- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
Example 6: Assessment of the deple
Example 6: Assessment of the depleting activity of H5L7BW and H5L7 by antibody dependent
cellular cytotoxicity (ADCC) in primary human T cells
The donors used in these experiments were screened for re-call responses to the CD4
antigens present in Revaxis, (Diptheria, Tetanus and Poliomyelitis) and to either a CMVpp65 peptide
pool or to a CD8 peptide pool, which contained peptide เอพิโทปs to CMV, EBV and Influenza. The
antigen used to perform initial studies was the CMVpp65 peptide pool. However, due to the limited 5 number of donors that demonstrated a re-call response to this antigen, Revaxis and the CD8 peptide
pool were the antigens used to generate the majority of the potency data for the แอนติ-LAG3
antibodies.
Peripheral blood was collected from healthy human volunteers on day 0 (25mL) and day 5
(75mL) of the experiment and was used to prepare mononuclear cells by ficollplaque density
10 gradient centrifugation. The PBMCs prepared on day 0 were labeled using the CellTrace" Violet Cell
Proliferation Kit, in accordance with the manufacturer's instructions, after which they were washed,
seeded in 24-well flat bottomed tissue culture plates at a density of 2x106/mL in medium and
stimulated with antigen (Revaxis and the CD8 peptide pool were used at a dilution of 1 in 1000; the
CMVpp65 peptide was used at a dilution of 1 in 100). The PBMCs were incubated for 5 days at 37°C
15 in a 5% CO2 humidified incubator.
Autologous donor NK cells were purified from the PBMCs prepared on day 5 of the
experiment by negative selection using kits from either Invitrogen or Miltenyi Biotec in accordance with the specific instructions of each manufacturer. The purified NK cells were counted and diluted to a density of 1.3x106/mL in medium.
20 The cells that had been stimulated with antigen for 5 days were washed, counted and
diluted to a density of 2x106/viable cells/mL in medium.
Autologous donor NK cells (80pL) and antigen activated cells (100pL) were pipetted into
round-bottomed 5mL polystyrene FACS tubes with test antibody or medium (20pL). The final
concentrations of the anti LAG-3 antibodies tested ranged from 1000 to 0.015ng/mL. The samples 25 were incubated for 18 h at 37°C in a 5% CO2 humidified incubator. After 18 h the ADCC assay
samples were analysed for the presence of antigen specific LAG-3 positive T cells using flow
cytometry. Briefly, the samples were washed in FACS buffer, blocked with human IgG (3pg/tube),
and incubated with mouse แอนติ-human CD4, CD8, CD337, CD25 and LAG-3 flurochrpme คอนจูเกตed
antibodies for 30 minutes in the dark at room temperature. After a further wash step in PBS the 30 cells were incubated in the presence of a fixable green dead cell for 30 minutes in the dark at room
temperature. The samples were finally washed with PBS, fixed and analysed by flow cytometry
using a 60 second acquisition time at a flow rate of 1pL per second.
All sample data were acquired using the BD FACSCanto II Flow Cytometer with FACS Diva
software version 6.1.3 (BD BioSciences). The Live/Dead fixable green dead cell stain was used as a 35 dead cell exclusion marker and appropriate ไอโซไทป์ and FMO-1 controls were used to define
negative populations. Briefly dead cells were omitted from the analysis using a plot of forward
scatter (FSC-A) against fluorescence in FL1 (Green dead cell stain). Doublets were then excluded
from the analysis by using a plot of FSC-W against FSC-H. Viable single lymphocytes were
33
subsequently identified and gated using a plot of forward scatter (FSC-A) against side scatter (SSC-
A). CD4 antigen specific T cells were identified from this gated population of cells using plots of CD4
fl uorescence against SSC-A and Violet Dye fluorescence against CD4 fluorescence respectively.
Antigen specific CD4 T cells were identified by a reduction of Violet Dye fluorescence. A further plot 5 of CD25 fluorescence against LAG-3 fluorescence was drawn to confirm the activation state of this
population of cells and that they expressed LAG-3. Similar plots were drawn to identify antigen
specific CD8 T cells.
The percentages of antigen specific CD4 and CD8 T cells present in each sample (as a
percentage of the viable lymphocyte population) were recorded. Nonlinear variable slope curve-fits 10 of these data were plotted and EC50 values were generated using GraphPad Prism software (v5.03).
To calculate the maximum level of การลดปริมาณ observed in an assay, at the highest
concentration of antibody tested, the following formula was used: (1-(% Antigen specific T cells remaining after antibody treatment )/(% Antigen specific T cells remaining in the absence of antibody))*100.
15 Potency data for the การลดปริมาณ of LAG3 positive antigen specific CD8 and CD4 T cells by
H5L7BW and H5L7 was generated using the in vitro assay system detailed above. H5L7BW induced การลดปริมาณ of LAG3 positive antigen specific CD4 and CD8 T cells by ADCC in six of the seven donors studied for disappearance of the respective cell types. The potency of H5L7BW in antigen specific CD4 T cells, as quantified by EC50 values, ranged from 14pg/mL to 3.4ng/mL with maximum levels
20 of การลดปริมาณ ranging from 44 to 78%. The potency of this antibody in antigen specific LAG-3 positive
CD8 T cells ranged from 122pg/mL to 17.5ng/mL, with maximum levels of การลดปริมาณ ranging from
39 to 87%. H5L7 mediated low levels of การลดปริมาณ, or was inactive, in the donors studied.
Example 7: Assessment of the depleting activity of H5L7BW and H5L7 in an in-vivo human
25 PBMC/mouse SCID xenograft model
This assay describes the use of a human PBMC/mouse SCID xenograft model to assess in
vivo การลดปริมาณ efficacy of the โมโนโคลนอล, fully ฮิวเมไนซ์, อะฟิวโคซิเลตเตด LAG-3 depleting antibody
H5L7BW on activated human T cells. Healthy volunteer peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) 30 were isolated and stimulated overnight (แอนติ-CD3, IL-12) to induce LAG-3 expression prior to
injection into the peritoneum of immuno-compromised SCID mice. LAG-3 depleting or control
antibodies were either co-administered into the peritoneum or injected intravenously.
การลดปริมาณ of LAG-3 positive cells was assessed by flow cytometry in peritoneal lavage samples 5 or 24 hours after cell injection.
35 Mice were injected with activated huPBMCs (4 x 106- 2 x 107cells in 0.4ml of PBS) by the
intraperitoneal route. Depending on the particular study route, LAG-3 antibodies or huIgG1 BioWa controls were either co-administered i.p. with the huPBMCs or mice were pre-treated intravenously 18h prior to huPBMC injection. 5 or 24 hours post-cell injection, mice were euthanized, a peritoneal
34
lavage was performed and the cellular content of the lavage buffer analysed by flow cytometry. Briefly, peritoneal lavage involved 3 x 5m1 washes of the intact peritoneal cavity using cold PBS containing 3mM EDTA.
All sample data were acquired using the BD FACSCanto II Flow Cytometer with FACS Diva 5 software version 6.1.3 (BD BioSciences). Approximately 1 x 106 cells (where possible) were added
per FACS tube, the cell suspensions centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes, and the pellet then re-
suspended in 3m1 PBS. The supernatants were then carefully decanted and the cell pellets re-
suspended in 100p1 cold FACS wash buffer. 15p1 FcR Blocking Reagent was then added per tube
and the cells incubated for 10 minutes at room temperature. 5p1 of each staining antibody (10p1 of 10 1:100 pre-diluted แอนติ-LAG-3 blocking/detection antibody 17B4-PE) or ไอโซไทป์ control were then
added respectively and incubated for 20 minutes at room temperature protected from light. The
cells were subsequently washed by addition of 4 ml FACS buffer per tube and centrifugation at 1500
rpm for 5 minutes after which the supernatant was carefully decanted. This washing step was
repeated. Finally the cells were re-suspended in 300p1 FACS buffer and analysed by flow cytometry. 15 In addition to LAG-3 detection by use of the fluorescently labeled LAG-3 blocking antibody 17B4-PE,
the following T cell and activation markers were used for T cell phenotyping: CD45, CD4, CD8, and
CD25. Percentages of CD4 and CD8 .T cells were expressed as percentage of CD45 positive cells.
LAG-3 positive T cell populations were expressed as percentages of their parent populations CD4
and CD8.
20 FACS Diva software version 6.1.3 was used to generate batch analyses of individual cell
counts/events and cell population percentages. Data were analysed with SAS version 9.2.2 software using a generalized linear model for binomial data. This analysis directly models the cell count as a proportion of the parent population. In this way, the size of the parent population is taken into
account during the analysis. Means were calculated for proportions of target cell type for each 25 treatment, along with 95% confidence intervals. These were expressed as percentages.
Planned comparisons of treatments versus Control were made using odds ratios. This
expresses the odds of having a target cell type in one treatment as a ratio to the odds of having the
target cell type on control treatment. An odds ratio < 1 would indicate a reduced odds of having the
cell type in the treatment of interest compared to the control. An odds ratio < 1 would indicate a 30 reduced odds of having the cell type in the treatment of interest compared to the control.
All experiments were performed using PBMCs from individual healthy blood donors and due
to the large blood volumes required per experiment, no donor was used more than once. LAG-3
expression levels after overnight stimulation varied greatly between donors (ranging from 2-73%
cell surface expression) but these differences in expression levels had no effect
cellular cytotoxicity (ADCC) in primary human T cells
The donors used in these experiments were screened for re-call responses to the CD4
antigens present in Revaxis, (Diptheria, Tetanus and Poliomyelitis) and to either a CMVpp65 peptide
pool or to a CD8 peptide pool, which contained peptide เอพิโทปs to CMV, EBV and Influenza. The
antigen used to perform initial studies was the CMVpp65 peptide pool. However, due to the limited 5 number of donors that demonstrated a re-call response to this antigen, Revaxis and the CD8 peptide
pool were the antigens used to generate the majority of the potency data for the แอนติ-LAG3
antibodies.
Peripheral blood was collected from healthy human volunteers on day 0 (25mL) and day 5
(75mL) of the experiment and was used to prepare mononuclear cells by ficollplaque density
10 gradient centrifugation. The PBMCs prepared on day 0 were labeled using the CellTrace" Violet Cell
Proliferation Kit, in accordance with the manufacturer's instructions, after which they were washed,
seeded in 24-well flat bottomed tissue culture plates at a density of 2x106/mL in medium and
stimulated with antigen (Revaxis and the CD8 peptide pool were used at a dilution of 1 in 1000; the
CMVpp65 peptide was used at a dilution of 1 in 100). The PBMCs were incubated for 5 days at 37°C
15 in a 5% CO2 humidified incubator.
Autologous donor NK cells were purified from the PBMCs prepared on day 5 of the
experiment by negative selection using kits from either Invitrogen or Miltenyi Biotec in accordance with the specific instructions of each manufacturer. The purified NK cells were counted and diluted to a density of 1.3x106/mL in medium.
20 The cells that had been stimulated with antigen for 5 days were washed, counted and
diluted to a density of 2x106/viable cells/mL in medium.
Autologous donor NK cells (80pL) and antigen activated cells (100pL) were pipetted into
round-bottomed 5mL polystyrene FACS tubes with test antibody or medium (20pL). The final
concentrations of the anti LAG-3 antibodies tested ranged from 1000 to 0.015ng/mL. The samples 25 were incubated for 18 h at 37°C in a 5% CO2 humidified incubator. After 18 h the ADCC assay
samples were analysed for the presence of antigen specific LAG-3 positive T cells using flow
cytometry. Briefly, the samples were washed in FACS buffer, blocked with human IgG (3pg/tube),
and incubated with mouse แอนติ-human CD4, CD8, CD337, CD25 and LAG-3 flurochrpme คอนจูเกตed
antibodies for 30 minutes in the dark at room temperature. After a further wash step in PBS the 30 cells were incubated in the presence of a fixable green dead cell for 30 minutes in the dark at room
temperature. The samples were finally washed with PBS, fixed and analysed by flow cytometry
using a 60 second acquisition time at a flow rate of 1pL per second.
All sample data were acquired using the BD FACSCanto II Flow Cytometer with FACS Diva
software version 6.1.3 (BD BioSciences). The Live/Dead fixable green dead cell stain was used as a 35 dead cell exclusion marker and appropriate ไอโซไทป์ and FMO-1 controls were used to define
negative populations. Briefly dead cells were omitted from the analysis using a plot of forward
scatter (FSC-A) against fluorescence in FL1 (Green dead cell stain). Doublets were then excluded
from the analysis by using a plot of FSC-W against FSC-H. Viable single lymphocytes were
33
subsequently identified and gated using a plot of forward scatter (FSC-A) against side scatter (SSC-
A). CD4 antigen specific T cells were identified from this gated population of cells using plots of CD4
fl uorescence against SSC-A and Violet Dye fluorescence against CD4 fluorescence respectively.
Antigen specific CD4 T cells were identified by a reduction of Violet Dye fluorescence. A further plot 5 of CD25 fluorescence against LAG-3 fluorescence was drawn to confirm the activation state of this
population of cells and that they expressed LAG-3. Similar plots were drawn to identify antigen
specific CD8 T cells.
The percentages of antigen specific CD4 and CD8 T cells present in each sample (as a
percentage of the viable lymphocyte population) were recorded. Nonlinear variable slope curve-fits 10 of these data were plotted and EC50 values were generated using GraphPad Prism software (v5.03).
To calculate the maximum level of การลดปริมาณ observed in an assay, at the highest
concentration of antibody tested, the following formula was used: (1-(% Antigen specific T cells remaining after antibody treatment )/(% Antigen specific T cells remaining in the absence of antibody))*100.
15 Potency data for the การลดปริมาณ of LAG3 positive antigen specific CD8 and CD4 T cells by
H5L7BW and H5L7 was generated using the in vitro assay system detailed above. H5L7BW induced การลดปริมาณ of LAG3 positive antigen specific CD4 and CD8 T cells by ADCC in six of the seven donors studied for disappearance of the respective cell types. The potency of H5L7BW in antigen specific CD4 T cells, as quantified by EC50 values, ranged from 14pg/mL to 3.4ng/mL with maximum levels
20 of การลดปริมาณ ranging from 44 to 78%. The potency of this antibody in antigen specific LAG-3 positive
CD8 T cells ranged from 122pg/mL to 17.5ng/mL, with maximum levels of การลดปริมาณ ranging from
39 to 87%. H5L7 mediated low levels of การลดปริมาณ, or was inactive, in the donors studied.
Example 7: Assessment of the depleting activity of H5L7BW and H5L7 in an in-vivo human
25 PBMC/mouse SCID xenograft model
This assay describes the use of a human PBMC/mouse SCID xenograft model to assess in
vivo การลดปริมาณ efficacy of the โมโนโคลนอล, fully ฮิวเมไนซ์, อะฟิวโคซิเลตเตด LAG-3 depleting antibody
H5L7BW on activated human T cells. Healthy volunteer peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) 30 were isolated and stimulated overnight (แอนติ-CD3, IL-12) to induce LAG-3 expression prior to
injection into the peritoneum of immuno-compromised SCID mice. LAG-3 depleting or control
antibodies were either co-administered into the peritoneum or injected intravenously.
การลดปริมาณ of LAG-3 positive cells was assessed by flow cytometry in peritoneal lavage samples 5 or 24 hours after cell injection.
35 Mice were injected with activated huPBMCs (4 x 106- 2 x 107cells in 0.4ml of PBS) by the
intraperitoneal route. Depending on the particular study route, LAG-3 antibodies or huIgG1 BioWa controls were either co-administered i.p. with the huPBMCs or mice were pre-treated intravenously 18h prior to huPBMC injection. 5 or 24 hours post-cell injection, mice were euthanized, a peritoneal
34
lavage was performed and the cellular content of the lavage buffer analysed by flow cytometry. Briefly, peritoneal lavage involved 3 x 5m1 washes of the intact peritoneal cavity using cold PBS containing 3mM EDTA.
All sample data were acquired using the BD FACSCanto II Flow Cytometer with FACS Diva 5 software version 6.1.3 (BD BioSciences). Approximately 1 x 106 cells (where possible) were added
per FACS tube, the cell suspensions centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes, and the pellet then re-
suspended in 3m1 PBS. The supernatants were then carefully decanted and the cell pellets re-
suspended in 100p1 cold FACS wash buffer. 15p1 FcR Blocking Reagent was then added per tube
and the cells incubated for 10 minutes at room temperature. 5p1 of each staining antibody (10p1 of 10 1:100 pre-diluted แอนติ-LAG-3 blocking/detection antibody 17B4-PE) or ไอโซไทป์ control were then
added respectively and incubated for 20 minutes at room temperature protected from light. The
cells were subsequently washed by addition of 4 ml FACS buffer per tube and centrifugation at 1500
rpm for 5 minutes after which the supernatant was carefully decanted. This washing step was
repeated. Finally the cells were re-suspended in 300p1 FACS buffer and analysed by flow cytometry. 15 In addition to LAG-3 detection by use of the fluorescently labeled LAG-3 blocking antibody 17B4-PE,
the following T cell and activation markers were used for T cell phenotyping: CD45, CD4, CD8, and
CD25. Percentages of CD4 and CD8 .T cells were expressed as percentage of CD45 positive cells.
LAG-3 positive T cell populations were expressed as percentages of their parent populations CD4
and CD8.
20 FACS Diva software version 6.1.3 was used to generate batch analyses of individual cell
counts/events and cell population percentages. Data were analysed with SAS version 9.2.2 software using a generalized linear model for binomial data. This analysis directly models the cell count as a proportion of the parent population. In this way, the size of the parent population is taken into
account during the analysis. Means were calculated for proportions of target cell type for each 25 treatment, along with 95% confidence intervals. These were expressed as percentages.
Planned comparisons of treatments versus Control were made using odds ratios. This
expresses the odds of having a target cell type in one treatment as a ratio to the odds of having the
target cell type on control treatment. An odds ratio < 1 would indicate a reduced odds of having the
cell type in the treatment of interest compared to the control. An odds ratio < 1 would indicate a 30 reduced odds of having the cell type in the treatment of interest compared to the control.
All experiments were performed using PBMCs from individual healthy blood donors and due
to the large blood volumes required per experiment, no donor was used more than once. LAG-3
expression levels after overnight stimulation varied greatly between donors (ranging from 2-73%
cell surface expression) but these differences in expression levels had no effect
0/5000
Example 6: Assessment of the depleting activity of H5L7BW and H5L7 by antibody dependentcellular cytotoxicity (ADCC) in primary human T cellsThe donors used in these experiments were screened for re-call responses to the CD4antigens present in Revaxis, (Diptheria, Tetanus and Poliomyelitis) and to either a CMVpp65 peptide pool or to a CD8 peptide pool, which contained peptide เอพิโทปs to CMV, EBV and Influenza. The antigen used to perform initial studies was the CMVpp65 peptide pool. However, due to the limited 5 number of donors that demonstrated a re-call response to this antigen, Revaxis and the CD8 peptide pool were the antigens used to generate the majority of the potency data for the แอนติ-LAG3 antibodies.Peripheral blood was collected from healthy human volunteers on day 0 (25mL) and day 5 (75mL) of the experiment and was used to prepare mononuclear cells by ficollplaque density 10 gradient centrifugation. The PBMCs prepared on day 0 were labeled using the CellTrace" Violet Cell Proliferation Kit, in accordance with the manufacturer's instructions, after which they were washed, seeded in 24-well flat bottomed tissue culture plates at a density of 2x106/mL in medium and stimulated with antigen (Revaxis and the CD8 peptide pool were used at a dilution of 1 in 1000; the CMVpp65 peptide was used at a dilution of 1 in 100). The PBMCs were incubated for 5 days at 37°C15 in a 5% CO2 humidified incubator.Autologous donor NK cells were purified from the PBMCs prepared on day 5 of theexperiment by negative selection using kits from either Invitrogen or Miltenyi Biotec in accordance with the specific instructions of each manufacturer. The purified NK cells were counted and diluted to a density of 1.3x106/mL in medium.20 The cells that had been stimulated with antigen for 5 days were washed, counted anddiluted to a density of 2x106/viable cells/mL in medium.Autologous donor NK cells (80pL) and antigen activated cells (100pL) were pipetted into round-bottomed 5mL polystyrene FACS tubes with test antibody or medium (20pL). The final concentrations of the anti LAG-3 antibodies tested ranged from 1000 to 0.015ng/mL. The samples 25 were incubated for 18 h at 37°C in a 5% CO2 humidified incubator. After 18 h the ADCC assay samples were analysed for the presence of antigen specific LAG-3 positive T cells using flow cytometry. Briefly, the samples were washed in FACS buffer, blocked with human IgG (3pg/tube), and incubated with mouse แอนติ-human CD4, CD8, CD337, CD25 and LAG-3 flurochrpme คอนจูเกตed antibodies for 30 minutes in the dark at room temperature. After a further wash step in PBS the 30 cells were incubated in the presence of a fixable green dead cell for 30 minutes in the dark at room temperature. The samples were finally washed with PBS, fixed and analysed by flow cytometry using a 60 second acquisition time at a flow rate of 1pL per second.
All sample data were acquired using the BD FACSCanto II Flow Cytometer with FACS Diva
software version 6.1.3 (BD BioSciences). The Live/Dead fixable green dead cell stain was used as a 35 dead cell exclusion marker and appropriate ไอโซไทป์ and FMO-1 controls were used to define
negative populations. Briefly dead cells were omitted from the analysis using a plot of forward
scatter (FSC-A) against fluorescence in FL1 (Green dead cell stain). Doublets were then excluded
from the analysis by using a plot of FSC-W against FSC-H. Viable single lymphocytes were
33
subsequently identified and gated using a plot of forward scatter (FSC-A) against side scatter (SSC-
A). CD4 antigen specific T cells were identified from this gated population of cells using plots of CD4
fl uorescence against SSC-A and Violet Dye fluorescence against CD4 fluorescence respectively.
Antigen specific CD4 T cells were identified by a reduction of Violet Dye fluorescence. A further plot 5 of CD25 fluorescence against LAG-3 fluorescence was drawn to confirm the activation state of this
population of cells and that they expressed LAG-3. Similar plots were drawn to identify antigen
specific CD8 T cells.
The percentages of antigen specific CD4 and CD8 T cells present in each sample (as a
percentage of the viable lymphocyte population) were recorded. Nonlinear variable slope curve-fits 10 of these data were plotted and EC50 values were generated using GraphPad Prism software (v5.03).
To calculate the maximum level of การลดปริมาณ observed in an assay, at the highest
concentration of antibody tested, the following formula was used: (1-(% Antigen specific T cells remaining after antibody treatment )/(% Antigen specific T cells remaining in the absence of antibody))*100.
15 Potency data for the การลดปริมาณ of LAG3 positive antigen specific CD8 and CD4 T cells by
H5L7BW and H5L7 was generated using the in vitro assay system detailed above. H5L7BW induced การลดปริมาณ of LAG3 positive antigen specific CD4 and CD8 T cells by ADCC in six of the seven donors studied for disappearance of the respective cell types. The potency of H5L7BW in antigen specific CD4 T cells, as quantified by EC50 values, ranged from 14pg/mL to 3.4ng/mL with maximum levels
20 of การลดปริมาณ ranging from 44 to 78%. The potency of this antibody in antigen specific LAG-3 positive
CD8 T cells ranged from 122pg/mL to 17.5ng/mL, with maximum levels of การลดปริมาณ ranging from
39 to 87%. H5L7 mediated low levels of การลดปริมาณ, or was inactive, in the donors studied.
Example 7: Assessment of the depleting activity of H5L7BW and H5L7 in an in-vivo human
25 PBMC/mouse SCID xenograft model
This assay describes the use of a human PBMC/mouse SCID xenograft model to assess in
vivo การลดปริมาณ efficacy of the โมโนโคลนอล, fully ฮิวเมไนซ์, อะฟิวโคซิเลตเตด LAG-3 depleting antibody
H5L7BW on activated human T cells. Healthy volunteer peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) 30 were isolated and stimulated overnight (แอนติ-CD3, IL-12) to induce LAG-3 expression prior to
injection into the peritoneum of immuno-compromised SCID mice. LAG-3 depleting or control
antibodies were either co-administered into the peritoneum or injected intravenously.
การลดปริมาณ of LAG-3 positive cells was assessed by flow cytometry in peritoneal lavage samples 5 or 24 hours after cell injection.
35 Mice were injected with activated huPBMCs (4 x 106- 2 x 107cells in 0.4ml of PBS) by the
intraperitoneal route. Depending on the particular study route, LAG-3 antibodies or huIgG1 BioWa controls were either co-administered i.p. with the huPBMCs or mice were pre-treated intravenously 18h prior to huPBMC injection. 5 or 24 hours post-cell injection, mice were euthanized, a peritoneal
34
lavage was performed and the cellular content of the lavage buffer analysed by flow cytometry. Briefly, peritoneal lavage involved 3 x 5m1 washes of the intact peritoneal cavity using cold PBS containing 3mM EDTA.
All sample data were acquired using the BD FACSCanto II Flow Cytometer with FACS Diva 5 software version 6.1.3 (BD BioSciences). Approximately 1 x 106 cells (where possible) were added
per FACS tube, the cell suspensions centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes, and the pellet then re-
suspended in 3m1 PBS. The supernatants were then carefully decanted and the cell pellets re-
suspended in 100p1 cold FACS wash buffer. 15p1 FcR Blocking Reagent was then added per tube
and the cells incubated for 10 minutes at room temperature. 5p1 of each staining antibody (10p1 of 10 1:100 pre-diluted แอนติ-LAG-3 blocking/detection antibody 17B4-PE) or ไอโซไทป์ control were then
added respectively and incubated for 20 minutes at room temperature protected from light. The
cells were subsequently washed by addition of 4 ml FACS buffer per tube and centrifugation at 1500
rpm for 5 minutes after which the supernatant was carefully decanted. This washing step was
repeated. Finally the cells were re-suspended in 300p1 FACS buffer and analysed by flow cytometry. 15 In addition to LAG-3 detection by use of the fluorescently labeled LAG-3 blocking antibody 17B4-PE,
the following T cell and activation markers were used for T cell phenotyping: CD45, CD4, CD8, and
CD25. Percentages of CD4 and CD8 .T cells were expressed as percentage of CD45 positive cells.
LAG-3 positive T cell populations were expressed as percentages of their parent populations CD4
and CD8.
20 FACS Diva software version 6.1.3 was used to generate batch analyses of individual cell
counts/events and cell population percentages. Data were analysed with SAS version 9.2.2 software using a generalized linear model for binomial data. This analysis directly models the cell count as a proportion of the parent population. In this way, the size of the parent population is taken into
account during the analysis. Means were calculated for proportions of target cell type for each 25 treatment, along with 95% confidence intervals. These were expressed as percentages.
Planned comparisons of treatments versus Control were made using odds ratios. This
expresses the odds of having a target cell type in one treatment as a ratio to the odds of having the
target cell type on control treatment. An odds ratio < 1 would indicate a reduced odds of having the
cell type in the treatment of interest compared to the control. An odds ratio < 1 would indicate a 30 reduced odds of having the cell type in the treatment of interest compared to the control.
All experiments were performed using PBMCs from individual healthy blood donors and due
to the large blood volumes required per experiment, no donor was used more than once. LAG-3
expression levels after overnight stimulation varied greatly between donors (ranging from 2-73%
cell surface expression) but these differences in expression levels had no effect
All sample data were acquired using the BD FACSCanto II Flow Cytometer with FACS Diva
software version 6.1.3 (BD BioSciences). The Live/Dead fixable green dead cell stain was used as a 35 dead cell exclusion marker and appropriate ไอโซไทป์ and FMO-1 controls were used to define
negative populations. Briefly dead cells were omitted from the analysis using a plot of forward
scatter (FSC-A) against fluorescence in FL1 (Green dead cell stain). Doublets were then excluded
from the analysis by using a plot of FSC-W against FSC-H. Viable single lymphocytes were
33
subsequently identified and gated using a plot of forward scatter (FSC-A) against side scatter (SSC-
A). CD4 antigen specific T cells were identified from this gated population of cells using plots of CD4
fl uorescence against SSC-A and Violet Dye fluorescence against CD4 fluorescence respectively.
Antigen specific CD4 T cells were identified by a reduction of Violet Dye fluorescence. A further plot 5 of CD25 fluorescence against LAG-3 fluorescence was drawn to confirm the activation state of this
population of cells and that they expressed LAG-3. Similar plots were drawn to identify antigen
specific CD8 T cells.
The percentages of antigen specific CD4 and CD8 T cells present in each sample (as a
percentage of the viable lymphocyte population) were recorded. Nonlinear variable slope curve-fits 10 of these data were plotted and EC50 values were generated using GraphPad Prism software (v5.03).
To calculate the maximum level of การลดปริมาณ observed in an assay, at the highest
concentration of antibody tested, the following formula was used: (1-(% Antigen specific T cells remaining after antibody treatment )/(% Antigen specific T cells remaining in the absence of antibody))*100.
15 Potency data for the การลดปริมาณ of LAG3 positive antigen specific CD8 and CD4 T cells by
H5L7BW and H5L7 was generated using the in vitro assay system detailed above. H5L7BW induced การลดปริมาณ of LAG3 positive antigen specific CD4 and CD8 T cells by ADCC in six of the seven donors studied for disappearance of the respective cell types. The potency of H5L7BW in antigen specific CD4 T cells, as quantified by EC50 values, ranged from 14pg/mL to 3.4ng/mL with maximum levels
20 of การลดปริมาณ ranging from 44 to 78%. The potency of this antibody in antigen specific LAG-3 positive
CD8 T cells ranged from 122pg/mL to 17.5ng/mL, with maximum levels of การลดปริมาณ ranging from
39 to 87%. H5L7 mediated low levels of การลดปริมาณ, or was inactive, in the donors studied.
Example 7: Assessment of the depleting activity of H5L7BW and H5L7 in an in-vivo human
25 PBMC/mouse SCID xenograft model
This assay describes the use of a human PBMC/mouse SCID xenograft model to assess in
vivo การลดปริมาณ efficacy of the โมโนโคลนอล, fully ฮิวเมไนซ์, อะฟิวโคซิเลตเตด LAG-3 depleting antibody
H5L7BW on activated human T cells. Healthy volunteer peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) 30 were isolated and stimulated overnight (แอนติ-CD3, IL-12) to induce LAG-3 expression prior to
injection into the peritoneum of immuno-compromised SCID mice. LAG-3 depleting or control
antibodies were either co-administered into the peritoneum or injected intravenously.
การลดปริมาณ of LAG-3 positive cells was assessed by flow cytometry in peritoneal lavage samples 5 or 24 hours after cell injection.
35 Mice were injected with activated huPBMCs (4 x 106- 2 x 107cells in 0.4ml of PBS) by the
intraperitoneal route. Depending on the particular study route, LAG-3 antibodies or huIgG1 BioWa controls were either co-administered i.p. with the huPBMCs or mice were pre-treated intravenously 18h prior to huPBMC injection. 5 or 24 hours post-cell injection, mice were euthanized, a peritoneal
34
lavage was performed and the cellular content of the lavage buffer analysed by flow cytometry. Briefly, peritoneal lavage involved 3 x 5m1 washes of the intact peritoneal cavity using cold PBS containing 3mM EDTA.
All sample data were acquired using the BD FACSCanto II Flow Cytometer with FACS Diva 5 software version 6.1.3 (BD BioSciences). Approximately 1 x 106 cells (where possible) were added
per FACS tube, the cell suspensions centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes, and the pellet then re-
suspended in 3m1 PBS. The supernatants were then carefully decanted and the cell pellets re-
suspended in 100p1 cold FACS wash buffer. 15p1 FcR Blocking Reagent was then added per tube
and the cells incubated for 10 minutes at room temperature. 5p1 of each staining antibody (10p1 of 10 1:100 pre-diluted แอนติ-LAG-3 blocking/detection antibody 17B4-PE) or ไอโซไทป์ control were then
added respectively and incubated for 20 minutes at room temperature protected from light. The
cells were subsequently washed by addition of 4 ml FACS buffer per tube and centrifugation at 1500
rpm for 5 minutes after which the supernatant was carefully decanted. This washing step was
repeated. Finally the cells were re-suspended in 300p1 FACS buffer and analysed by flow cytometry. 15 In addition to LAG-3 detection by use of the fluorescently labeled LAG-3 blocking antibody 17B4-PE,
the following T cell and activation markers were used for T cell phenotyping: CD45, CD4, CD8, and
CD25. Percentages of CD4 and CD8 .T cells were expressed as percentage of CD45 positive cells.
LAG-3 positive T cell populations were expressed as percentages of their parent populations CD4
and CD8.
20 FACS Diva software version 6.1.3 was used to generate batch analyses of individual cell
counts/events and cell population percentages. Data were analysed with SAS version 9.2.2 software using a generalized linear model for binomial data. This analysis directly models the cell count as a proportion of the parent population. In this way, the size of the parent population is taken into
account during the analysis. Means were calculated for proportions of target cell type for each 25 treatment, along with 95% confidence intervals. These were expressed as percentages.
Planned comparisons of treatments versus Control were made using odds ratios. This
expresses the odds of having a target cell type in one treatment as a ratio to the odds of having the
target cell type on control treatment. An odds ratio < 1 would indicate a reduced odds of having the
cell type in the treatment of interest compared to the control. An odds ratio < 1 would indicate a 30 reduced odds of having the cell type in the treatment of interest compared to the control.
All experiments were performed using PBMCs from individual healthy blood donors and due
to the large blood volumes required per experiment, no donor was used more than once. LAG-3
expression levels after overnight stimulation varied greatly between donors (ranging from 2-73%
cell surface expression) but these differences in expression levels had no effect
การแปล กรุณารอสักครู่..
ตัวอย่างที่ 6: การประเมินกิจกรรมที่พึ่งพาของ H5L7BW และ H5L7
โดยแอนติบอดีขึ้นอยู่กับพิษโทรศัพท์มือถือ(ADCC) ในมนุษย์หลัก T เซลล์ผู้บริจาคที่ใช้ในการทดลองเหล่านี้ถูกคัดกรองสำหรับการตอบสนองกลับมาเรียกร้องให้CD4 แอนติเจนในปัจจุบัน Revaxis (Diptheria บาดทะยัก และโปลิโอ) และเปปไทด์ทั้ง CMVpp65 สระว่ายน้ำหรือสระว่ายน้ำเปปไทด์ CD8 ซึ่งประกอบด้วยเปปไทด์เอพิโทปที่จะ CMV, EBV และไข้หวัดใหญ่ แอนติเจนใช้ในการดำเนินการศึกษาเริ่มต้นเป็นสระว่ายน้ำเปปไทด์ CMVpp65 แต่เนื่องจากการ จำกัด จำนวน 5 ของผู้บริจาคที่แสดงให้เห็นถึงการตอบสนองกลับมาเรียกร้องให้แอนติเจนนี้ Revaxis และเปปไทด์ CD8 สระว่ายน้ำมีแอนติเจนที่ใช้ในการสร้างส่วนใหญ่ของข้อมูลความแรงสำหรับแอนติ -LAG3 แอนติบอดี. เลือดอุปกรณ์ต่อพ่วง ถูกเก็บรวบรวมจากอาสาสมัครมนุษย์มีสุขภาพดีในวันที่ 0 (25ml) และวันที่ 5 (75ml) ของการทดลองและใช้ในการเตรียมเซลล์โมโนนิวเคลียร์โดยความหนาแน่นของ ficollplaque 10 ปั่นแยกลาด PBMCs เตรียมในวันที่ 0 มีป้ายใช้ CellTrace "ม่วงเซลล์ขยายชุดตามคำแนะนำของผู้ผลิตหลังจากที่พวกเขาได้รับการล้างเมล็ดใน24 หลุมแบนจานเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อจุดต่ำสุดที่อัตราความหนาแน่น 2x106 / มิลลิลิตรในขนาดกลางและกระตุ้นด้วยแอนติเจน (Revaxis และสระว่ายน้ำเปปไทด์ CD8 ถูกนำมาใช้ในการลดสัดส่วนของ 1 ใน 1000 นั้นเปปไทด์CMVpp65 ถูกนำมาใช้ในการลดสัดส่วนของ 1 ใน 100). โดย PBMCs ถูกบ่มเป็นเวลา 5 วันที่ 37 ° C 15 ใน 5% CO2 ความชื้นศูนย์บ่มเพาะ. Autologous ผู้บริจาคเซลล์ NK ถูกบริสุทธิ์จาก PBMCs ที่จัดทำขึ้นในวันที่ 5 ของการทดลองโดยการเลือกเชิงลบโดยใช้ชุดจากทั้งInvitrogen หรือ Miltenyi Biotec สอดคล้องกับคำแนะนำของผู้ผลิตแต่ละราย. โดยบริสุทธิ์เซลล์ NK นับและลดลง ความหนาแน่นของ 1.3x106 / มิลลิลิตรในสื่อก. 20 เซลล์ที่ได้รับการกระตุ้นด้วยแอนติเจนเป็นเวลา 5 วันถูกล้างนับและเจือจางความหนาแน่นของ2x106 / เซลล์ / มิลลิลิตรในระดับปานกลาง. Autologous ผู้บริจาคเซลล์ NK (80pL) และแอนติเจน เปิดใช้งานเซลล์ (100pL) เป็นปิเปตเข้ามาในรอบต่ำสุดหลอดไตรีนมาซึ่ง5ml กับแอนติบอดีทดสอบหรือขนาดกลาง (20pL) สุดท้ายความเข้มข้นของการต่อต้าน LAG-3 แอนติบอดีทดสอบตั้งแต่ 1000 ถึง 0.015ng / มิลลิลิตร กลุ่มตัวอย่าง 25 ถูกบ่มเป็นเวลา 18 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสใน CO2 5% ความชื้นศูนย์บ่มเพาะ หลังจาก 18 ชั่วโมงการทดสอบ ADCC ตัวอย่างวิเคราะห์การปรากฏตัวของแอนติเจน LAG-3 เฉพาะเซลล์บวก T ใช้ไหลภูมิคุ้มกัน สั้น ๆ ตัวอย่างถูกล้างในบัฟเฟอร์มาซึ่งถูกปิดกั้นด้วย IgG มนุษย์ (3PG / หลอด) และบ่มด้วยเมาส์แอนติ -human CD4, CD8, CD337, CD25 และ LAG-3 flurochrpme คอนจูเกตเอ็ดแอนติบอดีเป็นเวลา30 นาที ในที่มืดที่อุณหภูมิห้อง หลังจากขั้นตอนต่อไปในการล้างพีบีเอส 30 เซลล์ถูกบ่มในการปรากฏตัวของเซลล์ที่ตายแล้วแน่นอนสีเขียวเป็นเวลา 30 นาทีในที่มืดที่ห้องอุณหภูมิ กลุ่มตัวอย่างเป็นที่สุดกับการล้างพีบีเอสคงที่และ Analysed โดยการไหล cytometry ใช้ 60 สองการเข้าซื้อกิจการครั้งที่ไหลอัตรา 1PL ต่อวินาที. ทั้งหมดตัวอย่างข้อมูลที่ได้มาใช้BD FACSCanto ครั้งที่สองที่มีการไหล cytometer Diva มาซึ่งซอฟแวร์เวอร์ชั่น6.1.3 ( BD ชีววิทยาศาสตร์) สด / ตายแน่นอนสีเขียวคราบเซลล์ที่ตายแล้วถูกใช้เป็นเครื่องหมาย 35 ยกเว้นเซลล์ที่ตายแล้วและเหมาะสมไอโซไทป์และ FMO-1 ตัวถูกนำมาใช้ในการกำหนดประชากรเชิงลบ สั้น ๆ เซลล์ที่ตายแล้วถูกตัดออกจากการวิเคราะห์โดยใช้พล็อตไปข้างหน้ากระจาย(FSC-A) กับการเรืองแสงใน FL1 (สีเขียวคราบเซลล์ที่ตายแล้ว) doublets แล้วได้รับการยกเว้นจากการวิเคราะห์โดยใช้พล็อตของFSC-W กับ FSC-H เซลล์เม็ดเลือดขาวทำงานได้เพียงครั้งเดียวเป็น33 ระบุภายหลังรั้วรอบขอบชิดและใช้พล็อตที่กระจายไปข้างหน้า (FSC-A) กับด้านกระจาย (SSC- A) แอนติเจนที่เฉพาะเจาะจง CD4 T เซลล์ที่ถูกระบุจากประชาชนในรั้วรอบขอบชิดของเซลล์โดยใช้แปลงของ CD4 ชั้น uorescence กับ SSC-A และเรืองแสงสีม่วงกับสีย้อมเรืองแสง CD4 ตามลำดับ. Antigen เซลล์เฉพาะ CD4 T โดยระบุว่าการลดลงของการเรืองแสงสีย้อมม่วง พล็อตอีก 5 ของการเรืองแสงเรืองแสงกับ CD25 LAG-3 ถูกดึงออกมาเพื่อยืนยันการเปิดใช้งานรัฐนี้ประชากรของเซลล์และที่พวกเขาแสดงความLAG-3 แปลงที่คล้ายกันถูกดึงไประบุแอนติเจนที่เฉพาะเจาะจง CD8 T เซลล์. เปอร์เซ็นต์ของแอนติเจนที่เฉพาะเจาะจง CD4 และเซลล์ CD8 T อยู่ในแต่ละตัวอย่าง (เป็นอัตราร้อยละของประชากรเม็ดเลือดขาวทำงานได้) ที่ถูกบันทึกไว้ ลาดตัวแปรเชิงเส้นโค้งพอดี 10 ของข้อมูลเหล่านี้ได้รับการพล็อตและค่า EC50 ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ซอฟแวร์ปริซึม GraphPad (v5.03). การคำนวณในระดับสูงสุดของการลดปริมาณการปฏิบัติในการทดสอบเป็นที่สูงสุดความเข้มข้นของแอนติบอดีทดสอบที่สูตรต่อไปนี้ถูกนำมาใช้ (1 - (% Antigen เฉพาะ T เซลล์ที่เหลืออยู่หลังการรักษาแอนติบอดี) / (% Antigen เฉพาะ T เซลล์ที่เหลืออยู่ในตัวตนของแอนติบอดี)) * 100. 15 ข้อมูลศักยภาพสำหรับการลดปริมาณของแอนติเจน LAG3 บวกที่เฉพาะเจาะจง และ CD8 CD4 ทีเซลล์โดยH5L7BW และ H5L7 ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ระบบการทดสอบในหลอดทดลองรายละเอียดข้างต้น H5L7BW เหนี่ยวนำให้เกิดการลดปริมาณของแอนติเจน LAG3 บวก CD4 และ CD8 เฉพาะ T เซลล์โดย ADCC ในหกเจ็ดบริจาคศึกษาการหายตัวไปของเซลล์ชนิดนั้น ความแรงของ H5L7BW ในเซลล์แอนติเจนที่เฉพาะเจาะจง CD4 T เป็นวัดโดย EC50 ค่าตั้งแต่ 14pg / มิลลิลิตรเพื่อ 3.4ng / มิลลิลิตรที่มีระดับสูงสุดที่20 ของการลดปริมาณตั้งแต่ 44-78% ความแรงของแอนติบอดีในแอนติเจน LAG-3 ที่เฉพาะเจาะจงในเชิงบวกเซลล์CD8 T ตั้งแต่ 122pg / มิลลิลิตรเพื่อ 17.5ng / mL มีระดับสูงสุดของการลดปริมาณตั้งแต่39 ไป 87% H5L7 พึ่งระดับต่ำของการลดปริมาณหรือเป็นงานในผู้บริจาคศึกษา. ตัวอย่างที่ 7: การประเมินกิจกรรมที่พึ่งพาของ H5L7BW และ H5L7 ในมนุษย์ในร่างกาย25 PBMC / เมาส์ SCID xenograft รูปแบบการทดสอบนี้อธิบายการใช้ที่มนุษย์ PBMC / เมาส์ SCID xenograft รูปแบบในการประเมินในร่างกายการลดปริมาณการรับรู้ความสามารถของโมโนโคลนอลอย่างเต็มที่ฮิวเมไนซ์, อะฟิวโคซิเลตเตด LAG-3 พึ่งพาแอนติบอดีH5L7BW ในทีเซลล์ของมนุษย์เปิดใช้งาน สุขภาพอาสาสมัครเซลล์โลหิตโมโนนิวเคลียร์ (PBMCs) 30 ที่แยกได้ในชั่วข้ามคืนและกระตุ้น (แอนติ -CD3, IL-12) ที่จะทำให้เกิดการแสดงออก LAG-3 ก่อนที่จะฉีดเข้าไปในเยื่อบุช่องท้องของภูมิคุ้มกันที่ถูกบุกรุกหนูSCID LAG-3 พึ่งพาหรือการควบคุมแอนติบอดีทั้งร่วมบริหารงานเข้าไปในเยื่อบุช่องท้องหรือฉีดเข้าเส้นเลือดดำ. การลดปริมาณของ LAG-3 เซลล์บวกได้รับการประเมินโดยการไหลภูมิคุ้มกันในตัวอย่างล้างช่องท้อง 5 หรือ 24 ชั่วโมงหลังจากการฉีดเซลล์. 35 หนูถูกฉีดด้วย huPBMCs เปิดใช้งาน (4 x 2 x 106- 107cells ใน 0.4ml ของพีบีเอส) โดยเส้นทางเข้าช่องท้อง ทั้งนี้ขึ้นอยู่กับเส้นทางการศึกษาโดยเฉพาะอย่างยิ่ง LAG-3 แอนติบอดีหรือ huIgG1 ควบคุมไบโอว่ามีทั้งทรัพย์สินทางปัญญาร่วมกับยา huPBMCs หรือหนูที่ได้รับการรับการรักษาก่อนฉีดเข้าเส้นเลือดดำ 18h ก่อนที่จะมีการฉีด huPBMC 5 หรือ 24 ชั่วโมงหลังการฉีดเซลล์หนูถูก euthanized เป็นช่องท้อง34 ล้างได้รับการดำเนินการและเนื้อหาที่โทรศัพท์มือถือของบัฟเฟอร์ล้างวิเคราะห์โดย cytometry ไหล สั้น ๆ ที่เกี่ยวข้องกับการล้างช่องท้อง 3 x 5m1 ล้างของช่องท้องเหมือนเดิมโดยใช้พีบีเอสที่มีความหนาวเย็น 3mm EDTA. ทุกข้อมูลตัวอย่างที่ได้มาใช้ BD FACSCanto ครั้งที่สองที่มีการไหล cytometer มาซึ่ง Diva 5 ซอฟต์แวร์รุ่น 6.1.3 (BD ชีววิทยาศาสตร์) ประมาณ 1 x 106 เซลล์ (ที่เป็นไปได้) ที่ถูกเพิ่มต่อท่อมาซึ่งแขวนลอยเซลล์หมุนเหวี่ยงที่1,500 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาทีและเม็ดจากนั้นอีกครั้งระงับใน3M1 พีบีเอส supernatants ถูกแล้ว decanted อย่างระมัดระวังและเม็ดมือถืออีกครั้งที่ลอยอยู่ในอากาศหนาวเย็นมาซึ่ง100p1 ล้างบัฟเฟอร์ 15p1 FCR ปิดกั้นรีเอเจนถูกบันทึกแล้วต่อท่อและเซลล์บ่มเป็นเวลา10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง 5p1 ของแต่ละแอนติบอดีย้อมสี (10p1 10 1: 100 ก่อนปรับลดแอนติ -LAG-3 ปิดกั้น / การตรวจสอบแอนติบอดี 17B4-PE) หรือไอโซไทป์การควบคุมจากนั้นก็เพิ่มตามลำดับและบ่มเป็นเวลา20 นาทีที่อุณหภูมิห้องป้องกันจาก แสง เซลล์ถูกล้างภายหลังจากการเพิ่มขึ้นของ 4 มลบัฟเฟอร์มาซึ่งต่อท่อและหมุนเหวี่ยงที่ 1,500 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 5 นาทีหลังจากที่ใสถูก decanted อย่างระมัดระวัง ขั้นตอนการซักผ้านี้ได้ซ้ำแล้วซ้ำอีก ในที่สุดเซลล์ที่ถูกระงับอีกครั้งในบัฟเฟอร์มาซึ่ง 300p1 และวิเคราะห์โดย cytometry ไหล 15 นอกจาก LAG-3 โดยการตรวจสอบการใช้งานของแอนติบอดี้ที่มีข้อความ fluorescently LAG-3 ปิดกั้น 17B4-PE, เซลล์ T ต่อไปและยืนยันการใช้งานเครื่องหมายถูกนำมาใช้สำหรับเซลล์ phenotyping T: CD45, CD4, CD8 และCD25 ร้อยละของ CD4 และ CD8 เซลล์ .T ถูกแสดงเป็นร้อยละของเซลล์ CD45 บวก. LAG-3 ประชากรเซลล์ T บวกแสดงเป็นร้อยละของประชากรผู้ปกครอง CD4 และ CD8. 20 มาซึ่งซอฟต์แวร์รุ่น Diva 6.1.3 ถูกใช้ในการสร้างชุดการวิเคราะห์ ของเซลล์แต่ละเซลล์นับ/ กิจกรรมและเซลล์เปอร์เซ็นต์ของประชากร วิเคราะห์ข้อมูลกับรุ่น SAS 9.2.2 ซอฟแวร์โดยใช้แบบจำลองเชิงเส้นทั่วไปข้อมูลทวินาม การวิเคราะห์นี้รุ่นโดยตรงจำนวนเซลล์ในขณะที่สัดส่วนของประชากรผู้ปกครอง ด้วยวิธีนี้ขนาดของประชากรที่ผู้ปกครองจะนำเข้าบัญชีในช่วงการวิเคราะห์ หมายถึงการได้รับการคำนวณสัดส่วนของชนิดเซลล์เป้าหมายสำหรับแต่ละ 25 รักษาพร้อมกับช่วงความเชื่อมั่น 95% เหล่านี้ถูกแสดงเป็นร้อยละ. การเปรียบเทียบตามแผนของการรักษาเมื่อเทียบกับการควบคุมที่ถูกสร้างขึ้นโดยใช้อัตราส่วนราคาต่อรอง นี้เป็นการแสดงออกถึงอัตราต่อรองของการมีเซลล์ชนิดหนึ่งในเป้าหมายของการรักษาเป็นอัตราส่วนราคาต่อรองของการมีที่ชนิดเซลล์เป้าหมายเกี่ยวกับการรักษาควบคุม อัตราส่วนราคาต่อรอง <1 จะบ่งชี้ถึงอัตราต่อรองลดลงของการมีเซลล์ชนิดในการรักษาที่น่าสนใจเมื่อเทียบกับการควบคุม อัตราส่วนราคาต่อรอง <1 จะแสดงให้เห็น 30 อัตราต่อรองลดลงของการมีเซลล์ชนิดในการรักษาที่น่าสนใจเมื่อเทียบกับการควบคุม. การทดลองทั้งหมดถูกดำเนินการโดยใช้ PBMCs จากบุคคลผู้บริจาคโลหิตที่มีสุขภาพดีและเนื่องจากการปริมาณเลือดขนาดใหญ่ที่จำเป็นต่อการทดลองไม่มีผู้บริจาคถูกนำมาใช้มากกว่าหนึ่งครั้ง LAG 3 ระดับการแสดงออกหลังจากการกระตุ้นในชั่วข้ามคืนที่แตกต่างกันอย่างมากระหว่างผู้บริจาค (ตั้งแต่ 2-73% การแสดงออกของเซลล์ผิว) แต่ความแตกต่างเหล่านี้ในระดับการแสดงออกไม่มีผล
โดยแอนติบอดีขึ้นอยู่กับพิษโทรศัพท์มือถือ(ADCC) ในมนุษย์หลัก T เซลล์ผู้บริจาคที่ใช้ในการทดลองเหล่านี้ถูกคัดกรองสำหรับการตอบสนองกลับมาเรียกร้องให้CD4 แอนติเจนในปัจจุบัน Revaxis (Diptheria บาดทะยัก และโปลิโอ) และเปปไทด์ทั้ง CMVpp65 สระว่ายน้ำหรือสระว่ายน้ำเปปไทด์ CD8 ซึ่งประกอบด้วยเปปไทด์เอพิโทปที่จะ CMV, EBV และไข้หวัดใหญ่ แอนติเจนใช้ในการดำเนินการศึกษาเริ่มต้นเป็นสระว่ายน้ำเปปไทด์ CMVpp65 แต่เนื่องจากการ จำกัด จำนวน 5 ของผู้บริจาคที่แสดงให้เห็นถึงการตอบสนองกลับมาเรียกร้องให้แอนติเจนนี้ Revaxis และเปปไทด์ CD8 สระว่ายน้ำมีแอนติเจนที่ใช้ในการสร้างส่วนใหญ่ของข้อมูลความแรงสำหรับแอนติ -LAG3 แอนติบอดี. เลือดอุปกรณ์ต่อพ่วง ถูกเก็บรวบรวมจากอาสาสมัครมนุษย์มีสุขภาพดีในวันที่ 0 (25ml) และวันที่ 5 (75ml) ของการทดลองและใช้ในการเตรียมเซลล์โมโนนิวเคลียร์โดยความหนาแน่นของ ficollplaque 10 ปั่นแยกลาด PBMCs เตรียมในวันที่ 0 มีป้ายใช้ CellTrace "ม่วงเซลล์ขยายชุดตามคำแนะนำของผู้ผลิตหลังจากที่พวกเขาได้รับการล้างเมล็ดใน24 หลุมแบนจานเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อจุดต่ำสุดที่อัตราความหนาแน่น 2x106 / มิลลิลิตรในขนาดกลางและกระตุ้นด้วยแอนติเจน (Revaxis และสระว่ายน้ำเปปไทด์ CD8 ถูกนำมาใช้ในการลดสัดส่วนของ 1 ใน 1000 นั้นเปปไทด์CMVpp65 ถูกนำมาใช้ในการลดสัดส่วนของ 1 ใน 100). โดย PBMCs ถูกบ่มเป็นเวลา 5 วันที่ 37 ° C 15 ใน 5% CO2 ความชื้นศูนย์บ่มเพาะ. Autologous ผู้บริจาคเซลล์ NK ถูกบริสุทธิ์จาก PBMCs ที่จัดทำขึ้นในวันที่ 5 ของการทดลองโดยการเลือกเชิงลบโดยใช้ชุดจากทั้งInvitrogen หรือ Miltenyi Biotec สอดคล้องกับคำแนะนำของผู้ผลิตแต่ละราย. โดยบริสุทธิ์เซลล์ NK นับและลดลง ความหนาแน่นของ 1.3x106 / มิลลิลิตรในสื่อก. 20 เซลล์ที่ได้รับการกระตุ้นด้วยแอนติเจนเป็นเวลา 5 วันถูกล้างนับและเจือจางความหนาแน่นของ2x106 / เซลล์ / มิลลิลิตรในระดับปานกลาง. Autologous ผู้บริจาคเซลล์ NK (80pL) และแอนติเจน เปิดใช้งานเซลล์ (100pL) เป็นปิเปตเข้ามาในรอบต่ำสุดหลอดไตรีนมาซึ่ง5ml กับแอนติบอดีทดสอบหรือขนาดกลาง (20pL) สุดท้ายความเข้มข้นของการต่อต้าน LAG-3 แอนติบอดีทดสอบตั้งแต่ 1000 ถึง 0.015ng / มิลลิลิตร กลุ่มตัวอย่าง 25 ถูกบ่มเป็นเวลา 18 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสใน CO2 5% ความชื้นศูนย์บ่มเพาะ หลังจาก 18 ชั่วโมงการทดสอบ ADCC ตัวอย่างวิเคราะห์การปรากฏตัวของแอนติเจน LAG-3 เฉพาะเซลล์บวก T ใช้ไหลภูมิคุ้มกัน สั้น ๆ ตัวอย่างถูกล้างในบัฟเฟอร์มาซึ่งถูกปิดกั้นด้วย IgG มนุษย์ (3PG / หลอด) และบ่มด้วยเมาส์แอนติ -human CD4, CD8, CD337, CD25 และ LAG-3 flurochrpme คอนจูเกตเอ็ดแอนติบอดีเป็นเวลา30 นาที ในที่มืดที่อุณหภูมิห้อง หลังจากขั้นตอนต่อไปในการล้างพีบีเอส 30 เซลล์ถูกบ่มในการปรากฏตัวของเซลล์ที่ตายแล้วแน่นอนสีเขียวเป็นเวลา 30 นาทีในที่มืดที่ห้องอุณหภูมิ กลุ่มตัวอย่างเป็นที่สุดกับการล้างพีบีเอสคงที่และ Analysed โดยการไหล cytometry ใช้ 60 สองการเข้าซื้อกิจการครั้งที่ไหลอัตรา 1PL ต่อวินาที. ทั้งหมดตัวอย่างข้อมูลที่ได้มาใช้BD FACSCanto ครั้งที่สองที่มีการไหล cytometer Diva มาซึ่งซอฟแวร์เวอร์ชั่น6.1.3 ( BD ชีววิทยาศาสตร์) สด / ตายแน่นอนสีเขียวคราบเซลล์ที่ตายแล้วถูกใช้เป็นเครื่องหมาย 35 ยกเว้นเซลล์ที่ตายแล้วและเหมาะสมไอโซไทป์และ FMO-1 ตัวถูกนำมาใช้ในการกำหนดประชากรเชิงลบ สั้น ๆ เซลล์ที่ตายแล้วถูกตัดออกจากการวิเคราะห์โดยใช้พล็อตไปข้างหน้ากระจาย(FSC-A) กับการเรืองแสงใน FL1 (สีเขียวคราบเซลล์ที่ตายแล้ว) doublets แล้วได้รับการยกเว้นจากการวิเคราะห์โดยใช้พล็อตของFSC-W กับ FSC-H เซลล์เม็ดเลือดขาวทำงานได้เพียงครั้งเดียวเป็น33 ระบุภายหลังรั้วรอบขอบชิดและใช้พล็อตที่กระจายไปข้างหน้า (FSC-A) กับด้านกระจาย (SSC- A) แอนติเจนที่เฉพาะเจาะจง CD4 T เซลล์ที่ถูกระบุจากประชาชนในรั้วรอบขอบชิดของเซลล์โดยใช้แปลงของ CD4 ชั้น uorescence กับ SSC-A และเรืองแสงสีม่วงกับสีย้อมเรืองแสง CD4 ตามลำดับ. Antigen เซลล์เฉพาะ CD4 T โดยระบุว่าการลดลงของการเรืองแสงสีย้อมม่วง พล็อตอีก 5 ของการเรืองแสงเรืองแสงกับ CD25 LAG-3 ถูกดึงออกมาเพื่อยืนยันการเปิดใช้งานรัฐนี้ประชากรของเซลล์และที่พวกเขาแสดงความLAG-3 แปลงที่คล้ายกันถูกดึงไประบุแอนติเจนที่เฉพาะเจาะจง CD8 T เซลล์. เปอร์เซ็นต์ของแอนติเจนที่เฉพาะเจาะจง CD4 และเซลล์ CD8 T อยู่ในแต่ละตัวอย่าง (เป็นอัตราร้อยละของประชากรเม็ดเลือดขาวทำงานได้) ที่ถูกบันทึกไว้ ลาดตัวแปรเชิงเส้นโค้งพอดี 10 ของข้อมูลเหล่านี้ได้รับการพล็อตและค่า EC50 ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ซอฟแวร์ปริซึม GraphPad (v5.03). การคำนวณในระดับสูงสุดของการลดปริมาณการปฏิบัติในการทดสอบเป็นที่สูงสุดความเข้มข้นของแอนติบอดีทดสอบที่สูตรต่อไปนี้ถูกนำมาใช้ (1 - (% Antigen เฉพาะ T เซลล์ที่เหลืออยู่หลังการรักษาแอนติบอดี) / (% Antigen เฉพาะ T เซลล์ที่เหลืออยู่ในตัวตนของแอนติบอดี)) * 100. 15 ข้อมูลศักยภาพสำหรับการลดปริมาณของแอนติเจน LAG3 บวกที่เฉพาะเจาะจง และ CD8 CD4 ทีเซลล์โดยH5L7BW และ H5L7 ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ระบบการทดสอบในหลอดทดลองรายละเอียดข้างต้น H5L7BW เหนี่ยวนำให้เกิดการลดปริมาณของแอนติเจน LAG3 บวก CD4 และ CD8 เฉพาะ T เซลล์โดย ADCC ในหกเจ็ดบริจาคศึกษาการหายตัวไปของเซลล์ชนิดนั้น ความแรงของ H5L7BW ในเซลล์แอนติเจนที่เฉพาะเจาะจง CD4 T เป็นวัดโดย EC50 ค่าตั้งแต่ 14pg / มิลลิลิตรเพื่อ 3.4ng / มิลลิลิตรที่มีระดับสูงสุดที่20 ของการลดปริมาณตั้งแต่ 44-78% ความแรงของแอนติบอดีในแอนติเจน LAG-3 ที่เฉพาะเจาะจงในเชิงบวกเซลล์CD8 T ตั้งแต่ 122pg / มิลลิลิตรเพื่อ 17.5ng / mL มีระดับสูงสุดของการลดปริมาณตั้งแต่39 ไป 87% H5L7 พึ่งระดับต่ำของการลดปริมาณหรือเป็นงานในผู้บริจาคศึกษา. ตัวอย่างที่ 7: การประเมินกิจกรรมที่พึ่งพาของ H5L7BW และ H5L7 ในมนุษย์ในร่างกาย25 PBMC / เมาส์ SCID xenograft รูปแบบการทดสอบนี้อธิบายการใช้ที่มนุษย์ PBMC / เมาส์ SCID xenograft รูปแบบในการประเมินในร่างกายการลดปริมาณการรับรู้ความสามารถของโมโนโคลนอลอย่างเต็มที่ฮิวเมไนซ์, อะฟิวโคซิเลตเตด LAG-3 พึ่งพาแอนติบอดีH5L7BW ในทีเซลล์ของมนุษย์เปิดใช้งาน สุขภาพอาสาสมัครเซลล์โลหิตโมโนนิวเคลียร์ (PBMCs) 30 ที่แยกได้ในชั่วข้ามคืนและกระตุ้น (แอนติ -CD3, IL-12) ที่จะทำให้เกิดการแสดงออก LAG-3 ก่อนที่จะฉีดเข้าไปในเยื่อบุช่องท้องของภูมิคุ้มกันที่ถูกบุกรุกหนูSCID LAG-3 พึ่งพาหรือการควบคุมแอนติบอดีทั้งร่วมบริหารงานเข้าไปในเยื่อบุช่องท้องหรือฉีดเข้าเส้นเลือดดำ. การลดปริมาณของ LAG-3 เซลล์บวกได้รับการประเมินโดยการไหลภูมิคุ้มกันในตัวอย่างล้างช่องท้อง 5 หรือ 24 ชั่วโมงหลังจากการฉีดเซลล์. 35 หนูถูกฉีดด้วย huPBMCs เปิดใช้งาน (4 x 2 x 106- 107cells ใน 0.4ml ของพีบีเอส) โดยเส้นทางเข้าช่องท้อง ทั้งนี้ขึ้นอยู่กับเส้นทางการศึกษาโดยเฉพาะอย่างยิ่ง LAG-3 แอนติบอดีหรือ huIgG1 ควบคุมไบโอว่ามีทั้งทรัพย์สินทางปัญญาร่วมกับยา huPBMCs หรือหนูที่ได้รับการรับการรักษาก่อนฉีดเข้าเส้นเลือดดำ 18h ก่อนที่จะมีการฉีด huPBMC 5 หรือ 24 ชั่วโมงหลังการฉีดเซลล์หนูถูก euthanized เป็นช่องท้อง34 ล้างได้รับการดำเนินการและเนื้อหาที่โทรศัพท์มือถือของบัฟเฟอร์ล้างวิเคราะห์โดย cytometry ไหล สั้น ๆ ที่เกี่ยวข้องกับการล้างช่องท้อง 3 x 5m1 ล้างของช่องท้องเหมือนเดิมโดยใช้พีบีเอสที่มีความหนาวเย็น 3mm EDTA. ทุกข้อมูลตัวอย่างที่ได้มาใช้ BD FACSCanto ครั้งที่สองที่มีการไหล cytometer มาซึ่ง Diva 5 ซอฟต์แวร์รุ่น 6.1.3 (BD ชีววิทยาศาสตร์) ประมาณ 1 x 106 เซลล์ (ที่เป็นไปได้) ที่ถูกเพิ่มต่อท่อมาซึ่งแขวนลอยเซลล์หมุนเหวี่ยงที่1,500 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาทีและเม็ดจากนั้นอีกครั้งระงับใน3M1 พีบีเอส supernatants ถูกแล้ว decanted อย่างระมัดระวังและเม็ดมือถืออีกครั้งที่ลอยอยู่ในอากาศหนาวเย็นมาซึ่ง100p1 ล้างบัฟเฟอร์ 15p1 FCR ปิดกั้นรีเอเจนถูกบันทึกแล้วต่อท่อและเซลล์บ่มเป็นเวลา10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง 5p1 ของแต่ละแอนติบอดีย้อมสี (10p1 10 1: 100 ก่อนปรับลดแอนติ -LAG-3 ปิดกั้น / การตรวจสอบแอนติบอดี 17B4-PE) หรือไอโซไทป์การควบคุมจากนั้นก็เพิ่มตามลำดับและบ่มเป็นเวลา20 นาทีที่อุณหภูมิห้องป้องกันจาก แสง เซลล์ถูกล้างภายหลังจากการเพิ่มขึ้นของ 4 มลบัฟเฟอร์มาซึ่งต่อท่อและหมุนเหวี่ยงที่ 1,500 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 5 นาทีหลังจากที่ใสถูก decanted อย่างระมัดระวัง ขั้นตอนการซักผ้านี้ได้ซ้ำแล้วซ้ำอีก ในที่สุดเซลล์ที่ถูกระงับอีกครั้งในบัฟเฟอร์มาซึ่ง 300p1 และวิเคราะห์โดย cytometry ไหล 15 นอกจาก LAG-3 โดยการตรวจสอบการใช้งานของแอนติบอดี้ที่มีข้อความ fluorescently LAG-3 ปิดกั้น 17B4-PE, เซลล์ T ต่อไปและยืนยันการใช้งานเครื่องหมายถูกนำมาใช้สำหรับเซลล์ phenotyping T: CD45, CD4, CD8 และCD25 ร้อยละของ CD4 และ CD8 เซลล์ .T ถูกแสดงเป็นร้อยละของเซลล์ CD45 บวก. LAG-3 ประชากรเซลล์ T บวกแสดงเป็นร้อยละของประชากรผู้ปกครอง CD4 และ CD8. 20 มาซึ่งซอฟต์แวร์รุ่น Diva 6.1.3 ถูกใช้ในการสร้างชุดการวิเคราะห์ ของเซลล์แต่ละเซลล์นับ/ กิจกรรมและเซลล์เปอร์เซ็นต์ของประชากร วิเคราะห์ข้อมูลกับรุ่น SAS 9.2.2 ซอฟแวร์โดยใช้แบบจำลองเชิงเส้นทั่วไปข้อมูลทวินาม การวิเคราะห์นี้รุ่นโดยตรงจำนวนเซลล์ในขณะที่สัดส่วนของประชากรผู้ปกครอง ด้วยวิธีนี้ขนาดของประชากรที่ผู้ปกครองจะนำเข้าบัญชีในช่วงการวิเคราะห์ หมายถึงการได้รับการคำนวณสัดส่วนของชนิดเซลล์เป้าหมายสำหรับแต่ละ 25 รักษาพร้อมกับช่วงความเชื่อมั่น 95% เหล่านี้ถูกแสดงเป็นร้อยละ. การเปรียบเทียบตามแผนของการรักษาเมื่อเทียบกับการควบคุมที่ถูกสร้างขึ้นโดยใช้อัตราส่วนราคาต่อรอง นี้เป็นการแสดงออกถึงอัตราต่อรองของการมีเซลล์ชนิดหนึ่งในเป้าหมายของการรักษาเป็นอัตราส่วนราคาต่อรองของการมีที่ชนิดเซลล์เป้าหมายเกี่ยวกับการรักษาควบคุม อัตราส่วนราคาต่อรอง <1 จะบ่งชี้ถึงอัตราต่อรองลดลงของการมีเซลล์ชนิดในการรักษาที่น่าสนใจเมื่อเทียบกับการควบคุม อัตราส่วนราคาต่อรอง <1 จะแสดงให้เห็น 30 อัตราต่อรองลดลงของการมีเซลล์ชนิดในการรักษาที่น่าสนใจเมื่อเทียบกับการควบคุม. การทดลองทั้งหมดถูกดำเนินการโดยใช้ PBMCs จากบุคคลผู้บริจาคโลหิตที่มีสุขภาพดีและเนื่องจากการปริมาณเลือดขนาดใหญ่ที่จำเป็นต่อการทดลองไม่มีผู้บริจาคถูกนำมาใช้มากกว่าหนึ่งครั้ง LAG 3 ระดับการแสดงออกหลังจากการกระตุ้นในชั่วข้ามคืนที่แตกต่างกันอย่างมากระหว่างผู้บริจาค (ตั้งแต่ 2-73% การแสดงออกของเซลล์ผิว) แต่ความแตกต่างเหล่านี้ในระดับการแสดงออกไม่มีผล
การแปล กรุณารอสักครู่..
ตัวอย่างที่ 6 : การประเมิน depleting และกิจกรรมของ h5l7bw h5l7 โดยแอนติบอดีต่อเซลล์ (
( adcc ) ในหลักของมนุษย์เซลล์ T
ให้ใช้ในการทดลองเหล่านี้คัดกรองจะเรียกการตอบสนองต่อแอนติเจน CD4
ปัจจุบันใน revaxis ( คอตีบ บาดทะยัก และโปลิโอ ) และทั้ง cmvpp65 เปปไทด์
Pool หรือไปสำหรับเปปไทด์สระซึ่งประกอบด้วยเปปไทด์เอพิโทป S ซีเ มวีอีบีวี , และไข้หวัดใหญ่ .
แอนติเจนที่ใช้ศึกษาเริ่มต้นเป็น cmvpp65 เปปไทด์สระ อย่างไรก็ตาม เนื่องจากการจำกัดที่ 5 จำนวนผู้บริจาคที่แสดง จะเรียกการตอบสนองแอนติเจนนี้ revaxis และ CD8 เปปไทด์
พูลเป็นแอนติเจนที่ใช้ในการสร้างส่วนใหญ่ของศักยภาพข้อมูลสำหรับแอนติ lag3
- แอนติบอดีกระแสเลือดได้รวบรวมอาสาสมัครมนุษย์มีสุขภาพดี ในวันที่ 0 ( รอบ ) และวันที่ 5
( 75ml ) การทดลองใช้เตรียมเซลล์ปกติ ficollplaque ความหนาแน่น
10 การปั่นเหวี่ยง ที่เตรียมนำไปตรวจในวันที่ 0 คือ ข้อความที่ใช้ celltrace สีม่วง
proliferation เซลล์ชุด ตามคำแนะนำของผู้ผลิต หลังจากที่พวกเขาล้าง
เมล็ดใน 24 ดีแบน bottomed แผ่นเนื้อเยื่อที่ความหนาแน่นของ 2x106 / ml ในระดับปานกลางและ
กระตุ้นด้วยแอนติเจน ( revaxis และเปปไทด์ที่ใช้สำหรับสระว่ายน้ำที่เจือจาง 1 ใน 1000 ;
cmvpp65 เปปไทด์ถูกใช้ที่เจือจาง 1 ใน 100 ) ที่นำไปตรวจถูกบ่มเป็นเวลา 5 วัน ที่อุณหภูมิ 37 องศา C
15 ใน 5% CO2 humidified
ตู้ฟักไข่ผู้บริจาคของ ? NK cells มีความบริสุทธิ์จาก PBMCs ไว้ 5 วันของการทดลอง โดยเลือกใช้ชนิดติดตั้งอิสระ
ลบจาก Invitrogen หรือ miltenyi ชีวภาพตามคำแนะนำเฉพาะของแต่ละผู้ผลิต และ NK cells นับและเพื่อลดความหนาแน่นของ 1.3x106/ml ปานกลาง .
20 เซลล์ที่ถูกกระตุ้นด้วยแอนติเจนสำหรับ 5 วันล้างนับและ
เพื่อลดความหนาแน่นของ 2x106 / วางเซลล์ / มล. ในกลาง .
ของผู้บริจาค NK เซลล์ ( 80pl ) และแอนติเจนกระตุ้นเซลล์ ( 100pl ) pipetted เข้าสู่รอบสุด facs หลอด 5ml
พอลิสไตรีนกับการทดสอบแอนติบอดีหรือขนาดกลาง ( 20pl ) ความเข้มข้นสุดท้าย
ของ anti lag-3 แอนติบอดีการทดสอบระหว่าง 1000 ถึง 0.015ng/ml .ตัวอย่าง 25 ถูกบ่มที่ 37 ° C 18 H ใน 5% CO2 humidified ตู้ฟักไข่ หลังจาก 18 H (
adcc วิเคราะห์สำหรับการปรากฏตัวของแอนติเจนที่เฉพาะเจาะจง lag-3 บวก T เซลล์ โดยใช้เซลล์ไหล
สั้น , ตัวอย่าง facs ล้างบัฟเฟอร์ ถูกปิดกั้นด้วย IgG ของมนุษย์ ( 3pg / หลอด )
บ่มด้วยเมาส์แอนติ - CD4 , CD8 cd337 มนุษย์ , ,และ cd25 lag-3 flurochrpme คอนจูเกตเอ็ด
แอนติบอดีสำหรับ 30 นาทีในที่มืดที่อุณหภูมิห้อง หลังจากที่อีกซักก้าวใน PBS 30 เซลล์ถูกบ่มในการแสดงตนของซ่อมได้สีเขียวเซลล์ที่ตายเป็นเวลา 30 นาทีในที่มืดที่อุณหภูมิห้อง
ตัวอย่างสุดท้ายล้างด้วย pbs , คงที่และวิเคราะห์การไหล (
โดยใช้ 60 วินาที ซึ่งเวลาที่อัตราการ ไหลของ 1pl ต่อวินาที .
ข้อมูลตัวอย่างทั้งหมดได้มาใช้ BD facscanto II การใช้โมโนกับ facs Diva
ซอฟแวร์รุ่น 6.1.3 ( BD BIOSCIENCES ) คอนเสิร์ต / ตายแน่นอน เขียวคราบเซลล์ที่ตายถูกใช้เป็นเครื่องหมาย และไอโซไทป์ 35 เซลล์ที่ตายออกที่เหมาะสมและการควบคุม fmo-1 ถูกใช้เพื่อกำหนด
ประชากรติดลบ
( adcc ) ในหลักของมนุษย์เซลล์ T
ให้ใช้ในการทดลองเหล่านี้คัดกรองจะเรียกการตอบสนองต่อแอนติเจน CD4
ปัจจุบันใน revaxis ( คอตีบ บาดทะยัก และโปลิโอ ) และทั้ง cmvpp65 เปปไทด์
Pool หรือไปสำหรับเปปไทด์สระซึ่งประกอบด้วยเปปไทด์เอพิโทป S ซีเ มวีอีบีวี , และไข้หวัดใหญ่ .
แอนติเจนที่ใช้ศึกษาเริ่มต้นเป็น cmvpp65 เปปไทด์สระ อย่างไรก็ตาม เนื่องจากการจำกัดที่ 5 จำนวนผู้บริจาคที่แสดง จะเรียกการตอบสนองแอนติเจนนี้ revaxis และ CD8 เปปไทด์
พูลเป็นแอนติเจนที่ใช้ในการสร้างส่วนใหญ่ของศักยภาพข้อมูลสำหรับแอนติ lag3
- แอนติบอดีกระแสเลือดได้รวบรวมอาสาสมัครมนุษย์มีสุขภาพดี ในวันที่ 0 ( รอบ ) และวันที่ 5
( 75ml ) การทดลองใช้เตรียมเซลล์ปกติ ficollplaque ความหนาแน่น
10 การปั่นเหวี่ยง ที่เตรียมนำไปตรวจในวันที่ 0 คือ ข้อความที่ใช้ celltrace สีม่วง
proliferation เซลล์ชุด ตามคำแนะนำของผู้ผลิต หลังจากที่พวกเขาล้าง
เมล็ดใน 24 ดีแบน bottomed แผ่นเนื้อเยื่อที่ความหนาแน่นของ 2x106 / ml ในระดับปานกลางและ
กระตุ้นด้วยแอนติเจน ( revaxis และเปปไทด์ที่ใช้สำหรับสระว่ายน้ำที่เจือจาง 1 ใน 1000 ;
cmvpp65 เปปไทด์ถูกใช้ที่เจือจาง 1 ใน 100 ) ที่นำไปตรวจถูกบ่มเป็นเวลา 5 วัน ที่อุณหภูมิ 37 องศา C
15 ใน 5% CO2 humidified
ตู้ฟักไข่ผู้บริจาคของ ? NK cells มีความบริสุทธิ์จาก PBMCs ไว้ 5 วันของการทดลอง โดยเลือกใช้ชนิดติดตั้งอิสระ
ลบจาก Invitrogen หรือ miltenyi ชีวภาพตามคำแนะนำเฉพาะของแต่ละผู้ผลิต และ NK cells นับและเพื่อลดความหนาแน่นของ 1.3x106/ml ปานกลาง .
20 เซลล์ที่ถูกกระตุ้นด้วยแอนติเจนสำหรับ 5 วันล้างนับและ
เพื่อลดความหนาแน่นของ 2x106 / วางเซลล์ / มล. ในกลาง .
ของผู้บริจาค NK เซลล์ ( 80pl ) และแอนติเจนกระตุ้นเซลล์ ( 100pl ) pipetted เข้าสู่รอบสุด facs หลอด 5ml
พอลิสไตรีนกับการทดสอบแอนติบอดีหรือขนาดกลาง ( 20pl ) ความเข้มข้นสุดท้าย
ของ anti lag-3 แอนติบอดีการทดสอบระหว่าง 1000 ถึง 0.015ng/ml .ตัวอย่าง 25 ถูกบ่มที่ 37 ° C 18 H ใน 5% CO2 humidified ตู้ฟักไข่ หลังจาก 18 H (
adcc วิเคราะห์สำหรับการปรากฏตัวของแอนติเจนที่เฉพาะเจาะจง lag-3 บวก T เซลล์ โดยใช้เซลล์ไหล
สั้น , ตัวอย่าง facs ล้างบัฟเฟอร์ ถูกปิดกั้นด้วย IgG ของมนุษย์ ( 3pg / หลอด )
บ่มด้วยเมาส์แอนติ - CD4 , CD8 cd337 มนุษย์ , ,และ cd25 lag-3 flurochrpme คอนจูเกตเอ็ด
แอนติบอดีสำหรับ 30 นาทีในที่มืดที่อุณหภูมิห้อง หลังจากที่อีกซักก้าวใน PBS 30 เซลล์ถูกบ่มในการแสดงตนของซ่อมได้สีเขียวเซลล์ที่ตายเป็นเวลา 30 นาทีในที่มืดที่อุณหภูมิห้อง
ตัวอย่างสุดท้ายล้างด้วย pbs , คงที่และวิเคราะห์การไหล (
โดยใช้ 60 วินาที ซึ่งเวลาที่อัตราการ ไหลของ 1pl ต่อวินาที .
ข้อมูลตัวอย่างทั้งหมดได้มาใช้ BD facscanto II การใช้โมโนกับ facs Diva
ซอฟแวร์รุ่น 6.1.3 ( BD BIOSCIENCES ) คอนเสิร์ต / ตายแน่นอน เขียวคราบเซลล์ที่ตายถูกใช้เป็นเครื่องหมาย และไอโซไทป์ 35 เซลล์ที่ตายออกที่เหมาะสมและการควบคุม fmo-1 ถูกใช้เพื่อกำหนด
ประชากรติดลบ
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- Can you send pussy video pls
- . I am restless and innovative
- ฉันให้คุณกินฉันได้ ถ้าคุณอยากกิน แต่ถ้าก
- มีตัวอย่างการแต่งตัวที่ดี
- สุขสันต์วันแม่
- สุจสันต์วันเกิดย้อนหลัง
- i'm not sure about that
- แก้เกรด
- 请输入验证码
- this project is interesting considering
- เจ้าชายถามด้วยแรงกล้าว่า
- ฉันคิดส่าฉันโง่กว่าเดิมและน่าเบื่อ
- I wanna be with you
- oaid the monthly salaries of the employe
- ฉันเกลียด ความรู้สึกนี้
- อ๋อ อย่าบอกนะว่าคุณเอาโทรศัพท์ไปเล่นในห้
- Park
- (Quest Relations Officer) is responsible
- แก้เกรด
- สุขสันต์วันแม่
- It encircled him; laid itself in a ring
- น้ำหนักขึ้น
- tu sais il nou dis mot different
- คุณจะออกเดินทางกี่โมง
