Considerations when using a referen

Considerations when using a reference gene Reference gene validation exercises are also subject to the problem of normalisation. The strategy we previously presented5 uses total RNA to normalise the sample prior to reference gene variability assessment. The different reference genes are then measured by real-time RT-PCR and variation in the cycle threshold (Ct) or crossing point (Cp) assessed. As RNA normalisation can incorporate error and does not take into account the RT step, the measured reference gene variability represents the cumulative error of the entire process, that is, the innate variation of the reference gene under investigation and the experimental error associated with the technique. Once this variation is defined the chosen reference gene can provide the resolution of the assay in question. Choosing the accepted level of variability will depend on the degree of resolution required. Even if the chosen gene is variable it may not matter as long as intergroup difference being measured is greater than the reference gene variation, that is, a reference gene RNA that has an error of 1 log may not be ideal, but is sufficient to measure a 2 log change in a gene of interest. There are a number of programs based on the excel platform that allow the assessment of multiple reference genes. Gnorm allows the most appropriate reference gene to be chosen by using the geometric mean of the expression of the candidate cDNA.26 This software is freely available (http://www.genomebiology.com/ 2002/3/7/research/0034/) and the underlying principles are published by Vandesompele et al.26 BestKeeper also selects the least variable gene using the geometric mean but uses raw data27 instead of data converted to copy number, it is also available at http://www.genequantification.de/BestKeeper-1.zip. A third program Norm-Finder,28 freely available on request, not only measures the variation but also ranks the potential reference genes by how much they differ between study groups, that is, the extent by which they are effected by the experimental conditions. Defining this is essential as it can generate false results as discussed above. Vandesompele et al also advocate the use of multiple reference genes rather than relying on a single RNA transcript. This is a robust method for providing accurate normalisation and is consequently favourable if fine measurements are to be made. However, it is not always possible to measure multiple reference genes due to limited sample availability and cost. Furthermore, even if multiple genes are chosen the resolution of the particular assay remains dependent on the variability of the chosen reference genes.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ข้อควรพิจารณาเมื่อใช้การอ้างอิงยีนอ้างอิงยีนการตรวจสอบการออกกำลังกายก็อาจ มีปัญหาของ normalisation กลยุทธ์เราเคยใช้ presented5 รวมอาร์เอ็นเอการ normalise ตัวอย่างก่อนที่จะประเมินความแปรผันของยีนอ้างอิง ยีนต่าง ๆ อ้างอิงแล้ววัดเวลาจริง RT-PCR และความผันแปรในขีดจำกัดรอบ (Ct) หรือข้ามจุด (Cp) ประเมิน เป็นอาร์เอ็นเอ normalisation สามารถรวมข้อผิดพลาด และไม่คำนึงถึงขั้นตอนการ RT ความแปรผันยีนวัดอ้างอิงแสดงถึงข้อผิดพลาดสะสมของกระบวนการทั้งหมด คือ ความผันแปรโดยธรรมชาติของยีนอ้างอิงภายใต้การตรวจสอบและข้อผิดพลาดการทดลองที่เกี่ยวข้องกับเทคนิคการ เมื่อกำหนดความผันแปรนี้ ยีนอ้างอิงท่านสามารถให้ความละเอียดของการวิเคราะห์คำถาม เลือกระดับการยอมรับความแปรผันจะขึ้นอยู่กับระดับของความละเอียดที่ต้องการ ถ้ายีนท่าน อาจว่าตราบใดที่แตกต่าง intergroup เป็นวัดที่มีมากกว่าการเปลี่ยนแปลงยีนอ้างอิงตัวแปร คือ ยีนอ้างอิงอาร์เอ็นเอที่มีข้อผิดพลาดของล็อก 1 อาจไม่เหมาะ ได้เพียงพอที่จะวัดการเปลี่ยนล็อก 2 ยีนที่น่าสนใจ มีโปรแกรมที่ใช้บนแพลตฟอร์ม excel ที่อนุญาตให้มีการประเมินอ้างอิงหลายยีน Gnorm ช่วยให้ยีนอ้างอิงที่เหมาะสมที่จะเลือก โดยใช้ค่าเฉลี่ยเรขาคณิตของนิพจน์ของ cDNA.26 ผู้นี้ได้อย่างอิสระ (2002/3/7/วิจัย/0034 ใน http://www.genomebiology.com/ /) และมีการเผยแพร่หลักการพื้นฐาน โดย Vandesompele et al.26 BestKeeper ยังเลือกยีนผันแปรน้อยที่สุดที่ใช้เรขาคณิต แต่ใช้ data27 ดิบแทนข้อมูลที่ถูกแปลงเป็นการคัดลอกหมายเลข ก็ยังมีอยู่ที่ http://www.genequantification.de/BestKeeper-1.zip โปรแกรมที่สามปกติค้นหา 28 ได้อย่างอิสระสามารถขอ ไม่เพียงแต่วัดการเปลี่ยนแปลง แต่ยัง อันดับยีนอ้างอิงเป็นไปตามเงื่อนไขเท่านั้นแตกต่างกันระหว่างกลุ่มการศึกษา คือ ขอบเขตซึ่งจะมีผล โดยการทดลอง การกำหนดนี้เป็นสิ่งสำคัญจะสามารถสร้างผลลัพธ์เท็จดังที่กล่าวไว้ข้างต้น Vandesompele et al ยังสนับสนุนการใช้อ้างอิงหลายยีนมากกว่าการอาศัยเสียงบรรยายเดียวอาร์เอ็นเอ นี้เป็นวิธีที่มีประสิทธิภาพให้ normalisation ถูกต้อง และไม่ดีดังนั้นถ้าวัดที่ดีจะทำ อย่างไรก็ตาม มันไม่ได้เสมอไปวัดหลายยีนอ้างอิงมีอยู่อย่างจำกัดและต้นทุน นอกจากนี้ แม้ว่ายีนหลายจะเลือกความละเอียดของการทดสอบเฉพาะ ยังคงขึ้นอยู่กับความแปรผันของยีนที่ท่านอ้างอิง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ข้อควรพิจารณาเมื่อใช้อ้างอิงอ้างอิงการตรวจสอบยีนยีนแบบฝึกหัดยังเป็นเรื่องปัญหาของการฟื้นฟู . กลยุทธ์ที่เราเคย presented5 ใช้อาร์เอ็นเอรวมปกติตัวอย่างก่อนที่จะประเมินความผันแปรของยีนอ้างอิง ยีนอ้างอิงแตกต่างกันจะวัดโดยวิธี RT-PCR ) แบบเรียลไทม์ และการเปลี่ยนแปลงในวัฏจักรธรณี ( CT ) หรือข้ามจุด ( CP ) ประเมินเป็น RNA การฟื้นฟูสามารถรวมข้อผิดพลาดและไม่ได้คำนึงถึง RT ขั้นตอนการวัดความผันแปรของยีนอ้างอิงความผิดพลาดสะสมของกระบวนการทั้งหมด นั่นคือ การเปลี่ยนแปลงของยีนแหล่งอ้างอิงภายใต้การตรวจสอบและทดลองข้อผิดพลาดที่เกี่ยวข้องกับเทคนิคเมื่อการเปลี่ยนแปลงนี้กำหนดเลือกอ้างอิงยีนสามารถให้ความละเอียดของการทดสอบในคำถาม การเลือกระดับของการยอมรับจะขึ้นอยู่กับระดับของความละเอียดที่ต้องการ ถ้ายีนเลือกตัวแปรมันอาจไม่สำคัญตราบใดที่หญิงต่างถูกวัดมากกว่าการอ้างอิงยีนเปลี่ยนแปลง นั่นคือการอ้างอิงของ RNA ที่มีข้อผิดพลาดของ 1 อาจจะไม่เหมาะ แต่ก็เพียงพอที่จะวัด 2 บันทึกการเปลี่ยนแปลงในยีนที่น่าสนใจ มีจำนวนของโปรแกรมขึ้นอยู่กับแพลตฟอร์ม Excel ที่ให้ประเมินยีนอ้างอิงหลาย gnorm ช่วยให้ยีนอ้างอิงที่เหมาะสมที่สุดจะถูกเลือกโดยใช้ค่าเฉลี่ยเรขาคณิตของการแสดงออกของยีนของผู้สมัคร .26 ซอฟต์แวร์นี้สามารถใช้ได้อย่างอิสระ ( http://www.genomebiology.com/ 2002 / 3 / 7 / วิจัย / หยุด / ) และหลักการพื้นฐานที่มีการเผยแพร่โดย vandesompele et al.26 bestkeeper ยังเลือกใช้ค่าเฉลี่ยเรขาคณิตของตัวแปรน้อยที่สุด แต่ใช้วัตถุดิบ data27 แทนข้อมูลแปลงเป็นจำนวนสำเนา มันยังสามารถใช้งานใน http://www.genequantification.de/bestkeeper-1.zip .โปรแกรมที่สามบรรทัดฐาน Finder , 28 ได้อย่างอิสระตามความต้องการ ไม่เพียง แต่มาตรการการเปลี่ยนแปลงแต่ยังจัดอันดับยีนการอ้างอิงโดยวิธีมากพวกเขาแตกต่างระหว่างกลุ่มศึกษาที่เป็นขอบเขตที่พวกเขาจะได้รับผลกระทบจากสภาวะการทดลอง กำหนดนี้เป็นสิ่งจำเป็นเพราะสามารถสร้างผลลัพธ์เป็นเท็จตามที่กล่าวข้างต้นvandesompele et al ยังสนับสนุนการใช้ยีนอ้างอิงหลายแทนที่จะอาศัยหลักฐานยีนเดี่ยว วิธีนี้เป็นวิธีที่แข็งแกร่งสำหรับการให้การฟื้นฟูที่ถูกต้องและเป็นผลดี ถ้าวัดได้ก็จะทำ แต่มันก็เป็นไปได้ที่จะวัดยีนอ้างอิงหลายเนื่องจากห้องพักจำนวนจำกัด และต้นทุน นอกจากนี้แม้ว่าหลายยีนจะเลือกความละเอียดของการทดสอบโดยเฉพาะยังคงขึ้นอยู่กับการเลือกอ้างอิง
ยีน