Total RNA was extracted using the R

Total RNA was extracted using the RNAprep pure plant total RNA extraction kit (Tiangen, Beijing, China) according to the manufacturer’s instructions. The possible DNA contamination was eliminated by adding RNase-free DNase I. The integrity of the RNA was detected by 0.8% agarose gel electrophoresis. The RNA samples were reversely transcribed into cDNAs. In brief, 5 L RNA mixed with 5 L dNTP (2.5 mM) and 1 L oligo d(T)15 was incubated for 5 min at 65 ◦C. The resulting mixture was cooled immediately, placed in 5 L M-MLV 5× reaction buffer, 1 L cloned ribonuclease inhibitor, 1 L M-MLV reverse transcriptase, and RNase-free ddH2O to a final volume of 25 L, mixed gently, and then incubated at 37 ◦C for 1 h. The reaction was completed at 70 ◦C for 15 min. The cDNA products were stored at−20 ◦C. Real-time PCR analysis was performed as described by Jain [27]. In brief, the cDNA samples were used as the template and mixed with 200 nM of each primer and SYBR Green PCR Real Master Mix (Tiangen, Beijing, China) for real-time PCR analysis using ABI 7500 Real Time PCR System and Software 7500 v2.0.3 (Applied Biosystems, USA) according to the manufacturer’s instructions. The PCR conditions were as follows: 95 ◦C for 3 min; 40 cycles of 95 ◦C for 30 s, 57 ◦C for 30 s, and 68 ◦C for 1 min. The fluorescence signal was obtained during the elongation at 68 ◦C of every cycle. Each pair of primers designed using Primer Express 3.0 software (Applied Biosystems, USA) was checked based on the BLAST program in tomato genomic sequence available in SGN and NCBI databases to ensure that the primers amplify a unique and desired cDNA segment. The primer sequences are listed in Table 1. The specificity of the reactions was verified by melting curve analysis. The relative mRNA levels for each of the Rubisco genes in RNA isolated from various samples were quantified with respect to the internal standard, actins. RT-qPCR was conducted with three replications.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

รวม RNA ถูกสกัดโดยใช้ RNAprep บริสุทธิ์พืชรวมชุดสกัดอาร์เอ็นเอ (Tiangen, ปักกิ่ง, จีน) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต การปนเปื้อนดีเอ็นเอที่เป็นไปได้ถูกกำจัดโดยการเพิ่ม RNase ฟรี DNase I. ความสมบูรณ์ของอาร์เอ็นเอที่ถูกตรวจพบ 0.8% ข่าวคราว agarose กลุ่มตัวอย่าง RNA ถูกคัดลอกลงในสลับ cDNAs ในช่วงสั้น ๆ 5? L RNA ผสมกับ 5? L dNTP (2.5 มิลลิเมตร) 1 L Oligo d (T) 15 ถูกบ่มเป็นเวลา 5 นาทีที่ 65 ◦C ผสมทำให้เย็นทันทีที่วางไว้ใน 5? L M-MLV 5 ×บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา 1 L โคลนยับยั้ง ribonuclease 1? L M-MLV transcriptase ย้อนกลับและ RNase ฟรี ddH2O ปริมาณสุดท้ายของ 25? L, ผสมเบา ๆ แล้วและบ่มที่อุณหภูมิ 37 ◦Cเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ปฏิกิริยาที่เสร็จสมบูรณ์ที่ 70 ◦Cเป็นเวลา 15 นาที ผลิตภัณฑ์ยีนถูกเก็บไว้ที่-20 ◦C การวิเคราะห์ PCR แบบ Real-time ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้โดยเชน [27] ในช่วงสั้น ๆ ตัวอย่าง cDNA ถูกนำมาใช้เป็นแม่แบบและผสมกับ 200 นาโนเมตรของแต่ละไพรเมอร์และ SYBR สีเขียว PCR จริงโทผสม (Tiangen, ปักกิ่ง, จีน) เวลาจริงการวิเคราะห์ PCR โดยใช้ ABI 7500 Real Time PCR ระบบและซอฟท์แว 7500 v2 .0.3 (Applied Biosystems สหรัฐอเมริกา) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต เงื่อนไข PCR มีดังนี้ 95 ◦Cเป็นเวลา 3 นาที; 40 รอบ 95 ◦Cเป็นเวลา 30 วินาที, 57 ◦Cสำหรับ 30 วินาทีและ 68 ◦Cเป็นเวลา 1 นาที สัญญาณการเรืองแสงได้ในระหว่างการยืดตัวที่ 68 ◦Cของทุกรอบ แต่ละคู่ของไพรเมอร์ได้รับการออกแบบโดยใช้ไพรเมอร์เอ็กซ์เพรสซอฟแวร์ 3.0 (Applied Biosystems สหรัฐอเมริกา) ถูกตรวจสอบขึ้นอยู่กับโปรแกรม BLAST ในมะเขือเทศลำดับจีโนมที่มีอยู่ใน SGN และฐานข้อมูล NCBI เพื่อให้แน่ใจว่าไพรเมอร์ขยายส่วนยีนที่ไม่ซ้ำกันและต้องการ ลำดับไพรเมอร์มีการระบุไว้ในตารางที่ 1 ความจำเพาะในการเกิดปฏิกิริยาได้รับการตรวจสอบโดยการละลายวิเคราะห์เส้นโค้ง ระดับ mRNA ญาติสำหรับแต่ละยีน Rubisco ในอาร์เอ็นเอที่แยกได้จากตัวอย่างต่าง ๆ วัดที่เกี่ยวกับมาตรฐานภายใน actins RT-qPCR ได้ดำเนินการกับสามซ้ำ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

อาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกสกัดโดยใช้พืชบริสุทธิ์สกัด RNA rnaprep รวมชุด ( tiangen , ปักกิ่ง , จีน ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต การปนเปื้อนดีเอ็นเอสามารถถูกเพิ่มเลสฟรีตรวจหา ADNase . ความสมบูรณ์ของยีนที่ตรวจพบโดย 0.8% , เจล จำนวน reversely ถ่ายทอดยีนใน cdnas . ในช่วงสั้น ๆ5  L ซึ่งผสมกับ 5  ผม dntp ( 2.5 มม. ) และ 1  L เล็ก D ( T ) 15 ถูกบ่มเป็นเวลา 5 นาทีที่ 65 ◦ C ส่งผลให้ส่วนผสมเย็นทันทีวางไว้ใน 5  ผม m-mlv 5 ×ปฏิกิริยาบัฟเฟอร์ 1  ผมโคลนไรโบนิวคลีเตัวยับยั้ง 1  ผม m-mlv reverse transcriptase และเลสฟรี ddh2o เป็นเล่มสุดท้ายของ  25 ลิตร ผสมเบาๆ แล้วบ่มที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมง◦ปฏิกิริยาที่ถูกเสร็จที่ 70 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 นาที ◦ผลิตภัณฑ์วิธีเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 20 C −◦เวลาจริงและการวิเคราะห์ตามที่อธิบายไว้โดยเชน [ 27 ] ในช่วงสั้น ๆ , วิธีกลุ่มตัวอย่างที่ใช้เป็นแม่แบบ และผสมกับ 200 nm ของแต่ละคู่สีเขียว SYBR ) และหลักที่แท้จริงผสม ( tiangen , ปักกิ่ง , จีน ) สำหรับการวิเคราะห์ PCR แบบเรียลไทม์โดยใช้ ABI 7500 เวลา PCR จริงและระบบซอฟต์แวร์ 7500 v2.0 .3 ( ประยุกต์ Biosystems , USA ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โดยเงื่อนไขดังนี้ 95 ◦ C เป็นเวลา 3 นาที ; 40 รอบ 95 ◦ C 30 , 57 ◦เป็นเวลา 30 วินาที กับ 68 ◦ C เป็นเวลา 1 นาที เรืองแสงด้วยสัญญาณได้ในระหว่างเวลาที่ 68 ◦ C ของทุกๆรอบ แต่ละคู่ของไพรเมอร์ที่ออกแบบโดยใช้ไพรเมอร์ Express 3.0 ซอฟต์แวร์ประยุกต์ Biosystems ( ,สหรัฐอเมริกา ) คือตรวจยึดระเบิดมะเขือเทศจีโนมลำดับโปรแกรมในที่มีอยู่ใน ncbi SGN และฐานข้อมูลเพื่อให้แน่ใจว่า ไพรเมอร์ที่ไม่ซ้ำกันและขยายส่วนยีนที่ต้องการ ไพรเมอร์ ) มีการระบุไว้ในตารางที่ 1 ความจำเพาะของปฏิกิริยาถูกตรวจสอบความถูกต้องโดยจุดหลอมเหลวการวิเคราะห์เส้นโค้งญาติระดับ mRNA ของยีนในแต่ละ rubisco RNA ที่แยกได้จากตัวอย่างต่างๆ วัด ไหว้พระ มาตรฐาน ภายใน actins . RT qpcr จำนวน 3 ซ้ำ