบนน้ำแข็งด้วยอ่อนโยนกวน และ centrifuged ที่ g 4900 สำหรับ 5 นาทีของแข็งอีกครั้งแอมโมเนียมซัลเฟตมีเพิ่ม supernatant ให้ 30%ความเข้ม และส่วนผสมถูก centrifuged ที่ 9400 g สำหรับ 10 นาทีโปรตีนตกตะกอนจาก supernatant ที่เพิ่มแอมโมเนียมี centrifuged ซัลเฟตเข้มสุดท้าย 70% และตัวอย่างที่9400 กรัมสำหรับ 30 นาที เม็ดโปรตีนถูก resuspended ใน 2.5 ml ของเป็น 25 มม.ตรี – HCl บัฟเฟอร์ (pH 7.5) สารสกัดได้ผ่านคอลัมน์ PD10 (Sephadex G 25 สุขอนามัยการ GE, Amersham, Bucksสหราชอาณาจักร) equilibrated ด้วย 25 มม.ตรี – HCl บัฟเฟอร์ (pH 7.5) ที่มีใช้สารสกัดหยาบ desalted เป็นโซลูชันเอนไซม์ในการต่อไปนี้วิเคราะห์เอนไซม์ มีวิธีการของฟอร์ดและ al. (1998)ทำงาน ด้วยการปรับเปลี่ยนบางอย่างสำหรับการวิเคราะห์ของกิจกรรม UFGTส่วนผสมปฏิกิริยาประกอบด้วย 100 จะ 100 มม.ตรี – HClบัฟเฟอร์ (pH 8.0), 10 มม. polyethylene glycol 3400, 20 มม.นา diethyldithiocarbamate, dithiothreitol มม. 2 และ 14 มม.ของ2-mercaptoethanol, 0.1 mM cyanidin คลอไรด์ กลูโคส UDP, 10 มม.และ 100 จะเป็นโซลูชั่นเอนไซม์ ผสมทดสอบถูก incubatedใน 6 นาทีที่ 30 ซี ปฏิกิริยาที่ถูกยกเลิก โดยเพิ่ม 150 จะของ5% HCl ปริมาณของสินค้า คือ cyanidin 3 glucosideถูกวัดโดยใช้ HPLC ที่ 520 nm เป็นหน่วยหนึ่งของ UFGTกำหนดเป็นการผลิตของ 1 โมลของ cyanidin glucoside 3 ต่อที่สอง และกิจกรรม UFGT ถูกแสดงเป็น kat โปรตีน g 1 ที่กำหนดความเข้มข้นของโปรตีนใช้การไบราษฎร์ด่วนเริ่มต้นชุด (Bio Rad เฮอร์คิวลิส CA, USA) ตามเทคนิคแบรดฟอร์ด

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ทดสอบเอนไซม์สกัดที่ได้ดำเนินการตามวิธีการของ Ozeki et al, (1987) ที่มีการปรับเปลี่ยนบางอย่าง ขั้นตอนต่อไปสำหรับการสกัดโปรตีนได้ดำเนินการใน 4 องศาเซลเซียส ผิวองุ่น (3 กรัม) ถูกบดด้วยครกและสากในไนโตรเจนเหลวจนเป็นผงละเอียดที่ได้รับ ผงผิวทำให้เป็นเนื้อเดียวกันกับ 15 มิลลิลิตร250 มิลลิบัฟเฟอร์ทริสเรทติ้ง-HCl (pH 7.5) ที่มีเอทิลินมิลลิ 10 นไกลคอล 3400, 20 มิลลิ ณ diethyldithiocarbamate 2 มิลลิdithiothreitol และ 14 มิลลิ 2-mercaptoethanol หลังจากการหมุนเหวี่ยงของ homogenate ที่ 9400 กรัมเป็นเวลา 20 นาที, 1 กรัม Dowex 134 (HClform, equilibrated กับบัฟเฟอร์เดียวกับด้านบน) ถูกเพิ่มลงในสารละลาย สารละลายถูกบ่มเป็นเวลา 20 นาทีบนน้ำแข็งกับกวนอ่อนโยนและหมุนเหวี่ยงอีกครั้งที่4,900 กรัมเป็นเวลา 5 นาที ของแข็งแอมโมเนียมซัลเฟตถูกบันทึกอยู่ในสารละลายเพื่อให้บรรลุ 30% ความอิ่มตัวของสีและส่วนผสมที่ได้รับการหมุนเหวี่ยงที่ 9,400 กรัมเป็นเวลา 10 นาที. โปรตีนได้รับการตกตะกอนจากสารละลายโดยการเพิ่มแอมโมเนียมซัลเฟต 70% อิ่มตัวสุดท้ายและตัวอย่างที่ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 9400 กรัม เป็นเวลา 30 นาที โปรตีนเม็ดที่ถูก resuspended ใน 2.5 มิลลิลิตร25 มิลลิบัฟเฟอร์ทริสเรทติ้ง-HCl (pH 7.5) สารสกัดได้ผ่านคอลัมน์ PD10 (ที่ Sephadex G-25, GE Healthcare, Amersham เหรียญสหราชอาณาจักร) equilibrated กับ 25 มิลลิบัฟเฟอร์ทริสเรทติ้ง-HCl (pH 7.5) สารสกัด desalted ถูกใช้เป็นวิธีการแก้ปัญหาการทำงานของเอนไซม์ในการทดสอบการทำงานของเอนไซม์ดังต่อไปนี้ วิธีการของฟอร์ดเอตอัล (1998) ได้รับการจ้างงานมีการปรับเปลี่ยนบางอย่างสำหรับการวิเคราะห์ของกิจกรรมUFGT ได้. ผสมปฏิกิริยาประกอบด้วย 100 LL 100 มิลลิทริสเรทติ้ง-HCl บัฟเฟอร์ (pH 8.0) พลาสติกคอลมิลลิ 10 3400, 20 มิลลิณ diethyldithiocarbamate 2 มิลลิ dithiothreitol และ 14 มิลลิของ2 mercaptoethanol 0.1 มิลลิคลอไรด์ cyanidin 10 มิลลิ UDP-กลูโคสและ100 LL ของการแก้ปัญหาเอนไซม์ ส่วนผสมทดสอบที่ได้รับการบ่มเป็นเวลา 6 นาทีที่ 30 องศาเซลเซียส ปฏิกิริยาถูกยกเลิกโดยการเพิ่ม 150 LL ของ5% HCl ปริมาณของผลิตภัณฑ์คือ cyanidin 3 glucoside ถูกวัดโดยใช้วิธี HPLC ที่ 520 นาโนเมตร หนึ่งหน่วยของ UFGT ได้รับการกำหนดให้เป็นผลิต1 โมลของ cyanidin 3 glucoside ต่อวินาทีและกิจกรรมUFGT ถูกแสดงเป็น kat กรัม 1 โปรตีน ความเข้มข้นของโปรตีนที่ถูกกำหนดโดยใช้ Bio-Rad เริ่มต้นอย่างรวดเร็วชุด(Bio-Rad ดาว, CA, USA) ตามเทคนิค Bradford

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ในการสกัดเอนไซม์
การปฏิบัติตามวิธีการของโอเซกิ
et al . ( 1987 ) มีการปรับเปลี่ยน ต่อไปนี้การสําหรับ
การสกัดโปรตีนจำนวน 4
ซีองุ่นผิว ( 3 g )
พื้นดินมีครกและสากในไนโตรเจนเหลวจน
ผงละเอียดได้ . ผิวผงบด 15 ml 250 มม. นอกจากนี้ –
HCl บัฟเฟอร์ pH 75 ) ที่มีโพลีเอททีลีนไกลคอล , 10 mm
20 มม. na diethyldithiocarbamate 2 mm
บัตรแข็งและ 14 มม. อย่างเดียว . หลังการปั่นเหวี่ยง
ของปริมาณที่ 9400 G 20 นาที 1 กรัม ดังนั้น 134 ( hclform
equilibrated , บัฟเฟอร์เดียวกันกับข้างบน ) คือเพิ่ม
น่าน . และน่านถูกบ่มนาน 20 นาทีบนน้ำแข็งด้วย
อ่อนโยนกวนไฟฟ้าอีก 4 , 900 กรัม เป็นเวลา 5 นาที แข็ง
แอมโมเนียมซัลเฟตเพิ่มให้สูงเพื่อให้บรรลุ 30 %
ความอิ่มตัวของสี และส่วนผสมระดับที่ 9400 G 10 นาที
โปรตีนตกตะกอน จากที่นำโดยการเพิ่มน้ำ 70 %
: สุดท้ายความอิ่มตัวของสี และกลุ่มตัวอย่างที่มีระดับที่
กรัมเป็นเวลา 30 นาที โปรตีนในการผลิต resuspended 2.5 มล.
25 มม. นอกจากนี้ – ไฮโดรคลอไรด์บัฟเฟอร์ pH 7.5 ) สารสกัดที่ได้ผ่านการ pd10 คอลัมน์ ( Sephadex g-25 , GE Healthcare ที่ bucks ,
, , UK ) equilibrated กับ 25 มม. นอกจากนี้– HCl บัฟเฟอร์ pH 7.5 )
desalted สกัดใช้เป็นสารละลายเอนไซม์เอนไซม์ใน
ต่อไปนี้ตามลำดับ วิธีการของฟอร์ด et al . ( 1998 ) คือ
ใช้กับการปรับเปลี่ยนบางอย่างสำหรับการวิเคราะห์กิจกรรม ufgt .
ปฏิกิริยาผสมจำนวน 100 จะเป็น 100 มม. นอกจากนี้ – HCl
บัฟเฟอร์ pH 8.0 ) , polyethylene glycol 10 มม. , 20 มม.
na diethyldithiocarbamate 2 มม. บัตรแข็งและ 14 mm
อย่างเดียว คลอไรด์ ไซยานิดิน 0.1 มม. , 10 มม. UDP กลูโคส
100 จะเป็นสารละลายเอนไซม์ . ( ผสม )
6 นาทีที่ 30
C . ปฏิกิริยาที่ถูกยกเลิกโดยการเพิ่ม 150 จะ
5 % HCL .ปริมาณของผลิตภัณฑ์ ได้แก่ ไซยานิดิน 3-glucoside
ถูกวัดโดยใช้ HPLC ที่ 520 nm . หน่วยหนึ่งของ ufgt คือ
หมายถึงการผลิตของ 1 โมลของ 3-glucoside ไซยานิดิน /
2 และกิจกรรม ufgt จะแสดงเป็นแคท G
1 โปรตีน
โปรตีนถูกกำหนดโดยใช้ไบแรดเริ่มต้นอย่างรวดเร็ว
Kit ( ไบโอราด , Hercules , CA , USA ) ตามเทคนิคแบรดฟอร์ด