2.4.4.1 Extracion. Enzyme extractio

2.4.4.1 Extracion. Enzyme extraction and assay were carried out based on the combined procedures of Rojas-Graue, Soliva-Fortuny, and Martin-Belloso (2008), Lopez-Malo et al.(1998) and jacobo-Velazquez,Ramos-Parra, and Hermandez-Brenes (2010) with minor modifications.Frozen avocado powder (250 ug) was homogenized with 1ml. phosphate buffer (0.1 M, pH 6.5 pH containing 1 M NaCI) using a Polytron (PT2100, Kinematica,Littau, Switzerland) for 15 s. The mixture was centrifuged at 21,000 xg and 4c for 15 min. The supernatant was then filtered using a 0.45-um filter and held in an ice water bath before analysis.



2.4.4.2 Enzyme assays.Activity for both peroxidase (POD) and PPO was determined using a spectrophotometer (Ultrospec 3300 Pro, GE Healthcare, Auckland, NZ). For POD (EC 1.11.1.7), the assay was based on the oxidation reaction of guaiacol by hydrogen peroxide.The assay mixture consisted of 1.5 mL phosphate buffer (0.1 M, pH 6.5),0.2 mL guaiacol (1% w/v in water), 0.1 mL H2O2 (1.5% w/v in water) and 30 uL enzyme extract. The formation of oxidized tetraguaiacol polymer was monitored at 20c over 3 min by changes in absorbance at 485 nm.For PPO (EC 1.10.3.1), the assay was based on the oxidation reaction of catechol. The assay mixture consisted of 1 mL phosphate buffer (0.1 M,pH 6.5),500 uL catechol (0.1 M dissolved in phosphate buffer (0.1 M,pH 6.5)) and 13 uL enzyme extract. The formation of oxidesed catechol polymer was monitored at 20c over 4 min by changes in absorbance at 420 nm. In each case, substrate solution was freshly prepared before enzyme measurements and changes in absorbance were followed using kinetic software (Swift II,GE Healthcare, Auckland,NZ). Enzyme activity was calculated based on the slope of the linear portion of the curve and expressed and change in absorbance (A485nm or A420 nm) per minute per g avocado tissue (fresh weight). The enzyme activity measurements were carried out in triplicate.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4.4.1 Extracion เอนไซม์สกัดและวิเคราะห์ได้ดำเนินตามขั้นตอนการรวม Rojas Graue ตู นิ Soliva และมาร์ติน-Belloso (2008), โลเปซ Malo et al.(1998) และ jacobo Velazquez, Ramos พาร์รา และ Hermandez-Brenes (2010) มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อยผงอโวคาโดน้ำแข็ง (ยูจี 250) ถูก homogenized เป็นกลุ่มกับ 1 ml. ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (0.1 เมตร ค่า pH 6ค่า pH 5 ประกอบด้วย 1 M NaCI) ใช้ฝากระจกโค้ง (PT2100, Kinematica, Littau สวิตเซอร์แลนด์) 15 s ส่วนผสมถูก centrifuged 21000 xg และ 4c ใน 15 นาที Supernatant แล้วถูกกรองโดยใช้การกรอง 0.45 อุ่ม และในน้ำเป็นน้ำแข็งก่อนที่จะวิเคราะห์


2.4.4.2 assays เอนไซม์กิจกรรมสำหรับทั้ง peroxidase (POD) และ PPO กำหนดใช้เป็นเครื่องทดสอบกรดด่างให้ (Ultrospec 3300 Pro GE สุขอนามัย โอ๊คแลนด์ นิวซีแลนด์) สำหรับ POD (EC 1.11.1.7), การทดสอบเป็นไปตามปฏิกิริยาออกซิเดชันของ guaiacol ด้วยไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์วิเคราะห์ส่วนผสมประกอบด้วยบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 1.5 mL (0.1 M, pH 6.5), guaiacol 0.2 mL (1% w/v ในน้ำ), 0.1 mL H2O2 (1.5% w/v ในน้ำ) และเอนไซม์ uL 30 แยก การก่อตัวของพอลิเมอร์ tetraguaiacol ตกแต่งถูกตรวจสอบที่ 20c 3 นาทีตามการเปลี่ยนแปลง absorbance ที่ 485 nmสำหรับ PPO (EC 1.10.3.1), การทดสอบเป็นไปตามปฏิกิริยาออกซิเดชันของ catechol วิเคราะห์ส่วนผสมประกอบด้วยบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 1 mL (0.1 M, pH 6.5), 500 uL catechol (M 0.1 ที่ละลายในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (0.1 M, pH 6.5)) และเอนไซม์ uL 13 แยก การก่อตัวของพอลิเมอร์ catechol oxidesed ถูกตรวจสอบที่ 20c กว่า 4 นาทีตามการเปลี่ยนแปลง absorbance ที่ 420 nm ในแต่ละกรณี แก้ปัญหาพื้นผิวที่เตรียมก่อนวัดเอนไซม์สด และตามการเปลี่ยนแปลง absorbance ใช้ซอฟต์แวร์เดิม ๆ (Swift II สุขอนามัย GE โอ๊คแลนด์ นิวซีแลนด์) เอนไซม์ถูกคำนวณขึ้นอยู่กับความชันของเส้นตรงส่วนโค้ง และแสดงการเปลี่ยนแปลง absorbance (A485nm หรือ A420 nm) ต่อนาทีต่อเนื้อเยื่อ g อะโวคาโด (น้ำหนักสด) การวัดกิจกรรมของเอนไซม์ได้ดำเนินการใน triplicate.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.4.4.1 Extracion การสกัดเอนไซม์และทดสอบได้ดำเนินการตามขั้นตอนรวมของ Rojas-Graue, Soliva-Fortuny และมาร์ติน-Belloso (2008) โลเปซ-Malo et al,. (1998) และ jacobo-Velazquez, ฟิซช์โตนและ Hermandez- Brenes (2010) กับผู้เยาว์ผง modifications.Frozen อะโวคาโด (250 ไมโครกรัม) ถูกปั่นด้วย 1ml ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (0.1 M, pH 6.5 pH ที่มี M 1 NaCI) โดยใช้ Polytron (PT2100, Kinematica, Littau, สวิตเซอร์แลนด์) เวลา 15 วินาที ส่วนผสมที่ถูกหมุนเหวี่ยงที่ 21,000 xg เป็นและ 4c เป็นเวลา 15 นาที ใสถูกกรองแล้วใช้ตัวกรอง 0.45 ไมครอนและที่จัดขึ้นในห้องอาบน้ำน้ำแข็งก่อนที่จะวิเคราะห์2.4.4.2 assays.Activity เอนไซม์ทั้ง peroxidase (POD) และ PPO ถูกกำหนดโดยใช้สเปก (Ultrospec 3300 Pro, จีอีเฮล, โอ๊คแลนด์ , NZ) สำหรับ POD (EC 1.11.1.7) การวิเคราะห์บนพื้นฐานของการเกิดปฏิกิริยาออกซิเดชันของ guaiacol ด้วยไฮโดรเจน peroxide.The ส่วนผสมทดสอบประกอบด้วย 1.5 มิลลิลิตรฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (0.1 M, pH 6.5), 0.2 มิลลิลิตร guaiacol (1% w / v ใน น้ำ), 0.1 มิลลิลิตร H2O2 (1.5% w / v ในน้ำ) และ 30 สารสกัดเอนไซม์ uL การก่อตัวของพอลิเมอ tetraguaiacol ออกซิไดซ์ได้รับการตรวจสอบที่ 20c กว่า 3 นาทีจากการเปลี่ยนแปลงในการดูดกลืนแสงที่ 485 nm.For PPO (EC 1.10.3.1) การวิเคราะห์บนพื้นฐานของการเกิดปฏิกิริยาออกซิเดชันของ catechol ส่วนผสมทดสอบประกอบด้วย 1 มิลลิลิตรฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (0.1 M, pH 6.5), 500 uL catechol (0.1 M ละลายในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (0.1 M, pH 6.5)) และสารสกัดจากเอนไซม์ 13 uL การก่อตัวของพอลิเมอ catechol oxidesed ได้รับการตรวจสอบที่ 20c กว่า 4 นาทีจากการเปลี่ยนแปลงในการดูดกลืนแสงที่ 420 นาโนเมตร ในแต่ละกรณีการแก้ปัญหาพื้นผิวที่เตรียมสดใหม่ก่อนที่จะวัดการทำงานของเอนไซม์และการเปลี่ยนแปลงในการดูดกลืนแสงตามมาโดยใช้ซอฟต์แวร์การเคลื่อนไหว (สวิฟท์ที่สองของจีอีเฮลธ์แคร์, โอ๊คแลนด์นิวซีแลนด์) เอนไซม์ที่คำนวณได้ตามความชันของเส้นตรงส่วนของเส้นโค้งและแสดงและการเปลี่ยนแปลงในการดูดกลืนแสง (A485nm หรือ A420 นาโนเมตร) ต่อนาทีต่อกรัมเนื้อเยื่ออะโวคาโด (น้ำหนักสด) การวัดกิจกรรมของเอนไซม์ที่ถูกดำเนินการในเพิ่มขึ้นสามเท่า

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.4.4.1 extracion . การสกัดเอนไซม์และการทดสอบได้ดำเนินการตามขั้นตอนของการรวม soliva โรฮาส , fortuny และมาร์ติน belloso ( 2008 ) , โลเปซ Malo et al . ( 1998 ) และจาโคโบ เวลาสเควซ รามอส ปาร์รา และ hermandez brenes ( 2010 ) ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย อะโวคาโดผงแช่แข็ง ( 250 ไมโครกรัม ) เป็นโฮโมด้วย 1ml . บัฟเฟอร์ ฟอสเฟต ( 0.1 โมลาร์พีเอช 65 M มี 1 M NaCl ) โดยใช้ polytron ( pt2100 kinematica ลิททาว , , , สวิตเซอร์แลนด์ ) เป็นเวลา 15 วินาที ที่ระดับ 21 , 000 และส่วนผสมที่สามารถ 4C เป็นเวลา 15 นาที และน่านก็กรองใช้กรอง 0.45-um และจัดขึ้นในน้ำแข็ง น้ำที่อาบก่อนการวิเคราะห์ .



2.4.4.2 ตรวจเอนไซม์ กิจกรรมสำหรับทั้ง เปอร์ออกซิเดส ( ฝัก ) และ PPO ถูกกำหนดโดยใช้ Spectrophotometer ( ultrospec 3300 โปรGE Healthcare , Auckland , NZ ) สำหรับฝัก ( EC 1.11.1.7 ) ( ขึ้นอยู่กับค่าปฏิกิริยาออกซิเดชันของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ จำนวน 1.5 มิลลิลิตร ผสม assay ( 0.1 M phosphate buffer pH 6.5 ) , ค่า 0.2 มิลลิลิตร ( 1 % W / V ในน้ำ ) , H2O2 0.1 ml ( 1.5 % W / V ในน้ำ ) และ 30 UL เอนไซม์สกัดเข้มข้นการเกิดออกซิไดซ์ tetraguaiacol พอลิเมอร์ถูกตรวจสอบที่ 20C กว่า 3 นาที โดยการเปลี่ยนแปลงในการดูดกลืนแสงที่ 465 นาโนเมตร สำหรับ PPO ( EC 1.10.3.1 ) ( ขึ้นอยู่กับปฏิกิริยาออกซิเดชันของแคติคอล . วิเคราะห์ส่วนผสมประกอบด้วย 1 มิลลิลิตร ( 0.1 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 6.5 ) , 500 UL แคติคอล ( 0.1 M ละลายใน 0.1 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ pH 6.5 ) และ 13 UL เอนไซม์สกัดเข้มข้นการก่อตัวของ oxidesed แคติคอลพอลิเมอร์ถูกตรวจสอบที่ 20C กว่า 4 นาที โดยการเปลี่ยนแปลงในการดูดกลืนแสงที่ 420 นาโนเมตร ในแต่ละกรณีใช้สารละลายเอนไซม์สด เตรียมไว้ก่อน และการเปลี่ยนแปลงในการวัดการดูดกลืนแสงได้ตามการใช้ซอฟต์แวร์ ( อย่างรวดเร็ว ) 2 , GE Healthcare , Auckland , NZ )กิจกรรมของเอนไซม์ถูกคำนวณบนพื้นฐานของความชันของเส้นโค้งและส่วนของการแสดงออกและการเปลี่ยนแปลงในการดูดกลืนแสง ( a485nm หรือ a420 nm ) ต่อนาที ต่อ กรัม อโวคาโด เนื้อเยื่อ ( น้ำหนักสด ) เอนไซม์การวัด
ทดลองทั้งสามใบ