Table 3. Control genes ranked in or

Table 3. Control genes ranked in order of their expression stability*
Normalization factor calculation based on the geometric mean of multiple control genes
Ads By wisen wizard×We concluded that in order to measure expression levels accurately, normalization by multiple housekeeping genes instead of one is required. Consequently, a normalization factor based on the expression levels of the best-performing housekeeping genes must be calculated. For accurate averaging of the control genes, we propose to use the geometric mean instead of the arithmetic mean, as the former controls better for possible outlying values and abundance differences between the different genes. The number of genes used for geometric averaging is a trade-off between practical considerations and accuracy. It is obvious that an accurate normalization factor should not include the rather unstable genes that were observed in some tissues. On the other hand, it remains relatively impractical to quantify, for example, eight control genes when only a few target genes need to be studied, or when only minimal amounts of RNA are available. Furthermore, it is a waste of resources to quantify more genes than necessary if all genes are relatively stably expressed and if the normalization factor does not significantly change whether or not more genes are included. Taking all this into consideration, we recommend the minimal use of the three most stable internal control genes for calculation of an RT-PCR normalization factor (NFn, n = 3), and stepwise inclusion of more control genes until the (n + 1)th gene has no significant contribution to the newly calculated normalization factor (NFn + 1). To determine the possible need or utility of including more than three genes for normalization, the pairwise variation Vn/n + 1 was calculated between the two sequential normalization factors (NFn and NFn + 1) for all samples within the same tissue panel (with aij = NFn,i and aik = NFn + 1,i, n the number of genes used for normalization (3 ≤ n ≤ 9), and i the sample index; see Equations 2 and 3 in Materials and methods). A large variation means that the added gene has a significant effect and should preferably be included for calculation of a reliable normalization factor. For all tissue types, normalization factors were calculated for the three most stable control genes (that is, those with the lowest M value) and for seven additional factors by stepwise inclusion of the most stable remaining control gene. Pairwise variations were subsequently calculated for every series of NFn and NFn + 1 normalization factors, reflecting the effect of adding an (n + 1)th gene (Figure 3a). It is apparent that the inclusion of a fourth gene has no significant effect (that is, low V3/4 value) for leukocytes, fibroblasts and bone marrow. This is also illustrated by the nearly perfect correlation between NF3 and NF4 values, as shown for fibroblasts in Figure 3b. On the basis of these data, we decided to take 0.15 as a cut-off value, below which the inclusion of an additional control gene is not required. For neuroblastoma and the pool of normal tissues, one and two additional genes, respectively, are necessary for reliable normalization (see also Figure 3b). The high V8/9 and V9/10 values for the normal pool, neuroblastoma and leukocytes corroborate very well the findings obtained by stepwise exclusion of the worst-scoring control gene (Figure 2). This analysis showed an initial steep decrease in averageM value, pointing at two

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ตาราง 3 ยีนควบคุมการจัดอันดับในลำดับของเสถียรภาพนิพจน์ของ *คำนวณอัตราฟื้นฟูตามเรขาคณิตของยีนควบคุมหลายโฆษณาโดย wisen ช่วยซื้อเราสรุปว่า การวัดระดับของนิพจน์อย่างถูกต้อง ฟื้นฟู โดยหลายยีนทำความสะอาดแทนหนึ่งจำเป็น ดังนั้น ตัวฟื้นฟูตามระดับนิพจน์ของยีนที่ทำความสะอาดประสิทธิภาพดีที่สุดต้องสามารถคำนวณ สำหรับถูกต้องหาค่าเฉลี่ยของยีนที่ควบคุม ที่เราเสนอการใช้เรขาคณิตแทนค่าเฉลี่ยเลขคณิต เป็นอดีตควบคุมดีกว่าใช้รอบนอกและความแตกต่างมากมายระหว่างยีนต่าง ๆ จำนวนยีนที่ใช้ในการหาค่าเฉลี่ยเรขาคณิตเป็น trade-off ระหว่างความถูกต้องและพิจารณาปฏิบัติ เป็นที่ชัดเจนว่า ปัจจัยการฟื้นฟูที่ถูกต้องควรรวมยีนที่ค่อนข้างเสถียรที่ได้สังเกตไม่ในเนื้อเยื่อบาง ในทางกลับกัน มันยังคงค่อนข้างมากการกำหนดปริมาณ เช่น ยีนควบคุมแปดเมื่อเพียงไม่กี่เป้าหมายยีนที่ต้องการจะศึกษา หรือเมื่อจำนวนน้อยเท่านั้นของอาร์เอ็นเอมี นอกจากนี้ จะเสียของทรัพยากรเพื่อกำหนดปริมาณยีนมากเกินความจำเป็น ถ้ายีนทั้งหมดจะแสดงค่อนข้าง stably และตัวฟื้นฟูไม่เปลี่ยนว่ายีนเพิ่มเติมจะรวมหรือไม่ การทั้งหมดนี้พิจารณา เราแนะนำให้ใช้น้อยที่สุดสามยีนการควบคุมภายในมีเสถียรภาพมากที่สุดสำหรับการคำนวณปัจจัยการฟื้นฟู RT-PCR (NFn, n = 3), และรวม stepwise ของยีนควบคุมเพิ่มเติมจนกระทั่งยีน th (n + 1) มีส่วนไม่สำคัญเพื่อฟื้นฟูใหม่คำนวณปัจจัย (NFn + 1) กำหนดได้ต้องการอรรถประโยชน์รวมถึงยีนสามมากกว่าสำหรับฟื้นฟู ปรับแพร์ไวส์วี เอ็น/n + 1 ไม่ได้ระหว่างสองฟื้นฟูตามลำดับปัจจัย (NFn และ NFn + 1) สำหรับตัวอย่างทั้งหมดภายในแผงเนื้อเยื่อเดียวกัน (มี aij = NFn ฉัน และ aik = NFn + 1, i, n จำนวนยีนที่ใช้สำหรับการฟื้นฟู (3 ≤ n ≤ 9)และดัชนีตัวอย่าง ดูสมการ 2 และ 3 ในวัสดุและวิธีการ) การเปลี่ยนแปลงขนาดใหญ่หมายความ ว่า ยีนเพิ่มมีผลสำคัญ และควรจะรวมสำหรับการคำนวณของตัวฟื้นฟูความน่าเชื่อถือ ทุกชนิดเนื้อเยื่อ ฟื้นฟูปัจจัยได้ตามยีนควบคุมเสถียรภาพมากที่สุดสาม (นั่นคือ ผู้ที่ มีค่าต่ำสุด M) และปัจจัยเพิ่มเติม 7 รวม stepwise ของยีนควบคุมที่เหลือมีเสถียรภาพมากที่สุด ต่อมามีคำนวณรูปแพร์ไวส์ทุกชุดของ NFn และ NFn + ฟื้นฟู 1 ปัจจัย สะท้อนให้เห็นถึงผลของการเพิ่ม (n + 1) th ยีน (รูปที่ 3a) ชัดเจนว่า การรวมของยีนสี่ได้ไม่มีผลอย่างมีนัยสำคัญ (นั่นคือ V3/4 มูลค่าต่ำ) leukocytes, fibroblasts และไขกระดูกได้ นี้ยังจะแสดง โดยสัมประสิทธิ์เกือบระหว่าง NF3 และ NF4 ค่า เป็นแสดงในรูปที่ 3b fibroblasts โดยข้อมูลเหล่านี้ เราตัดสินใจใช้ 0.15 เป็นค่าตัด ที่รวมของยีนการควบคุมเพิ่มเติมไม่จำเป็น Neuroblastoma และสระว่ายน้ำของเนื้อเยื่อปกติ หนึ่งเพิ่มเติมยีน ตามลำดับ เป็นสิ่งจำเป็นสำหรับฟื้นฟูความน่าเชื่อถือ (ดูรูปที่ 3b) สูง V8/9 และ V9/10 ค่า สำหรับสระว่ายน้ำปกติ neuroblastoma leukocytes corroborate ดีผลการวิจัยที่ได้รับ โดยแยก stepwise ของตัวร้ายให้คะแนนควบคุมยีน (รูปที่ 2) วิเคราะห์นี้พบว่าการลดลงสูงชันเริ่มต้นมูลค่า averageM ชี้ไปที่สอง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ตารางยีน 3. การควบคุมการจัดอันดับอยู่ในลำดับของความมีเสถียรภาพการแสดงออกของพวกเขา *
การคำนวณปัจจัยที่ปกติขึ้นอยู่กับค่าเฉลี่ยเรขาคณิตของยีนที่ควบคุมหลาย
โฆษณาโดยตัวช่วยสร้าง wisen ×เราได้ข้อสรุปว่าเพื่อวัดระดับการแสดงออกอย่างถูกต้อง, การฟื้นฟูทำความสะอาดโดยยีนหลายแทนหนึ่งเป็น จำเป็นต้องใช้ ดังนั้นปัจจัยการฟื้นฟูขึ้นอยู่กับระดับการแสดงออกที่ดีที่สุดที่มีประสิทธิภาพยีนทำความสะอาดจะต้องคำนวณ สำหรับค่าเฉลี่ยที่ถูกต้องของยีนที่ควบคุมเราเสนอให้ใช้ค่าเฉลี่ยเรขาคณิตแทนค่าเฉลี่ยเลขคณิตเป็นอดีตที่ดีกว่าการควบคุมค่าห่างไกลที่เป็นไปได้และความแตกต่างมากมายระหว่างยีนที่แตกต่างกัน จำนวนของยีนที่ใช้สำหรับค่าเฉลี่ยเรขาคณิตเป็นค้าออกระหว่างการพิจารณาในทางปฏิบัติและความถูกต้อง เป็นที่ชัดเจนว่าปัจจัยการฟื้นฟูที่ถูกต้องไม่ควรมียีนที่ค่อนข้างไม่แน่นอนที่พบในเนื้อเยื่อบางส่วน ในทางกลับกันก็ยังคงค่อนข้างทำไม่ได้ที่จะหาจำนวนตัวอย่างเช่นแปดยีนควบคุมเมื่อยีนเป้าหมายเพียงไม่กี่จำเป็นที่จะต้องได้รับการศึกษาหรือเมื่อเพียงจำนวนเงินที่น้อยที่สุดของอาร์เอ็นเอที่มีอยู่ นอกจากนี้มันเป็นของเสียของทรัพยากรที่จะหาจำนวนยีนที่มากเกินความจำเป็นถ้ายีนทั้งหมดจะถูกแสดงที่ค่อนข้างเสถียรและถ้าปัจจัยที่ฟื้นฟูไม่ได้เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญหรือไม่ว่ายีนได้มากขึ้นที่จะถูกรวม การทั้งหมดนี้ในการพิจารณาเราขอแนะนำให้ใช้น้อยที่สุดของทั้งสามที่มีความเสถียรมากที่สุดยีนควบคุมภายในในการคำนวณปัจจัยการฟื้นฟู RT-PCR (NFN, n = 3) และการรวมขั้นตอนมากขึ้นยีนควบคุมจนกว่า (N + 1) ยีน th ไม่มีส่วนร่วมสำคัญในการฟื้นฟูปัจจัยคำนวณใหม่ (NFN + 1) การตรวจสอบต้องเป็นไปได้หรือยูทิลิตี้รวมกว่าสามยีนสำหรับการฟื้นฟู, การเปลี่ยนแปลงจากจำนวน Vn / N + 1 ที่คำนวณระหว่างสองปัจจัยการฟื้นฟูลำดับ (NFN และ NFN + 1) สำหรับตัวอย่างทั้งหมดภายในแผงเนื้อเยื่อเดียวกัน (กับ AIJ = NFN ฉันและ aik = NFN + 1, i, n จำนวนของยีนที่ใช้สำหรับการฟื้นฟู (3 ≤ n ≤ 9) และฉันดัชนีตัวอย่างดูสมการที่ 2 และ 3 ในวัสดุและวิธีการ) การเปลี่ยนแปลงขนาดใหญ่หมายความว่ายีนที่เพิ่มเข้ามามีผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญและควรจะรวมอยู่ในการคำนวณปัจจัยมาตรฐานที่เชื่อถือได้ สำหรับทุกประเภทเนื้อเยื่อปัจจัยการฟื้นฟูนี้จะถูกคำนวณสำหรับงวดสามยีนควบคุมความเสถียรมากที่สุด (นั่นคือผู้ที่มีค่าต่ำสุด M) และเจ็ดปัจจัยเพิ่มเติมโดยการรวมขั้นตอนที่เหลือยีนควบคุมความเสถียรมากที่สุด รูปแบบนี้จะถูกคำนวณจากจำนวนต่อมาสำหรับชุดของปัจจัย NFN และ NFN + 1 การฟื้นฟูทุกสะท้อนให้เห็นถึงผลกระทบของการเพิ่ม (N + 1) th ยีน (รูปที่ 3a) มันเห็นได้ชัดว่าการรวมของยีนที่สี่จะไม่มีผลอย่างมีนัยสำคัญ (นั่นคือ V3 ต่ำ / 4 ค่า) สำหรับเม็ดเลือดขาวเซลล์และไขกระดูก นี่คือตัวอย่างโดยความสัมพันธ์ที่เกือบจะสมบูรณ์แบบระหว่าง NF3 และ NF4 ค่าที่แสดงสำหรับรบราในรูปที่ 3b บนพื้นฐานของข้อมูลเหล่านี้เราตัดสินใจที่จะใช้ 0.15 เป็นค่าตัดด้านล่างซึ่งรวมของยีนที่ควบคุมเพิ่มเติมไม่จำเป็นต้องใช้ สำหรับ neuroblastoma และสระว่ายน้ำของเนื้อเยื่อปกติหนึ่งและสองยีนเพิ่มเติมตามลำดับมีความจำเป็นสำหรับการฟื้นฟูที่เชื่อถือได้ (ดูรูปที่ 3b) V8 สูง / 9 และ V9 / 10 ค่าปกติสระว่ายน้ำ, neuroblastoma และเม็ดเลือดขาวยืนยันได้เป็นอย่างดีผลที่ได้จากการยกเว้นขั้นตอนของยีนควบคุมที่เลวร้ายที่สุดคะแนน (รูปที่ 2) การวิเคราะห์นี้แสดงให้เห็นว่าการลดลงที่สูงชันเริ่มต้นมูลค่า averageM ชี้ไปที่สอง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ตารางที่ 3 การควบคุมการแสดงออกของยีนของพวกเขาจัดอันดับเพื่อความมั่นคง
การฟื้นฟูปัจจัยการคำนวณตามค่าเฉลี่ยเรขาคณิตของหลายการควบคุมยีน
โฆษณาโดยรู้วิธีพวกนี้ช่วย×เราสรุปได้ว่า เพื่อวัดระดับการแสดงออกได้อย่างปกติ โดยยีนที่แม่บ้านหลายแทนการหนึ่งจะต้อง จากนั้นเป็นบรรทัดฐานปัจจัยที่ขึ้นอยู่กับระดับการแสดงออกของยีนมีประสิทธิภาพดีที่สุดแม่บ้านต้องคํานวณ ให้ความถูกต้องเฉลี่ยของยีนที่ควบคุม เราเสนอให้ใช้ค่าเฉลี่ยเรขาคณิตแทนค่าเฉลี่ย เช่น การควบคุมก่อนดีกว่าค่าห่างไกลที่สุดและอุดมสมบูรณ์ความแตกต่างระหว่างยีนที่แตกต่างกันจำนวนของยีนที่ใช้ในเรขาคณิตเฉลี่ย เป็นการแลกเปลี่ยนระหว่างการพิจารณาในทางปฏิบัติและความถูกต้อง มันเป็นที่ชัดเจนว่าเป็นปัจจัยบรรทัดฐานที่ถูกต้องไม่ควรรวมยีนที่ค่อนข้างเสถียร ที่พบในเนื้อเยื่อ บนมืออื่น ๆ , มันยังคงค่อนข้างยากมาก ที่จะหาตัวอย่างเช่นแปดการควบคุมยีนเมื่อเพียงไม่กี่เป้าหมายยีนที่ต้องศึกษาหรือเมื่อเฉพาะยอดเงินน้อยที่สุดของ RNA มี นอกจากนี้ มันเสียทรัพยากรที่มียีนมากกว่าที่จำเป็น ถ้ายีนจะค่อนข้างเสถียรแสดง และถ้าปัจจัยความไม่แตกต่างหรือไม่มากกว่ายีนที่จะถูกรวม เอาทั้งหมดนี้ไปพิจารณาเราขอแนะนำการใช้งานน้อยที่สุดของทั้งสามที่มีเสถียรภาพมากที่สุดภายในการควบคุมยีนสำหรับการคำนวณเป็นบรรทัดฐานต่อปัจจัย ( nfn , N = 3 ) และการรวมแบบยีนที่ควบคุมมากขึ้นจนถึง ( 1 ) ยีนที่ได้ไม่แตกต่างกัน มีส่วนร่วมในการฟื้นฟูด้านคำนวณใหม่ ( nfn 1 ) เพื่อศึกษาความต้องการที่เป็นไปได้หรืออรรถประโยชน์รวมกว่า 3 ยีนบรรทัดฐาน ,ส่วน VN / การเปลี่ยนแปลงคู่ N 1 มีค่าระหว่างสองลำดับปัจจัยและการฟื้นฟู nfn nfn 1 ) สำหรับตัวอย่างทั้งหมดภายในแผงเนื้อเยื่อเดียวกัน ( ด้วย aij = nfn ฉันและนายหน้า = nfn 1 I , N จำนวนของยีนที่ใช้ในการฟื้นฟู ( 3 ≤ N ≤ 9 ) และดัชนี ตัวอย่าง ดูสมการที่ 2 และ 3 ในวัสดุและวิธีการ )การเปลี่ยนแปลงขนาดใหญ่หมายความว่าเพิ่มยีนจะได้ผลที่สำคัญและควรจะรวมอยู่ในการคำนวณปัจจัยความเชื่อถือได้ สำหรับเนื้อเยื่อปกติคำนวณทุกปัจจัยทั้งสามมีเสถียรภาพมากที่สุดในการควบคุมยีน ( นั่นคือ ผู้ที่มีค่า M ต่ำสุด ) และเจ็ดเพิ่มเติมปัจจัยโดยรวมแบบมั่นคงเหลือการควบคุมของยีนการเปลี่ยนแปลงคู่จัดการคำนวณสำหรับทุกชุดของ nfn nfn 1 ปัจจัยและบรรทัดฐาน , สะท้อนให้เห็นถึงผลของการเพิ่ม ( 1 ) ยีน th ( รูปที่ 3 ) มันเป็นที่ชัดเจนว่า การรวมของยีน 4 ไม่มีผล ( คือต่ำ V3 / 4 ค่าเม็ดเลือดขาวจาก ) , และไขกระดูก .นี้จะแสดงความสัมพันธ์ระหว่าง nf3 เกือบสมบูรณ์แบบ และ nf4 ค่าตามที่แสดงในรูปที่ 3B จาก บนพื้นฐานของข้อมูลเหล่านี้ เราตัดสินใจที่จะใช้เวลา 0.15 เป็นตัดค่าด้านล่างซึ่งรวมของยีนควบคุมเพิ่มเติม ไม่ต้อง สำหรับนิวโรบลาสโทมาและสระว่ายน้ำเนื้อเยื่อปกติ และอีกสองยีน ตามลำดับเป็นสิ่งจำเป็นสำหรับความเชื่อถือได้ ( ดูรูปที่ 3B ) ค่าสูง V8 / 9 V9 / 10 สำหรับสระว่ายน้ำ และเม็ดเลือดขาวปกติ นิวโรบลาสโทมายืนยันได้เป็นอย่างดี ผลที่ได้จากแบบที่เลวร้ายที่สุดคะแนนยกเว้นยีนควบคุม ( รูปที่ 2 ) การวิเคราะห์การลดลงสูงชันในค่าเริ่มต้น averagem ชี้ที่ สอง