2.3. Zebrafish embryo collection an

2.3. Zebrafish embryo collection and exposure
Adult wild type ZF obtained from a local supplier (Big Al’s
Aquarium, Ottawa, ON) were maintained in holding tanks at
28 C on a 14:10 h light–dark cycle in a flow-through system (Aquatic Habitats, Apopka, FL) using aerated, dechloraminate d City of Ottawa tap water. Plastic embryo collection traps were set be- tween 4 and 6 PM and collected the following morning within 1 h of spawning between 9 and 10 AM. Collected embryos were placed in petri dishes containing egg water and incubated at 28 C until separated into experimental groups.
At 3 hpf, 10–20 embryos were randomly assigned to 5.3 cm plastic petri dishes, containing a total volume of 14 mL egg water suppleme nted with 1 ml of AgNPs, AgNO 3 (Ag+), or MilliQ water (for control embryos). Total Ag concentrations used were 0.03, 0.16, 0.31, 0.78, and 1.55 lg mL1 which are similar to concentra tions of AgNPs used in previous studies with zebrafish embryos (AshaRani et al., 2008, 2011; Bar-Ilan et al., 2009; George et al., 2011; Powers et al., 2011 ). These concentration s are similar to the concentra tions used in other studies and are higher than the predicted environmental concentration of 0.09–2.63 ng L1 AgNPs in surface water (Gottschal k et al., 2009 ). Our preliminary expo- sures to predicted environmental levels did not impact embryo survival or hatching success and hence higher concentration s were chosen for the remainder of the study. For ‘rescue’ experiments, cysteine (5 lg mL1 final concentra tion) was prepared in water and added to the egg water prior to the addition of the aforemen- tioned Ag treatments. Although Cys complexes with Ag at 1:1 (Liu and Sun, 1981 ), its concentration in this study was 3.5 times low- er than the highest Ag+ concentra tion to maintain neutral pH of the embryo medium. All exposures were carried out in an incubator (Heraeus D-6450) at 28 C until 5 dpf without medium change. Embryos were not fed as the yolk sac provides sufficient nutrients until depleted at approximate ly 6 dpf (Westerfield, 2000 ). At 5 dpf the ZF larvae were euthanized with an overdose of tricaine meth- anesulfonate (0.016%), rinsed with distilled water to remove excess AgNPs, Ag+, and Cys, and preserved in an appropriate medium: for enzyme assays, ice-cold KPB-50 buffer (50 mM KPi buffer, pH 7, containing 0.5 mM EDTA), and for glutathione assays, ice-cold 5% sulfosalicy lic acid (previously bubbled with nitrogen gas for 20 min). Tubes were flash frozen in liquid nitrogen and stored at 80 C until assays were performed.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3. ปลาม้าลายตัวอ่อนเก็บและรับแสง ชนิดป่าผู้ใหญ่ ZF ได้รับจากซัพพลายเออร์ในท้องถิ่น (บิ๊กอัล พิพิธภัณฑ์สัตว์น้ำ ออตตาวา ON) ถูกเก็บรักษาไว้ในถังที่28 C บน 14:10 ชม.แสง – มืดรอบในไหลผ่านระบบ (แหล่งอาศัยสัตว์น้ำ Apopka, FL) ที่ใช้อากาศ d dechloraminate เมืองออตตาวาแตะน้ำ ดักเก็บพลาสติกอ่อนตั้งได้แต่ 4 และ 18.00 และรวบรวมเสร็จภายใน 1 ชม.ของการวางไข่ระหว่าง 9 และ 10: 00 เก็บตัวอ่อนถูกวางลงในจานเพาะที่ประกอบด้วยน้ำไข่ และที่ 28 C จนแบ่งเป็นกลุ่มทดลองได้รับการกกที่ 3 hpf, 10 – 20 ตัวอ่อนถูกกำหนดแบบสุ่ม 5.3 ซม.พลาสติกเพาะอาหาร ที่ประกอบด้วยผลรวมปริมาณของ 14 มล.ไข่น้ำ suppleme nted กับ 1 มล.น้ำ AgNPs, AgNO 3 (Ag +), หรือ MilliQ (สำหรับตัวควบคุมตัวอ่อน) ใช้ความเข้มข้นของ Ag รวมเป็น 0.03, 0.16, 0.31, 0.78 และ 1.55 mL1 lg ซึ่งคล้ายกับ concentra ทุกระดับของ AgNPs ที่ใช้ในการศึกษาก่อนหน้านี้ด้วยโคลนปลาม้าลาย (AshaRani et al. 2008, 2011 บาร์ลาน et al. 2009 จอร์จ et al. 2011 อำนาจ et al. 2011) S ความเข้มข้นเหล่านี้จะคล้ายกับทุกระดับ concentra ที่ใช้ในการศึกษาอื่น ๆ และอยู่สูงกว่าความเข้มข้นด้านสิ่งแวดล้อมคาดการณ์ของ 0.09 – 2.63 ng AgNPs L1 ในน้ำผิวดิน (Gottschal k et al. 2009) ของเราเบื้องต้น sures expo เพื่อคาดการณ์สิ่งแวดล้อมระดับไม่ส่งผลกระทบต่อความสำเร็จอยู่รอดหรือฟักไข่ตัวอ่อน และความเข้มข้นสูงดังนั้น s ถูกเลือกสำหรับส่วนเหลือของการศึกษา สำหรับการทดลอง 'ช่วยเหลือ' cysteine (5 lg mL1 concentra สุดท้ายทางการค้า) ในน้ำ และลงในน้ำไข่ก่อนนอกเหนือจากการรักษา aforemen tioned Ag แม้ว่า Cys คอมเพล็กซ์กับ Ag ที่ 1:1 (หลิวและอาทิตย์ 1981), ความเข้มข้นในการศึกษานี้เป็นเวลา 3.5 ต่ำ - เอ้อ กว่าสูง Ag + concentra ทางการค้าเพื่อ รักษาค่า pH เป็นกลางของสื่อตัวอ่อน แสงทั้งหมดถูกดำเนินในตู้อบ (ก๊าซ D-6450) การที่ 28 C dpf 5 โดยไม่เปลี่ยนขนาดกลางจนถึง ตัวอ่อนไม่ถูกป้อนเป็นถุงแดงให้สารอาหารที่เพียงพอจนกระทั่งหมดเวลาลีประมาณ 6 dpf (Westerfield, 2000) ที่ 5 dpf ZF อ่อน euthanized กับการใช้ยาเกินขนาดของ tricaine ปรุงยา-anesulfonate (0.016%), ล้าง ด้วยน้ำกลั่นเอาส่วนเกิน AgNPs, Ag + และ Cys และเก็บไว้ในสื่อเหมาะสม: สำหรับเอนไซม์ assays ฉ่ำบัฟเฟอร์ KPB-50 (บัฟเฟอร์ KPi 50 มม. 0.5 มม. EDTA ที่ประกอบด้วยค่า pH 7 ), และ assays กลูตาไธโอน ฉ่ำ 5% sulfosalicy lic กรด (ก่อนหน้านี้ฟอง ด้วยก๊าซไนโตรเจน 20 นาที) หลอดถูกแฟลชแช่แข็งในไนโตรเจนเหลว และเก็บไว้ที่ 80 C จน assays ดำเนินการ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 คอลเลกชันของปลาม้าลายและการสัมผัสผู้ใหญ่ป่าประเภท ZF ได้รับจากซัพพลายเออร์ท้องถิ่น ( บิ๊กอัลพิพิธภัณฑ์สัตว์น้ำ , ออตตาวา ) ถูกเก็บรักษาไว้ในถังที่ถือ28 C กับ H แสงและมืดถ้ามีวงจรในระบบ flow-through ( แหล่งน้ำ apopka , FL ) โดยใช้การสำรวจ dechloraminate D , เมืองออตตาวาประปา คอลเลกชันของกับดักพลาสติกชุด - ทวี 4 และ 6 โมงเย็นและเก็บตอนเช้าภายใน 1 ชั่วโมงของการวางไข่ ระหว่าง 9 และ 10 เป็นดังต่อไปนี้ เก็บไปเลี้ยงไว้ในจานเลี้ยงเชื้อที่มีน้ำไข่และบ่มที่อุณหภูมิ 28 C จนแยกออกเป็น 2 กลุ่มที่ความถี่ 3 , 10 และ 20 เปอร์เซ็นต์ มีวัตถุประสงค์เพื่อ 5.3 ซม. พลาสติกจานเลี้ยงเชื้อที่มีปริมาณรวมของ 14 น้ำไข่ suppleme ต้องการ 1 มิลลิลิตร agnps เคมี , 3 ( Ag + ) หรือ milliq น้ำ ( ตัวควบคุม ) โดยรวมที่ระดับความเข้มข้น 0.03 , 0.16 , 0.31 , 0.78 และ 1.55 LG ml1 ซึ่งคล้ายกับครุ่นคิด tions ของ agnps ใช้ในการศึกษาก่อนหน้านี้กับปลาม้าลายตัว ( asharani et al . , 2008 , 2011 ; บาร์ Ilan et al . , 2009 ; จอร์จ et al . , 2011 ; พลัง et al . , 2011 ) . ความเข้มข้นของเหล่านี้จะคล้ายกับที่ใช้ในการศึกษาอื่น ๆและครุ่นคิด tions สูงกว่าคาดการณ์ของสิ่งแวดล้อมของ 0.09 – 2.63 ของ L1 agnps ในน้ำผิวดิน ( gottschal k et al . , 2009 ) งานแสดงสินค้า - เบื้องต้นของเราอีกครั้งเพื่อทำนายระดับสิ่งแวดล้อมไม่มีผลต่อตัวอ่อนฟัก และความอยู่รอด หรือความสำเร็จ ดังนั้นความเข้มข้นของถูกเลือกสำหรับส่วนที่เหลือของการศึกษา ' การทดลองกู้ภัย ' ซิสเทอีน ( 5 ) ml1 สุดท้ายครุ่นคิด tion ) ถูกเตรียมไว้ในน้ำและเพิ่มไข่ในน้ำก่อนที่จะเพิ่มของ aforemen - tioned รักษาเอจี . แม้ว่าภาวะเชิงซ้อนกับ AG ที่อัตราส่วน 1 : 1 ( เล่าปี่และซุน , 1981 ) , ความเข้มข้นของการศึกษานี้เป็น 3.5 เท่า ต่ำ - เอ้อกว่าสูงสุด AG + ครุ่นคิด tion เพื่อรักษา pH เป็นกลางของตัวอ่อนปานกลาง รูปทั้งหมดถูกหามออกไปในตู้อบ ( Heraeus d-6450 ) ที่ 28 C จนถึง 5 DPF โดยไม่เปลี่ยนกลาง เลี้ยงไม่เลี้ยง เช่น ถุงไข่แดงมีสารอาหารเพียงพอจนหมดที่ประมาณเกือบ 6 DPF ( เวสเตอร์ฟิลด์ , 2000 ) ที่ 5 ได้รับการ ZF ~ i ) euthanized กับยาเกินขนาดของ tricaine ยาบ้า - anesulfonate ( 0.016 % ) , ล้างด้วยน้ำกลั่นเพื่อลบส่วนเกิน agnps AG + และภาวะ และเก็บรักษาไว้ในตัวกลางที่เหมาะสมสำหรับตรวจเอนไซม์ น้ำแข็งเย็น kpb-50 บัฟเฟอร์ ( 50 มม. KPI บัฟเฟอร์ pH 7 ที่มี 0.5 mM EDTA ) และสำหรับกลูต้าไธโอน หรือ น้ำแข็งเย็น 5 % sulfosalicy LIC กรด ( ก่อนหน้านี้มีฟองแก๊สไนโตรเจน 20 min ) หลอดแฟลชแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวและมีอุณหภูมิ 80 องศาเซลเซียส จนพบซาก