When a transient or stable transfec

When a transient or stable transfection assay is developed for a promoter, a primary objective is to quantify promoter strength. Because transfection efficiency in such assays can be low, promoters are commonly fused to heterologous reporter genes that encode enzymes that can be quantified using highly sensitive assays. The reporter protein's activity or fluorescence within a transfected cell population is approximately proportional to the steady-state mRNA level. Although the Escherichia coli lacZ gene, encoding beta-galactosidase (beta-gal), can be used as a standard reporter for monitoring the strength of a promoter or enhancer in a transient or stable transfection assay, it is predominantly used as an internal control during transient transfection experiments. When used in this manner, cells are usually transfected with the control plasmid (containing a ubiquitously active viral promoter fused to the E. coli lacZ gene) and an experimental plasmid containing another reporter gene (e.g., luciferase or chloramphenicol acetyltransferase [CAT]) under the control of the promoter or enhancer of interest. The basic colorimetric assay described here is the simplest and least expensive assay for quantifying beta-gal activity. The cells are lysed and, after determining the total protein concentration in the extracts, an aliquot of the extract is mixed with the reaction substrate, O-nitrophenyl-beta-D-galactopyranoside (ONPG), in a buffer containing sodium phosphate and magnesium chloride. When the yellow product becomes visible, the optical densities of the samples are determined spectrophotometrically.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เมื่อวิเคราะห์แบบฉับพลัน หรือมีเสถียรภาพ transfection ถูกพัฒนาขึ้นเป็นโปรโมเตอร์ วัตถุประสงค์หลักคือการ กำหนดปริมาณแรงโปรโมเตอร์ เนื่องจากประสิทธิภาพ transfection assays ดังกล่าวจะต่ำ ก่อมี fused ให้โปรแกรมรายงาน heterologous ยีนที่เอนไซม์ที่สามารถ quantified assays ความไวสูงโดยใช้การเข้ารหัส โดยทั่วไป ของโปรตีนโปรแกรมรายงานกิจกรรมหรือ fluorescence ในประชากรเซลล์ transfected เป็นสัดส่วนประมาณระดับ mRNA-ท่อน แม้ว่า Escherichia coli lacZ ยีน เบต้า-galactosidase (เบต้า-gal), การเข้ารหัสสามารถใช้เป็นผู้สื่อข่าวมาตรฐานสำหรับการตรวจสอบความแข็งแรงของโปรโมเตอร์หรือเพิ่มในวิเคราะห์ transfection ชั่วคราว หรือที่มั่นคง ส่วนใหญ่ใช้เป็นตัวควบคุมภายในระหว่างทดลอง transfection ชั่วคราว เมื่อใช้ในลักษณะนี้ เซลล์เป็นปกติ transfected plasmid ควบคุม (ประกอบด้วยโปรโมเตอร์ไวรัส ubiquitously งาน fused การยีน lacZ E. coli) และ plasmid ทดลองประกอบด้วยอีกโปรแกรมรายงานยีน (เช่น luciferase หรือ chloramphenicol acetyltransferase [แมว]) ภายใต้การควบคุมของผู้เสนอเงื่อนไขหรือเพิ่มที่น่าสนใจ ทดสอบง่ายที่สุด และแพงน้อยที่สุดสำหรับ quantifying เบต้า gal กิจกรรมวิเคราะห์เทียบเคียงพื้นฐานที่อธิบายไว้ที่นี่ได้ เซลล์มี lysed และ หลังจากกำหนดความเข้มข้นของโปรตีนรวมในการแยก ผสมเป็นส่วนลงตัวของสารสกัดที่ มีพื้นผิวปฏิกิริยา O-nitrophenyl-เบต้าดี-galactopyranoside (ONPG), ในบัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วยโซเดียมฟอสเฟตและแมกนีเซียมคลอไรด์ เมื่อผลิตภัณฑ์สีเหลืองมองเห็นได้ ความหนาแน่นออปติคัลของตัวอย่างจะกำหนด spectrophotometrically

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เมื่อทดสอบ transfection ชั่วคราวหรือที่มั่นคงถูกพัฒนาขึ้นสำหรับผู้ก่อการเป็นวัตถุประสงค์หลักคือปริมาณความแรงของโปรโมเตอร์ เพราะมีประสิทธิภาพในการตรวจ transfection ดังกล่าวจะต่ำก่อการกำลังหลอมละลายทั่วไปยีนนักข่าว heterologous ที่เข้ารหัสเอนไซม์ที่สามารถวัดโดยใช้การวิเคราะห์ความไวสูง กิจกรรมโปรตีนนักข่าวหรือเรืองแสงภายในเซลล์ transfected ประชากรประมาณสัดส่วนกับระดับ mRNA มั่นคงของรัฐ แม้ว่ายีน Escherichia coli lacZ เข้ารหัสเบต้า galactosidase (เบต้าแกลลอน) สามารถนำมาใช้เป็นนักข่าวมาตรฐานสำหรับการตรวจสอบความแข็งแรงของผู้ก่อการหรือเพิ่มในการทดสอบ transfection ชั่วคราวหรือมีเสถียรภาพก็ถูกนำมาใช้ส่วนใหญ่เป็นระบบการควบคุมภายในในช่วง การทดลอง transfection ชั่วคราว เมื่อนำมาใช้ในลักษณะนี้เซลล์ transfected มักจะมีพลาสมิดควบคุม (ที่มีผู้ก่อการไวรัสที่ใช้งาน ubiquitously ผสมกับยีน lacZ เชื้อ E. coli) และพลาสมิดที่มียีนทดลองนักข่าวอื่น (เช่น luciferase หรือ chloramphenicol acetyltransferase [CAT]) ภายใต้ การควบคุมของผู้ก่อการหรือเพิ่มที่น่าสนใจ การทดสอบสีพื้นฐานที่อธิบายไว้ที่นี่คือการทดสอบที่ง่ายและมีราคาแพงอย่างน้อยสำหรับกิจกรรมเชิงปริมาณเบต้าแกลลอน เซลล์จะ lysed และหลังจากการกำหนดความเข้มข้นของโปรตีนรวมในสารสกัดการหารของสารสกัดผสมกับสารตั้งต้นปฏิกิริยา O-Nitrophenyl เบต้า-D-galactopyranoside (ONPG) ในบัฟเฟอร์ที่มีฟอสเฟตโซเดียมและคลอไรด์แมกนีเซียม . เมื่อสินค้าที่จะกลายเป็นสีเหลืองมองเห็นแสงความหนาแน่นของกลุ่มตัวอย่างจะถูกกำหนด spectrophotometrically

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เมื่อมีหรือมีเสถียรภาพสำหรับทดสอบพัฒนาการ , วัตถุประสงค์หลักคือการส่งเสริมการขายที่มีความแข็งแกร่ง เพราะสำหรับประสิทธิภาพในวิธีการดังกล่าวสามารถต่ำ โปรโมเตอร์มักผสมกับชนิดยีนรายงานผลที่เข้ารหัสเอนไซม์ที่สามารถวัดได้โดยใช้ความไวสูง ) .ข่าวกิจกรรมของโปรตีนภายในเซลล์ หรือการ transfected ประชากรประมาณสัดส่วนคงที่ของระดับ แม้ว่าเชื้อ Escherichia coli lacz ยีนเบต้า ( Beta gal galactosidase การเข้ารหัส ) , สามารถใช้เป็นมาตรฐานสำหรับการตรวจสอบความแข็งแรงของนักข่าวหรือเสริมในการชั่วคราวหรือที่มั่นคงสำหรับตรวจสอบมันสามารถใช้เป็นระบบควบคุมภายในในระหว่างการทดลอง transfection ชั่วคราว เมื่อใช้ในลักษณะนี้ เซลล์มักจะ transfected กับพลาสมิด ( ที่มีการควบคุมการใช้งานระหว่างไวรัสผสมกับเชื้ออีโคไล lacz ยีน ) และพลาสมิดที่มียีนแบบอื่น ( เช่น นักข่าวลูซิเฟอเรส หรือ คลอแรมเฟนิคอล acetyltransferase [ แมว ] ) ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์หรือเพิ่มดอกเบี้ย ( 7.4 พื้นฐานอธิบายไว้ที่นี่เป็นที่ง่ายที่สุดและมีราคาแพงอย่างน้อย การทดสอบสำหรับค่ากิจกรรมสาวเบต้า เซลล์จะ lysed และหลังจากการกำหนดความเข้มข้นของโปรตีนทั้งหมดใน สารสกัด เป็นส่วนลงตัวของสกัดผสมกับปฏิกิริยาตั้งต้นo-nitrophenyl-beta-d-galactopyranoside ( onpg ) ในบัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วยโซเดียมฟอสเฟตและแมกนีเซียมคลอไรด์ เมื่อสินค้าสีเหลือง จะมองเห็นได้ เมื่อแสงของตัวอย่างที่กำหนดนี้ .