2.8. Relative-quantitative real-tim

2.8. Relative-quantitative real-time PCR
The oligonucleotide primers for individual genes (Table 2) were
designed using Primer Premier 5 software with amplicon lengths of
93–271 bp. Gene specificity test for all primer sets was performed as
described in a previous study (Wang et al., 2013). The efficiency of
each primer set was evaluated by producing a standard curve using
serial dilutions of a cDNA mixture from petals, and efficiency values
(ranging from 94.2% to 107.3%) were automatically calculated by
Bio-Rad CFX manager software (Table 2).
Real-time PCR was performed on a Miniopticon Real-Time PCR
instrument (Bio-Rad, USA) using SYBR Green to detect dsDNA synthesis. The reaction mixture (20 L total volume) contained 10 L
of SYBR
®
Premix Ex TaqTM
(TaKaRa, Japan), 0.4 L of each primer
(10 M), 2 L of diluted cDNA, and 7.2 L of ddH2O. The PCR program was carried out with an initial step of 95
◦
C for 30 s and 40
cycles of 95
◦
C for 5 s, 60
◦
C for 34 s; then 95
◦
C for 15 s, 60
◦
C for
20 s and 95
◦
C for 15 s for the dissociation stage. No-template controls for each primer set were included in every reaction, and the
real-time RT-PCR was replicated three times for each sample. The
mRNA levels of PsbHLH1, PsbHLH3, PsWD40-1, PsWD40-2, PsMYB2,
PsCHS1, PsCHI1, PsF3H1, PsF3

H1, PsDFR1 and PsANS1 were normalized relatively to the reference gene Psubiquitin (Wang et al.,
2012).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.8. PCR ญาติเชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ไพรเมอร์ oligonucleotide สำหรับแต่ละยีน (ตาราง 2) ถูกออกแบบโดยใช้ซอฟต์แวร์พื้น 5 พรีเมียร์กับ amplicon ความยาวของทำเป็น bp. 93 – 271 ทดสอบ specificity ยีนชุดรองพื้นทั้งหมดอธิบายไว้ในการศึกษาก่อนหน้านี้ (วัง et al., 2013) ประสิทธิภาพของแต่ละชุดพื้นถูกประเมิน โดยการผลิตโดยใช้เส้นโค้งมาตรฐานdilutions อนุกรมผสมระหว่าง cDNA จากกลีบ และค่าประสิทธิภาพ(ตั้งแต่ 94.2% 107.3%) คำนวณได้โดยอัตโนมัติโดยไบโอ-Rad CFX จัดการซอฟต์แวร์ (ตาราง 2)ทำ PCR แบบเรียลไทม์บนยัง Miniopticon Real-Time PCRตราสาร (Bio Rad สหรัฐอเมริกา) ใช้ SYBR Green สืบ dsDNA สังเคราะห์ ส่วนผสมของปฏิกิริยา (20 L ปริมาตรรวม) อยู่ 10 Lของ SYBR®Premix Ex TaqTM(TaKaRa ญี่ปุ่น), 0.4 L พื้นแต่ละ(10 M), cDNA แตกออก 2 ลิตร และ L 7.2 ของ ddH2O โปรแกรม PCR ได้รับการดำเนินขั้นตอนการเริ่มต้นของ 95◦C สำหรับ 30 s และ 40วงจรของ 95◦C สำหรับ 5 s, 60◦C สำหรับ 34 s แล้ว 95◦C 15 s, 60◦C สำหรับ20 s และ 95◦C 15 s ขั้น dissociation รวมอยู่ในทุกปฏิกิริยา ตัวควบคุมไม่มีแม่แบบสำหรับแต่ละชุดสีรองพื้นและแบบเรียลไทม์ RT-PCR ถูกจำลองสามครั้งสำหรับตัวอย่างแต่ละแบบ ที่ระดับ mRNA ของ PsbHLH1, PsbHLH3, PsWD40 1, PsWD40 2, PsMYB2PsCHS1, PsCHI1, PsF3H1, PsF3H1, PsDFR1 และ PsANS1 ได้ตามปกติค่อนข้างจะยีนอ้างอิง Psubiquitin (Wang et al.,2012)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.8 . สัมพันธ์เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์พีซีอาร์โดยใช้ไพรเมอร์สำหรับยีน
ซึ่งบุคคล ( ตารางที่ 2 )
ออกแบบโดยใช้ซอฟต์แวร์พรีเมียร์ 5 กับรองพื้นและความยาวของ
93 –คุณบีพี ชุดทดสอบตรวจหายีนสำหรับไพรเมอร์ทั้งหมดแสดงเป็น
อธิบายไว้ในการศึกษาก่อนหน้านี้ ( Wang et al . , 2013 ) ประสิทธิภาพของชุดตรวจสอบ แต่ละคู่

โค้งใช้ผลิตมาตรฐานอนุกรมผสมเจือจางของ cDNA จากกลีบดอกและประสิทธิภาพค่า
( ตั้งแต่ร้อยละ 94.2 % ROI ) โดยอัตโนมัติคำนวณโดย
ไบโอ ราด cfx ผู้จัดการซอฟต์แวร์ ( ตารางที่ 2 ) .
เวลาจริงและแสดงบน miniopticon เวลา PCR จริง
เครื่องดนตรี ( สหรัฐอเมริกาไบแรด ) โดยใช้การตรวจสอบการสังเคราะห์ dsdna SYBR กรีน . ปฏิกิริยาผสม ( 20  L ปริมาณ ) จำนวน 10  L


รวมของ SYBR ® taqtm
( ทาการะ แฟนเก่า ,ญี่ปุ่น ) 0.4 ลิตรละ  รองพื้น
( 10  M ) , 2  ล. เจือจางยีน และ  7.2 ลิตร ddh2o โปรแกรมสามารถดำเนินการกับขั้นตอนการเริ่มต้นของ◦ 95

C 30 และ 40 ◦


รอบ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 วินาที , 60

b ◦ 34 s ; แล้ว 95
◦
C 15 s 60
◦
C
20 และ 95
◦
C 15 สำหรับการเวที ไม่มีแม่แบบการควบคุมแต่ละ primer ชุดรวมทุกปฏิกิริยาและ
วิธีเรียลไทม์เป็นจำนวนสามครั้งสำหรับแต่ละตัวอย่าง
ของระดับของ psbhlh1 psbhlh3 pswd40-1 pswd40-2 , , , ,
psmyb2 pschs1 pschi1 psf3h1 , , , ,

psf3  H1 , psdfr1 psans1 เป็นปกติและค่อนข้างที่จะอ้างอิงยีน psubiquitin ( Wang et al . ,
2012 )