2.4. Mass spectrometry analysis of

2.4. Mass spectrometry analysis of the recombinant proteins
Selected gel bands of the optimum time points of each allergen
(2 h) were incised and subjected to mass spectrometry analysis.
The gel bands were in-gel-digested with trypsin and incubated
overnight at 37 ◦C to digestthe proteins into peptides. In-gel-digest
samples were analysed on a LTQ Orbitrap Elite (Thermo Scientific)
coupled to an Ultimate 3000 RSLC nanosystem (Dionex). The
nanoLC system was equipped with an Acclaim Pepmap nano-trap
column and an Acclaim Pepmap analytical column. 2 l of the
peptide mix (i.e. each digested band) was loaded onto the trap
column of 3% CH3CN containing 0.1% formic acid for 5 min before
the enrichment column is switched in-line with the analytical column.
The LTQ Orbitrap Elite mass spectrometer was operated in
the data-dependent mode, whereby spectra were acquired first
in positive mode followed by collision induced activation (CID).
Ten of the most intense peptide ions with charge states ≥2 were
isolated and fragmented using normalized collision energy of 35
and activation Q of 0.25 (CID). Data analysis was carried out
using Proteome Discoverer (Thermo Scientific version 1.4) with
Mascot against the BIRDS database. Search parameters were precursor
mass tolerance of 10 ppm, fragment mass tolerance of 0.6 Da
(CID). Carbamidomethyl of cysteine was set as fixed modification
and oxidised methionine as a variable modification. Trypsin
with maximum of 1 missed cleavage was used as the cleavage
enzyme.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4. มวลหลักวิเคราะห์ของ recombinant โปรตีนวงเจเลือกคะแนนครั้งที่ดีที่สุดของแต่ละสารก่อภูมิแพ้(2 ชั่วโมง) incised และผ่านการวิเคราะห์สเปกโตรเมทวงเจได้ใน-เจลย่อยกับทริปซิน และได้รับการกกค้างคืนที่ ◦C 37 กับโปรตีน digestthe เป็นเปปไทด์ เจย่อยตัวอย่างที่วิเคราะห์บนยอดเป็น Orbitrap LTQ (วิทยาศาสตร์เทอร์โม)ควบคู่ไปกับการ RSLC 3000 สุด nanosystem (Dionex) การระบบ nanoLC พร้อมกับนาโนกับดัก Acclaim Pepmapคอลัมน์และคอลัมน์วิเคราะห์ Acclaim Pepmap 2 ลิตรในผสมเปปไทด์ (นั่นคือแต่ละวงย่อย) ถูกโหลดลงในกับดักคอลัมน์ 3% CH3CN ประกอบด้วย 0.1% กรดฟอร์มิก 5 นาทีก่อนเปิดคอลัมน์เพิ่มคุณค่าในบรรทัด มีคอลัมน์วิเคราะห์สเปกโตรมิเตอร์มวล LTQ Orbitrap ยอดถูกดำเนินการในโหมดขึ้นอยู่กับข้อมูล โดยสเป็คได้รับมาก่อนในโหมดบวกตาม ด้วยชนเกิดเปิดใช้งาน (CID)สิบของไอออนเปปไทด์ที่รุนแรงที่สุดมีค่า≥ 2 อเมริกาได้หนึ่ง ๆ และมีการกระจายโดยใช้ตามปกติแรงกระแทกของ 35และการเปิดใช้งาน Q 0.25 (CID) ดำเนินการวิเคราะห์ข้อมูลใช้ Proteome Discoverer (เทอร์โมวิทยาศาสตร์รุ่น 1.4) ด้วยมิ่งขวัญกับฐานข้อมูลของนก ค้นหาพารามิเตอร์ได้สารตั้งต้นค่าเผื่อมวล 10 ppm ค่าเผื่อมวลส่วนดา 0.6(CID) Carbamidomethyl ของไส้ถูกตั้งค่าเป็นแก้ไขถาวรและ methionine oxidised เป็นการปรับเปลี่ยนตัวแปร ทริปซินสูงสุดความแตกแยกไม่ได้ที่ 1 ใช้เป็นความแตกแยกเอนไซม์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.4 วิเคราะห์มวลสารของโปรตีน
ที่เลือกวงดนตรีเจลในจุดระยะเวลาที่เหมาะสมของแต่ละสารก่อภูมิแพ้
(2 ชั่วโมง) มีรอยบากและอยู่ภายใต้การวิเคราะห์มวลสาร.
วงเจลอยู่ในเจล-ย่อยด้วย trypsin และบ่ม
ค้างคืนที่ 37 ◦Cไป โปรตีนเปปไทด์ Digestthe เข้า ในเจลย่อย
ตัวอย่างที่ได้มาวิเคราะห์ใน LTQ Orbitrap ยอด (Thermo Scientific)
คู่กับสุดยอด 3000 RSLC nanosystem (Dionex)
ระบบ nanoLC พร้อมกับโห่ร้อง Pepmap นาโนดัก
คอลัมน์และคอลัมน์วิเคราะห์โห่ร้อง Pepmap 2 ลิตรของ
ผสมเปปไทด์ (เช่นวงดนตรีแต่ละย่อย) ถูกโหลดเข้าสู่กับดัก
คอลัมน์ CH3CN 3% มีกรดฟอร์มิ 0.1% เป็นเวลา 5 นาทีก่อนที่จะ
คอลัมน์การเพิ่มปริมาณจะเปลี่ยนในแนวเดียวกันกับคอลัมน์วิเคราะห์.
สเปกโตรมิเตอร์มวล LTQ Orbitrap ยอด ได้รับการดำเนินการใน
โหมดขึ้นอยู่กับข้อมูลโดยสเปกตรัมที่ได้มาครั้งแรก
ในโหมดบวกตามด้วยการปะทะกันเหนี่ยวนำให้เกิดการเปิดใช้งาน (CID).
สิบของไอออนเปปไทด์ที่รุนแรงที่สุดที่มีค่าใช้จ่ายรัฐ≥2ถูก
โดดเดี่ยวและการแยกส่วนการใช้พลังงานชนปกติ 35
และเปิดใช้งาน Q 0.25 (CID) การวิเคราะห์ข้อมูลได้ดำเนินการ
โดยใช้โปรตีน Discoverer (Thermo Scientific รุ่น 1.4) กับ
Mascot กับฐานข้อมูลนก พารามิเตอร์การค้นหาเป็นปูชนียบุคคล
อดทนมวลของ 10 ppm ความอดทนมวลส่วนของ 0.6 ดา
(CID) Carbamidomethyl ของ cysteine ​​ถูกตั้งเป็นการปรับเปลี่ยนคงที่
และเหลี่ยม methionine เป็นตัวแปรการปรับเปลี่ยน trypsin
สูงสุด 1 ความแตกแยกพลาดถูกใช้เป็นความแตกแยก
เอนไซม์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.4 . การวิเคราะห์มวลสาร ของโปรตีนรีคอมบิแนนท์เลือกเวลาที่เหมาะสมของเจลแถบคะแนนของแต่ละสารก่อภูมิแพ้( 2 ชั่วโมง ) มีรอยสัก และต้องวิเคราะห์มวลสาร .เจลเจลรัดในทริปย่อยด้วย )ค้างคืนที่ 37 ◦ C ใน digestthe โปรตีนเปปไทด์ ย่อยในเจลวิเคราะห์ใน ltq orbitrap Elite ( เทอร์โมวิทยาศาสตร์ )คู่กับสูงสุด 3000 rslc nanosystem ( DIONEX ) ที่เป็นระบบ nanolc พร้อมกับโห่ร้อง pepmap นาโน กับดักคอลัมน์และโห่ร้อง pepmap วิเคราะห์คอลัมน์ 2 l ของเปปไทด์ผสม ( เช่นแต่ละย่อยวงดนตรี ) ถูกโหลดลงบนกับดักคอลัมน์ที่ 3 % ch3cn ที่ประกอบด้วย 0.1% กรดเป็นเวลา 5 นาที ก่อนการเปลี่ยนคอลัมน์ที่สอดคล้องกับคอลัมน์วิเคราะห์การ ltq orbitrap ยอดแมสสเปกโตรมิเตอร์ ดำเนินการในข้อมูลโดยขึ้นอยู่กับโหมดนี้ได้มาก่อนในโหมดบวกตามด้วยการปะทะกันเกิดการกระตุ้น ( CID )สิบสุดเข้ม เปปไทด์ไอออนด้วยค่าใช้จ่ายรัฐ≥ 2แยกและแยกส่วนโดยใช้พลังงานมาตรฐานการชนของ 35และเปิดใช้งาน Q 0.25 ( CID ) การวิเคราะห์ข้อมูลการค้นพบโปรตีน ( เทอร์โมวิทยาศาสตร์รุ่น 1.4 )นกมิ่งขวัญกับฐานข้อมูล พารามิเตอร์การค้นหาเป็นสารตั้งต้นมวลมากกว่า 10 ppm ส่วนมวลมากกว่า 0.6 ดา( CID ) carbamidomethyl ของซิสเทอีนเป็นชุดซ่อมดัดแปลงหมดและเมทไธโอนีน เป็น ตัวแปร การปรับเปลี่ยน ทริ ปซินกับสูงสุด 1 พลาดการใช้เป็นรอยปริแยกเอนไซม์