Experimental designn-ths feeding st

Experimental design
n-ths feeding study periods were conducted to evaluate
the efficacy of 5P as a chemoprotective agent in cultured O.niloticus.
The pre-acclimated fish were divided into 6 equal
groups. Group I was led on a basal diet (control) and the other
groups were dietary supplemented with a single graded concenration
of dried ,SP at 5,7.5, 10, 15, and 20 g kg-1 diet fed,
respectively. At the end of each month, the P53 expression level
relative to control was estimated in liver of experimental
gloups.

Tissue sampling
By the end of each month; liver specimens were collected lrom
fish representing each treatment separately. Samples were collected
in sterile 0-5 ml cryotubes, freeze, and stored at -80 C
until used.

Total RNA extraction and cDNA synthesis
Total RNA isolation waS performed using QIAmp RNA mini
kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to the manulacturer
manual. The isolated RNA was used in cDNA synthesis using
reverse transcriptase (Fermentai, EU).

Real-time PCR (qPCR)
The reaction mixture consisted of I pl cDNA, 0.5 mM oleach
primer (P53 and GAPDH as internal control), iQ SYBR
GREEN PERMIX (BIO-RAD 170-880, USA) in a total volume
of 20 pl. PCR amplification and analysis were achieved
using BIO-RAD iCycler thermal cycler and the MyiQ realtime
PCR detection system. Ali templates were amplified using
the follorn'ing Light Cycler protocol. The primer for P53 was
based on the sequence published in gene bank FJ233106.1
for O. niloticus; fqrward primer; GCATGTGGCTGATGTTGTTC
and the reverse one GCAGGATGGTGGTCATCTCT.
The fast start polymerase was activated and
cDNA denatured by a pre-incubation for 10 min at 95 oC,
the template was amplified for 40 cycles of denaturation programed
for 20 s at 95 dC, annealing of primers at 60 "C programed
for 20 s, and extension at 72oC programed for 30 s-
Fluorescent data were acquired during each extension phase.
Each assay includes triplicate samples lor Pch tested cDNAs
and no-template negative control

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การออกแบบการทดลอง
n-ths ให้อาหารระยะเวลาการศึกษาได้ดำเนินการประเมิน
ประสิทธิภาพของ 5P เป็นตัวแทนในการเพาะเลี้ยง chemoprotective O.niloticus.
ปลาก่อนปรับตัวถูกแบ่งออกเป็น 6 เท่ากัน
กลุ่ม กลุ่มที่ถูกนำตัวบนอาหารพื้นฐาน (ควบคุม) และอื่น ๆ ที่
กลุ่มที่ได้รับอาหารเสริมด้วย concenration ช้าเดียว
ของแห้ง SP ที่ 5,7.5, 10, 15, และ 20 กรัมต่อกิโลกรัม-1 อาหารเลี้ยง
ตามลำดับ ในตอนท้ายของแต่ละเดือน, P53 ระดับการแสดงออก
เมื่อเทียบกับการควบคุมเป็นที่คาดกันในตับของการทดลอง
gloups. สุ่มตัวอย่างเนื้อเยื่อในตอนท้ายของแต่ละเดือน; ตัวอย่างตับถูกเก็บรวบรวม lrom ปลาที่เป็นตัวแทนของการรักษาแต่ละแยก เก็บตัวอย่างในการฆ่าเชื้อ 0-5 มล cryotubes แช่แข็งและเก็บไว้ที่ -80 C จนใช้. สกัด RNA รวมยีนสังเคราะห์รวมแยก RNA ถูกดำเนินการโดยใช้ QIAmp RNA มินิชุด (Qiagen, ฮิลเดน, เยอรมนี) ตาม manulacturer คู่มือ . อาร์เอ็นเอที่แยกถูกนำมาใช้ในการสังเคราะห์ cDNA โดยใช้เอนไซม์ (Fermentai สหภาพยุโรป). Real-time PCR (qPCR) ผสมปฏิกิริยาประกอบด้วยฉัน pl cDNA 0.5 มิลลิ oleach ไพร (P53 และ GAPDH การควบคุมภายใน), iQ SYBR GREEN PERMIX (BIO-RAD 170-880, สหรัฐอเมริกา) ในปริมาณรวม20 pl ขยาย PCR และการวิเคราะห์ก็ประสบความสำเร็จโดยใช้ BIO-RAD ปฏิทินสาธารณะ Cycler ความร้อนและเรียลไทม์ MyiQ ระบบตรวจ PCR อาลีแม่ถูกขยายโดยใช้follorn'ing แสง Cycler โปรโตคอล ไพรเมอร์สำหรับ P53 ถูกขึ้นอยู่กับลำดับการตีพิมพ์ในธนาคารยีน FJ233106.1 สำหรับ niloticus ทุม; ไพรเมอร์ fqrward; GCATGTGGCTGATGTTGTTC และหนึ่งกลับ GCAGGATGGTGGTCATCTCT. โพลิเมอร์เริ่มต้นอย่างรวดเร็วถูกเปิดใช้งานและcDNA เอทิลแอลกอฮอล์โดยบ่มก่อนเวลา 10 นาทีที่ 95 องศาแม่แบบถูกขยายเป็น 40 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติ programed 20 s ที่ 95 DC, การหลอมของไพรเมอร์ที่ 60 "C programed 20 วินาที, และการขยายที่ 72oC programed 30 s- ข้อมูลเรืองแสงได้มาในแต่ละขั้นตอนการขยาย. ทดสอบแต่ละตัวอย่างเพิ่มขึ้นสามเท่าทีลอ Pch ทดสอบ cDNAs และไม่มีแม่แบบควบคุมเชิงลบ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ทดลองออกแบบ
n-ths ให้อาหารระยะเวลาศึกษา มีวัตถุประสงค์เพื่อประเมินประสิทธิภาพของ 5P
เป็นตัวแทนในการเพาะเลี้ยง chemoprotective o.niloticus .
ก่อนให้ปลาแบ่งออกเป็นกลุ่ม 6 เท่า

กลุ่มผมนำในอาหารพื้นฐาน ( ควบคุม ) และกลุ่มอื่น ๆเป็นอาหารเสริมด้วยเดียว

( concenration แห้ง , SP ที่ 5,7.5 , 10 , 15 และ 20 กรัม kg-1 อาหารเลี้ยง
ตามลำดับในตอนท้ายของแต่ละเดือน , กิจกรรมการแสดงออกระดับ
เมื่อเทียบกับการควบคุมประมาณในตับของ gloups ทดลอง



ตัวอย่างเนื้อเยื่อ โดยตอนท้ายของแต่ละเดือน ตัวอย่างตับเก็บ lrom
ปลาแทนการรักษาแต่ละแยก ตัวอย่างในการฆ่าเชื้อ 0-5 มิลลิลิตร
cryotubes แช่แข็งและเก็บไว้ที่ - 80 องศาเซลเซียส จนชิน



การสังเคราะห์ cDNA และการสกัดอาร์เอ็นเอทั้งหมดการแยกอาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกดำเนินการโดยใช้ชุดมินิ
rna qiamp ( QIAGEN Hilden , Germany ) ตามคู่มือ manulacturer

แยก RNA ถูกใช้ในการสังเคราะห์ cDNA ใช้
reverse transcriptase ( fermentai EU )

เวลา PCR จริง ( qpcr )
ปฏิกิริยาผสมประกอบด้วยชั้น PL cDNA , ไพรเมอร์ oleach
0.5 มม. ( ประ gapdh และการควบคุมภายใน ) ไอคิว SYBR กรีน permix
( Bio-rad 170-880 สหรัฐอเมริกา ) ใน
หมวดรวม20 ต้น PCR ( และการวิเคราะห์ยา
ใช้ Bio-rad icycler ความร้อนรอบและ myiq Realtime PCR
ตรวจสอบระบบ แม่แบบอาลีถูกขยายใช้
follorn'ing แสงวงจรตามระเบียบ ไพรเมอร์สำหรับตัวอย่างคือ
ตามลําดับที่ตีพิมพ์ในธนาคารยีน fj233106.1
สำหรับ o . niloticus ; fqrward ไพรเมอร์ gcatgtggctgatgttgttc
และย้อนกลับหนึ่ง
gcaggatggtggtcatctct .เริ่มต้นที่รวดเร็วและการเปิดใช้โดยก่อน
วิธีบ่มเป็นเวลา 10 นาทีที่ 95 OC
แม่แบบถูกขยาย 40 รอบ ( programed
20 s 95 DC , การหลอมของไพรเมอร์ที่ 60 " C โปรแกรม
20 , และส่วนขยายที่ 72oc programed 30 S -
เรืองแสง ข้อมูลที่ได้มาในแต่ละส่วนขยายเฟส แต่ละรายรวมถึงทำสำเนาสามฉบับตัวอย่างหล่อ

cdnas PCH ทดสอบและ
ลบแม่แบบการควบคุมไม่