Kimet al., 2004) is unlikely to mod

Kim
et al
., 2004) is unlikely to modify this opinion, in part
because the same sequences have not been independently
determined in another laboratory. Investigators studying such
ancient samples will need to provide a considerable wealth of
evidence to convince the scientific community about sequence
authenticity.
Species identification in bulked samples
A recent trend in aDNA research is to identify species from
sequences extracted and amplified from bulked fossil samples
(e.g. from dung, intestinal contents or even raw sediments;
Fig. 2b), in which individual remains, including those of plants,
are not always precisely identified macroscopically. As an example,
coprolites of herbivorous animals, representing fossilized fecal
material, have been used as sources of plant aDNA (Poinar
et al
., 2001; Hofreiter
et al
., 2003) to infer diets as well as the
vegetation present at the deposition time of the feces, up to
14 000 yr ago. In the same way, the middens of rodents were
analysed to deduce the composition of Quaternary vegetation
(Kuch
et al
., 2002), whereas the contents of the intestine and
colon of Ötzi, the Tyrolean iceman who lived some 5000 yr
ago, were investigated to reconstruct his last meals (Rollo
et al
.,
2002). Recently, Willerslev
et al
. (2003) retrieved plant aDNA
from a diversity of soil sediments, including permafrost dated
to up to 400 000 yr before present, providing genetic information
from this material in the absence of macrofossil evidence. In
this paper, the authors argue that the sequences they amplified
represent the oldest authenticated ancient DNA sequences
known to date. The evaluation of more diverse sediments,
including those from temperate settings, and the concomitant
analysis of microbial communities might represent promising
avenues for further development in plant palaeogenetics
(Willerslev
et al
., 2003). However, one should be aware of the
possibility that DNA molecules may leak from decaying
samples and subsequently be moved across sediment layers by
water percolation, making authentication difficult.
These methods make use of available databases (e.g. EMBL
or GENBANK) for sequence comparison (e.g. to reconstruct
entire plant communities from the Quaternary). However,
taxonomic resolution is limited by the number of species for
which sequences are available in the databases. Systematic
sequencing of complete local or regional floras using highly
conserved primer pairs, such as
rbc
L (Chase
et al
., 1993) or
trn
L-F (Taberlet
et al
., 1991) of cpDNA, would enable
researchers to exploit the full power of such approaches.
Studies based on bulked samples do not allow for an assessment
of the authenticity of every sequence obtained. Instead,
clusters of consensus sequences from several clones have to
be used (Poinar
et al
., 1998; Hofreiter
et al
., 2000; Hofreiter
et al
., 2003), resulting in reduced taxonomic resolution. As
a consequence, it is only the overall reconstructed plant community
composition that is used to evaluate if the results are
reasonable. For example, dung segments of an extinct ground
sloth from south-western USA (Poinar
et al
., 1998) or Argentina
(Hofreiter
et al
., 2003) were analysed for chloroplast DNA
and for pollen plus plant cuticle remains, respectively. In both
regions, there was considerable overlap between genetic and
morphological determinations, at least at the family level.
Towards population palaeogenetics
Recent attention has also been directed towards the study of
aDNA diversity in wild plant species (i.e. DNA polymorphisms
among and within populations) taking advantage of the knowledge
from available phylogeographical survey). Such studies
provide new insights into diachronical processes by considering
more than just one point in time at a given location. For example,
< 100-yr old herbarium material has been used to reconstruct
the timing and route of invasion by a nonnative genotype of
the common reed
Phragmites australis
into North America
during the twentieth century (Saltonstall, 2002, 2003). Similarly,
allelic diversity in nuclear microsatellites was determined from
samples of the seagrass
Posidonia oceanica
up to 4000 yr old
(Raniello & Procaccini, 2002). In another study, nucleotide
diversity of several nuclear genes was estimated from DNA
amplified from fossil heartwood of six trees of Japanese cedar
Cryptomeria japonica
that had been buried for about 3600 yr,
and the results were compared with data from nearby presentday
populations (Tani
et al
., 2003). Ideally, for such population
surveys, several samples suitable for aDNA analysis are required
from each location and time period. Therefore, proving the
authenticity of each of the many samples could rapidly become
very limiting. To cope with high sample numbers, adequate
replication of DNA extractions and PCRs could be performed
while restricting cloning/sequencing to only a subset of samples
(Taberlet
et al
., 1996; Spencer & Howe, 2004).
Choosing appropriate techniques and markers
The use of real-time PCR in aDNA studies
Focusing on the population level requires careful evaluation of
the molecular techniques used to answer each specific question.
Real-time

might become a standard in the study of aDNA
(Pruvost & Geigl, 2004), since it combines several advantages
as outlined below.
Real-time PCR provides a reliable method to quantify
the DNA concentration originally present in an extract of a
target organism (Poinar
et al
., 2003). By using highly specific
primers and an oligonucleotide probe complementary to an
internal segment of the target sequence, the amplification of
any nontarget – ancient or recent – DNA present in the extract
(e.g. resulting from microorganismal contamination) is excluded
a priori. Like the primers, the probe anneals to the template
sequence, but is successively cleaved by the polymerase during
the elongation of the newly synthesized DNA strand. Probe
cleavage emits a fluorescent signal that is recorded during

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

คิม
, et al
., 2004) ไม่น่าจะปรับเปลี่ยนความเห็นนี้ในส่วน
เพราะลำดับเดียวกันยังไม่ได้รับอิสระ
ที่กำหนดไว้ในห้องปฏิบัติการอื่น นักวิจัยศึกษาเช่น
ตัวอย่างโบราณจะต้องให้ความมั่งคั่งมากของ
หลักฐานที่จะโน้มน้าวให้ชุมชนวิทยาศาสตร์เกี่ยวกับลำดับ
ความถูกต้อง.
การระบุสายพันธุ์ในตัวอย่างเนื้อมีหนัง
แนวโน้มล่าสุดในการวิจัยadnÃคือการระบุสายพันธุ์จาก
ลำดับสกัดและขยายจากตัวอย่างฟอสซิลเนื้อมีหนัง
(เช่นจาก มูลเนื้อหาในลำไส้หรือแม้กระทั่งตะกอนดิบ
. รูปที่ 2b) ซึ่งยังคงเป็นรายบุคคลรวมทั้งพวกของพืช
ไม่เคยระบุอย่างแม่นยำ macroscopically ตัวอย่างเช่น
coprolites ของสัตว์กินพืชเป็นอาหารคิดเป็นฟอสซิลอุจจาระ
วัสดุที่ได้รับการใช้เป็นแหล่งที่มาของadnÃพืช (Poinar
et al,
2001;. Hofreiter
, et al
., 2003) เพื่อสรุปอาหารเช่นเดียวกับ
ปัจจุบันพืชในเวลาการสะสม ของอุจจาระถึง
14 000 ปีที่ผ่านมา ในทำนองเดียวกับ middens ของหนูถูก
วิเคราะห์เพื่อสรุปองค์ประกอบของพืช Quaternary
(Kuch
, et al
., 2002) ในขณะที่เนื้อหาของลำไส้และ
ลำไส้ใหญ่ของÖtzi, Iceman สินะที่อาศัยอยู่บาง 5000 ปี
ที่ผ่านมาได้รับการตรวจสอบ เพื่อสร้างอาหารครั้งสุดท้ายของเขา (Rollo
, et al
.,
2002) เมื่อเร็ว ๆ นี้ Willerslev
และอัล
(2003) ดึงพืชadnÃ
จากความหลากหลายของตะกอนดินรวมทั้ง permafrost ลงวันที่
จะได้ถึง 400 000 ปีก่อนปัจจุบันให้ข้อมูลทางพันธุกรรม
จากวัสดุนี้ในกรณีที่ไม่มีหลักฐาน macrofossil ใน
บทความนี้ผู้เขียนยืนยันว่าลำดับที่พวกเขาขยาย
เป็นตัวแทนที่เก่าแก่ที่สุดรับรองความถูกต้องลำดับดีเอ็นเอโบราณ
ที่รู้จักกันในวันที่ การประเมินผลของตะกอนที่มีความหลากหลายมากขึ้น
รวมทั้งผู้ที่มาจากการตั้งค่าพอสมควรและไปด้วยกัน
การวิเคราะห์ของกลุ่มจุลินทรีย์ที่มีแนวโน้มอาจจะเป็นตัวแทนของ
ลู่ทางการพัฒนาต่อไปใน palaeogenetics พืช
(Willerslev
, et al
., 2003) แต่หนึ่งควรจะตระหนักถึง
ความเป็นไปได้ว่าโมเลกุลดีเอ็นเออาจรั่วไหลจากการสลาย
ตัวอย่างและต่อมาถูกย้ายข้ามชั้นตะกอนโดยการ
ซึมน้ำทำให้การตรวจสอบยาก.
วิธีการเหล่านี้ทำให้การใช้ฐานข้อมูลที่มีอยู่ (เช่น EMBL
หรือ GenBank) สำหรับการเปรียบเทียบลำดับ (เช่น เพื่อสร้าง
ชุมชนทั้งโรงงานจาก Quaternary) แต่
ความละเอียดอนุกรมวิธานถูก จำกัด ด้วยจำนวนของสายพันธุ์สำหรับ
ลำดับซึ่งมีอยู่ในฐานข้อมูล ระบบ
การจัดลำดับของพันธุ์ไม้ในท้องถิ่นหรือภูมิภาคเสร็จสมบูรณ์โดยใช้สูง
อนุรักษ์คู่ไพรเมอร์เช่น
RBC
L (เชส
, et al
., 1993) หรือ
TRN
LF (Taberlet
, et al
., 1991) ของ cpDNA จะช่วยให้
นักวิจัยสามารถใช้ประโยชน์จากอำนาจเต็มของดังกล่าว วิธีการ.
การศึกษาตามตัวอย่างเนื้อมีหนังไม่อนุญาตให้มีการประเมินผล
ของความถูกต้องของทุกลำดับที่ได้รับ แต่
กลุ่มของลำดับฉันทามติจากโคลนหลายคนที่จะ
ถูกนำมาใช้ (Poinar
et al,
1998;. Hofreiter
et al,
2000;. Hofreiter
et al,
2003.) ส่งผลในการแก้ปัญหาการจัดหมวดหมู่ที่ลดลง ในฐานะที่เป็น
ผลที่ตามมาก็เป็นเพียงชุมชนโรงงานสร้างขึ้นใหม่โดยรวม
องค์ประกอบที่ใช้ในการประเมินว่าผลเป็นที่
ที่เหมาะสม ตัวอย่างเช่นส่วนมูลของพื้นดินสูญพันธุ์
เฉื่อยชาจากประเทศสหรัฐอเมริกาตะวันตกเฉียงใต้ (Poinar
, et al
., 1998) หรืออาร์เจนตินา
(Hofreiter
, et al
., 2003) ได้รับการวิเคราะห์ดีเอ็นเอ chloroplast
และเกสรบวกพืชซากหนังกำพร้าตามลำดับ ทั้งใน
ภูมิภาคที่มีการทับซ้อนกันมากระหว่างทางพันธุกรรมและ
การตรวจวัดลักษณะทางสัณฐานวิทยาอย่างน้อยในระดับครอบครัว.
ต่อประชากร palaeogenetics
สนใจล่าสุดยังได้รับโดยตรงต่อการศึกษา
ความหลากหลายadnÃในพันธุ์พืชป่า (เช่นความหลากหลายของดีเอ็นเอ
ในหมู่ประชากรและภายใน) การ ประโยชน์จากความรู้
ที่มีอยู่จากการสำรวจ phylogeographical) การศึกษาดังกล่าว
ให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่เข้าสู่กระบวนการ diachronical โดยพิจารณา
มากกว่าเพียงหนึ่งจุดในเวลาที่สถานที่ที่กำหนด ตัวอย่างเช่น
<100 ปีวัสดุสมุนไพรเก่าได้ถูกนำมาใช้เพื่อสร้าง
การกำหนดเวลาและเส้นทางของการบุกรุกโดย genotype nonnative ของ
สามัญกก
Phragmites Australis
เข้ามาในอเมริกาเหนือ
ในช่วงศตวรรษที่ยี่สิบ (Saltonstall, 2002, 2003) ในทำนองเดียวกัน
ความหลากหลาย allelic ในไมโครนิวเคลียร์ถูกกำหนดจาก
ตัวอย่างของหญ้าทะเล
Posidonia oceanica
ถึง 4000 ปีเก่า
(Raniello & Procaccini, 2002) ในการศึกษาอื่นเบื่อหน่าย
ความหลากหลายของยีนหลายนิวเคลียร์ได้รับการประเมินจากดีเอ็นเอ
ขยายจากแก่นฟอสซิลหกต้นไม้ของต้นซีดาร์ญี่ปุ่น
Cryptomeria japonica
ที่ได้รับการฝังอยู่ประมาณ 3600 ปี,
และผลที่ได้มาเปรียบเทียบกับข้อมูลจาก presentday ใกล้เคียง
ประชากร (เจริญศรี
และคณะ
. 2003) จะเป็นการดีสำหรับประชากรเช่น
การสำรวจหลายตัวอย่างที่เหมาะสมสำหรับการวิเคราะห์adnÃจะต้อง
จากแต่ละสถานที่และช่วงเวลา ดังนั้นการพิสูจน์
ความถูกต้องของแต่ละกลุ่มตัวอย่างจำนวนมากอย่างรวดเร็วอาจจะกลายเป็น
ข้อ จำกัด มาก เพื่อรับมือกับตัวเลขตัวอย่างสูงเพียงพอ
จำลองแบบของการสกัดสาร DNA และ PCRs สามารถทำได้
ในขณะที่การ จำกัด การโคลน / ลำดับเพียงส่วนหนึ่งของกลุ่มตัวอย่าง
(Taberlet
et al,
1996;. & สเปนเซอร์ฮาว 2004).
การเลือกเทคนิคที่เหมาะสมและเครื่องหมาย
การใช้งาน ของแบบ real-time PCR ในการศึกษาadnÃ
มุ่งเน้นไปที่ระดับประชากรต้องมีการประเมินผลอย่างรอบคอบของ
เทคนิคโมเลกุลที่ใช้ในการตอบคำถามแต่ละคำถามที่เฉพาะเจาะจง.
เรียลไทม์

อาจจะกลายเป็นมาตรฐานในการศึกษาของadnÃ
(Pruvost & Geigl, 2004) เพราะมันรวมข้อดีหลายประการ
ดังที่ระบุไว้ด้านล่าง.
Real-time PCR มีวิธีการที่เชื่อถือได้เพื่อวัดปริมาณ
ความเข้มข้นของดีเอ็นเอเดิมอยู่ในสารสกัดจาก
สิ่งมีชีวิตเป้าหมาย (Poinar
, et al
., 2003) โดยการใช้ที่เฉพาะเจาะจงสูง
ไพรและสอบสวน oligonucleotide ประกอบกับ
ส่วนงานภายในของลำดับเป้าหมายการขยายของ
ใด ๆ nontarget - โบราณหรือที่ผ่านมา - ปัจจุบันดีเอ็นเอในสารสกัดจาก
(เช่นที่เกิดจากการปนเปื้อน microorganismal) ได้รับการยกเว้น
เบื้องต้น เช่นเดียวกับไพรเมอร์, สอบสวน anneals กับแม่แบบ
ลำดับ แต่ถูกตัดอย่างต่อเนื่องโดยโพลิเมอร์ในระหว่าง
การยืดตัวของดีเอ็นเอสังเคราะห์ใหม่ Probe
แตกแยกส่งเสียงสัญญาณเรืองแสงที่มีการบันทึกไว้ในช่วง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

คิม

et al . , 2004 ) ไม่น่าเปลี่ยนความคิดนี้ ในส่วน
เพราะลำดับเดียวกันยังไม่ได้รับอิสระ
มุ่งมั่นในปฏิบัติการอื่น นักวิจัยศึกษาตัวอย่างโบราณเช่น
ต้องให้ความร่ำรวยของ
หลักฐานที่จะโน้มน้าวให้ชุมชนวิทยาศาสตร์เกี่ยวกับความถูกต้องลำดับ
.

ยกชนิดระบุในตัวอย่างแนวโน้มล่าสุดในการวิจัยแอดนา คือการระบุชนิด จาก
ลำดับสกัดและขยายจากตัวอย่างฟอสซิลยก
( เช่นจากมูลสัตว์ในเนื้อหา หรือแม้แต่ดินดิบ ;
รูปที่ 2B ) ซึ่งยังคงเป็นบุคคล รวมทั้งพืช
ไม่เสมอแน่นอน ระบุ ซึ่งมองเห็นด้วยตาเปล่า . ตัวอย่าง
คอโปรไลต์สัตว์กินพืชหรือฟอสซิลอุจจาระ
วัสดุได้ถูกใช้เป็นแหล่งที่มาของพืช ( แอ็ดน่า พอยนาร์

et al . , 2001 ; hofreiter

et al . , 2003 ) สรุปว่าอาหารรวมทั้ง
พืชปัจจุบันสะสมเวลาของอุจจาระขึ้น

14 000 ปีมาแล้ว ในลักษณะเดียวกัน รถของหนูถูก
วิเคราะห์สรุปองค์ประกอบของพืช ( Quaternary


kuch et al . , 2002 ) ส่วนเนื้อหาของลำไส้และลำไส้ใหญ่ของเอิตซี
,เยือนไอซ์แมนที่อาศัยอยู่ราว 5 , 000 ปี
มาแล้ว ทำการบูรณะมื้อสุดท้ายของเขา ( รอลโล


et al . , 2002 ) เมื่อเร็ว ๆนี้ , et al willerslev

( 2003 ) ดึง
แอดนา พืชจากความหลากหลายของตะกอนดิน รวมถึง permafrost ลงวันที่
ถึง 400 000 ปีก่อน ปัจจุบัน การให้ข้อมูลทางพันธุกรรม
จากวัสดุนี้ในกรณีที่ไม่มีหลักฐาน macrofossil . ใน
กระดาษนี้ผู้เขียนยืนยันว่า ลำดับพวกเขาขยาย
เป็นตัวแทนเก่าแก่โบราณตรวจสอบลำดับดีเอ็นเอ
รู้จักวันที่ การประเมินที่หลากหลายมากขึ้นตะกอน
รวมทั้งจากการตั้งค่าพอสมควร และการวิเคราะห์จุลินทรีย์อาจเป็นตัวแทนของชุมชนไปด้วยกัน

avenues สัญญาเพื่อการพัฒนาใน palaeogenetics พืช
เพิ่มเติม ( willerslev

et al . , 2003 ) อย่างไรก็ตามหนึ่งควรจะตระหนักถึงความเป็นไปได้ที่ดีเอ็นเอของโมเลกุล

อาจรั่วจากสลายตัวอย่างและต่อมาถูกย้ายข้ามชั้นตะกอนด้วย
การรั่วซึมของน้ำ ทำให้ตรวจสอบยาก
วิธีการเหล่านี้ใช้ฐานข้อมูลที่มีอยู่ ( เช่น สัตว
หรือ 5% ) สำหรับการเปรียบเทียบลำดับ ( เช่นการสร้างโรงไฟฟ้าชุมชนทั้งหมดจาก
Quaternary ) อย่างไรก็ตาม
ความละเอียดและถูก จำกัด ด้วยจำนวนของสายพันธุ์
ซึ่งลำดับมีอยู่ในฐานข้อมูล ระบบ
การสมบูรณ์ในท้องถิ่นหรือภูมิภาคที่ใช้ในเชิงอนุรักษ์ัย
primer คู่ เช่น
RBC
L ( ไล่

et al . , 1993 ) หรือ trn

l-f ( taberlet

et al . , 1991 ) cpdna จะช่วยให้นักวิจัยเพื่อใช้ประโยชน์จากพลังเต็ม

ของแนวทางดังกล่าวศึกษาจากตัวอย่างที่ยกไม่อนุญาตให้มีการประเมิน
ของความถูกต้องของทุก ๆลำดับได้ แทน
กลุ่มฉันทามติลำดับจากโคลน หลายแห่งมีการใช้ (



พอยนาร์ et al . , 1998 ; hofreiter

et al . , 2000 ; hofreiter

et al . , 2003 ) ส่งผลให้ลดลงและความละเอียด โดย
นั้น มันเป็นเพียงสร้างสังคมพืช
โดยรวมองค์ประกอบที่ใช้ประเมินหากผลลัพธ์
ที่เหมาะสม ตัวอย่างเช่น มูลสัตว์ ส่วนของ Sloth พื้นดิน
สูญพันธุ์จากตะวันตกทางใต้ของอเมริกา (

พอยนาร์ et al . , 1998 ) หรืออาร์เจนตินา
(

hofreiter et al . , 2003 ) วิเคราะห์หา DNA ของคลอโรพลาสต์และเกสรบวก
พร้าพืชยังคงตามลำดับ ทั้ง
ภูมิภาค มันทับซ้อนกันมากระหว่างพันธุกรรมและลักษณะทางสัณฐานวิทยา determinations
,อย่างน้อยในระดับครอบครัว ประชากร palaeogenetics

ต่อความสนใจล่าสุดยังได้มุ่งไปที่การศึกษา
แอดนา ความหลากหลายในชนิดของพืชในป่า ( เช่น DNA ระหว่างและภายในประชากรล

) การใช้ประโยชน์จากความรู้ จากการสำรวจ phylogeographical ใช้ได้ )
การศึกษาดังกล่าวให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่เข้าสู่กระบวนการพิจารณา diachronical
โดยมากกว่าหนึ่งในเวลาที่กำหนดให้สถานที่ ตัวอย่างเช่น
< 100 ปีเก่าอย่างวัสดุได้ถูกใช้เพื่อสร้าง
เวลาและเส้นทางของการรุกรานโดย nonnative genotype ของ

ปกติรีดก่อน

Australis ในทวีปอเมริกาเหนือในศตวรรษที่ยี่สิบ ( saltonstall , 2002 , 2003 ) โดย
allelic ความหลากหลายในนิวเคลียร์ถูกกำหนดจาก
ไมโครแซเทลไลต์ตัวอย่างของหญ้าทะเล ISTHMOS OCEANICA

ถึง 4 , 000 ปีเก่า
( raniello & procaccini , 2002 ) ในอีกการศึกษา ความหลากหลายของยีนหลายยีน
นิวเคลียร์ประมาณจากดีเอ็นเอ
ขยายจากฟอสซิลแก่นของต้นไม้ซีดาร์ 6 ญี่ปุ่น

cryptomeria ญี่ปุ่นที่ได้รับการฝัง ประมาณ 3 , 600 ปี
และเปรียบเทียบกับข้อมูลที่ได้จากประชากรใกล้เคียง presentday


( ทานิ et al . ,2003 ) เหมาะสำหรับการสำรวจประชากร
เช่น หลายตัวอย่างที่เหมาะสมสำหรับการวิเคราะห์แอ็ดน่าา
จากแต่ละสถานที่ และเวลา ดังนั้น การพิสูจน์ความถูกต้องของแต่ละคน

มากมากได้อย่างรวดเร็วกลายเป็นจำกัด เพื่อรับมือกับตัวเลขตัวอย่างสูง งานของการสกัดดีเอ็นเอและ pcrs เพียงพอ

อาจจะแสดงในขณะที่การ จำกัด การโคลน / ลำดับเท่านั้น บางส่วนของตัวอย่าง
(

taberlet et al . , 1996 ; สเปนเซอร์& Howe , 2004 ) การเลือกวิธีการที่เหมาะสมและเครื่องหมาย

ใช้เรียลไทม์พีซีอาร์ในแอดนา การศึกษา
เน้นระดับประชากรต้องมีการประเมินผลด้วย
ของเทคนิคที่ใช้ในการตอบคำถามแต่ละคำถามที่เฉพาะเจาะจง .


เวลาจริงอาจกลายเป็นมาตรฐานในการศึกษา
แอดนา( pruvost & geigl , 2004 ) , เนื่องจากมันรวมข้อดีหลาย

เวลาจริงตามที่ระบุด้านล่าง โดยมีวิธีการที่เชื่อถือได้เพื่อวัดปริมาณความเข้มข้นเดิม
ดีเอ็นเอในปัจจุบันเป็นสารสกัดจากสิ่งมีชีวิต ( เป้าหมาย พอยนาร์


et al . , 2003 ) โดยใช้ไพร์เมอร์จำเพาะ
สูงและประกอบกับการสอบสวนซึ่ง
ส่วนภายในของลำดับเป้าหมาย การเพิ่มปริมาณของ