Isolation of fibrillar collagensThe

Isolation of fibrillar collagens
The frozen aortic media was finely diced at 0°C and suspended in 0.9% saline (25 ml) and agitated with end-over-end mixing for 4-6 h at 4°C. The diced aortic media was extracted for 24 h at 4°C firstly in acetone, then in chloroform-methanol (2:l v/v) and finally in chloroform-methanol (3:l v/v). The tissue was blotted dry after each extrac- tion. The tissue was then homogenized using a Polytron (5 x 30 s) in 0.4 M Tris/Cl- containing 0.2 M EDTA (20 ml/g tissue) and left to mix end over end for a further 24 h at 4°C. This was follow- ed by four more successive 24-h extractions at 4°C in (i) 5 M guanidinium chloride containing 0.2 M EDTA, 0.4 M Tris/Cl-, pH 7.4, (ii) 5 M guani- dinium thiocyanate containing 0.2 M EDTA, 1 mM dithiothreitol, 0.4 M Tris/Cl, pH 7.4, (iii) as in (ii) but increasing the concentration of dithio- threitol to 5 mM and (iv) phosphate buffered saline. After each extraction the insoluble material was collected by centrifugation at 6000 x g for 20 min and the supernatants discarded. Finally the samples were washed well with water and dried in vacua over P205 at 4°C.
The dried material was resuspended in a solu- tion of pepsin (Sigma P 7012) in 0.4 M acetic acid at 1mg/ml. The pepsin digestion was continued at 18°C for 72 h with end-over-end mixing. All fur- ther steps were performed at 4°C. The pepsin digest was centrifuged for 1 h at 16 000 x g and the supernatant dialysed against 0.02 M Na2HP04 overnight. Further purification of collagen was as previously described [ 161.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

แยกของ fibrillar collagensแช่แข็งเอออร์ตาส่วนสื่อละเอียดเตรียมการที่ 0° C และแขวนลอยในน้ำเกลือ 0.9% (25 ml) และไม่สบายใจอีก ด้วยกว่าปลายผสมสำหรับ 4-6 ชั่วโมงที่ 4 องศาเซลเซียส สื่อเอออร์ตาส่วนวุ้นถูกแยกที่ 4° C 24 ชั่วโมงแรก ในอะซิโตน จาก นั้น ในคลอโรฟอร์มเมทานอล (2:l v/v) และสุดท้ายในคลอโรฟอร์มเมทานอล (3:l v/v) เนื้อเยื่อ blotted แห้งหลังจากแต่ละในทางการค้า เนื้อเยื่อถูกแล้ว homogenized ใช้ Polytron เป็น (5 x 30 s) ในทริ 0.4 M/Cl - ประกอบด้วย 0.2 M EDTA (เนื้อเยื่อ 20 ml/g) และซ้ายผสมปลายไปสิ้นสุดในอีก 24 ชั่วโมงที่ 4 องศาเซลเซียส นี้เป็น ed ตาม โดยสี่เพิ่มเติมต่อเนื่อง 24 ชม.สกัดที่ 4° C ใน (i) 5 เมตร guanidinium คลอไรด์ที่ประกอบด้วย EDTA ม 0.2, 0.4 M ทริ สเรทติ้ง/Cl-, pH 7.4, thiocyanate guani dinium (ii) 5 เมตรที่ประกอบด้วย 0.2 M EDTA, dithiothreitol 1 มม. 0.4 M ทริ สเรทติ้ง/Cl, pH 7.4, (iii) ใน (ii) แต่เพิ่มความเข้มข้นของ dithio threitol 5 มม.และ (iv) ฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือ หลังจากสกัดแต่ละ วัสดุไม่ละลายน้ำถูกรวบรวม โดยหมุนเหวี่ยงที่ 6000 x g 20 นาทีและ supernatants ที่ถูกละทิ้ง ในที่สุด ตัวอย่างล้างด้วยน้ำ และแห้งใน vacua กว่า P205 ที่ 4 องศาเซลเซียสวัสดุแห้งถูก resuspended ในการไหลทางการค้าของเพพซิน (ซิก P 7012) ในกรดอะซิติก 0.4 M 1mg/ml การย่อยอาหารธาตุเพพซินถูกต่อ 18° c สำหรับ 72 ชั่วโมงด้วยการผสมมากกว่าปลาย ดำเนินการทุกขั้นตอนเธอขนที่ 4 องศาเซลเซียส แยกย่อยธาตุเพพซินคือผลิตภัณฑ์สำหรับ h 1 ที่ 16 000 x g และ supernatant ที่ dialysed กับ 0.02 M Na2HP04 ค้างคืน ทำให้บริสุทธิ์ต่อไปของคอลลาเจนเป็นก่อนหน้านี้อธิบาย [161

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การแยกเส้นใยคอลลาเจน
สื่อหลอดเลือดแช่แข็งหั่นสี่เหลี่ยมลูกเต๋าประณีตที่ 0 องศาเซลเซียสและระงับใน 0.9% น้ำเกลือ (25 มล.) และตื่นเต้นกับการสิ้นสุด-over-ปลายผสมสำหรับเด็ก 4-6 ชั่วโมงที่ 4 องศาเซลเซียส หั่นสี่เหลี่ยมลูกเต๋าสื่อหลอดเลือดถูกสกัดเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสในตอนแรกอะซิโตนแล้วในคลอโรฟอร์มเมทานอล (2: LV / v) และในที่สุดก็ในคลอโรฟอร์มเมทานอล (3: LV / v) เนื้อเยื่อถูกลบเลือนแห้งหลังจากที่แต่ละการ extrac- เนื้อเยื่อก็หดหายใช้ Polytron (5 x 30 s) ใน 0.4 M Tris / Cl- มี 0.2 M EDTA (เนื้อเยื่อ 20 มล. / g) และจากซ้ายไปผสมสิ้นสิ้นไปอีก 24 ชั่วโมงที่ 4 ° C นี่คือเอ็ดต่อไปนี้โดยอีกสี่ต่อเนื่องสกัดตลอด 24 ชั่วโมงที่ 4 องศาเซลเซียสใน (i) 5 M Guanidinium คลอไรด์ที่มี 0.2 M EDTA, 0.4 M Tris / Cl- พีเอช 7.4 (ii) 5 M guani- dinium thiocyanate มี 0.2 M EDTA 1 มิ dithiothreitol, 0.4 M Tris / Cl, พีเอช 7.4 (iii) ในขณะที่ (ii) แต่การเพิ่มความเข้มข้นของ threitol dithio- ถึง 5 มิลลิเมตร (iv) ฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือ หลังจากที่แต่ละสกัดวัสดุที่ไม่ละลายน้ำที่ถูกเก็บรวบรวมโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 6000 XG 20 นาทีและ supernatants ทิ้ง ในที่สุดตัวอย่างถูกล้างด้วยน้ำและแห้งใน vacua กว่า P205 ที่ 4 ° C.
วัสดุที่แห้งถูก resuspended ในการโซลูชันของน้ำย่อย (ซิกม่า P 7012) ใน 0.4 M กรดอะซิติกที่ 1 มก / มล. การย่อยน้ำย่อยได้อย่างต่อเนื่อง ณ วันที่ 18 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 72 ชั่วโมงกับการสิ้นสุด-over-ปลายผสม ขั้นตอน Ther fur- ทั้งหมดถูกดำเนินการใน 4 องศาเซลเซียส น้ำย่อย Digest ถูกปั่นเป็นเวลา 1 ชั่วโมง 16 000 XG และใสไตกับ 0.02 M Na2HP04 ในชั่วข้ามคืน การทำให้บริสุทธิ์ต่อไปของคอลลาเจนก็อธิบายว่าก่อนหน้านี้ [161

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การแยกของคอลลาเจนภายใต้แช่แข็งของสื่อที่ 0 ° C และ diced ประณีตแขวนลอยใน 0.9% น้ำเกลือ ( 25 มล. ) และตื่นเต้นกับปลายเหนือสุดผสมสำหรับ 4-6 H ที่ 4 องศา หั่นสี่เหลี่ยมลูกเต๋าของสื่อถูกสกัดเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่ 4 ° C ประการแรกในอะซิโตน เมทานอลในคลอโรฟอร์ม ( 2 : l / v ) และสุดท้ายในเมทานอลคลอโรฟอร์ม ( 1 : 1 v / v ) เนื้อเยื่อถูกเปื้อนแห้งหลังจากแต่ละสกัด - tion . เนื้อเยื่อที่เป็นโฮโมใช้ polytron ( 5 x 30 s ) 0.4 M ทริส / CL - ที่มี 0.2 M EDTA ( เนื้อเยื่อ / G 20 ml ) แล้วผสมจบเหนือสุดสำหรับอีก 24 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 4 องศา นี้ตาม - ed โดยสี่ทีม 24-h ต่อเนื่องอีก 4 ° C ใน ( ฉัน ) 5 M guanidinium คลอไรด์ที่มี 0.2 M EDTA , 0.4 M ทริส / CL - pH 7.4 ( 2 ) 5 M guani - dinium ไทโอไซยาเนตที่มี 0.2 M EDTA , บัตรแข็ง 1 มิลลิเมตร หรือ 0.4 M / Cl pH 7.4 ( III ) ใน ( II ) แต่การเพิ่มความเข้มข้นของ dithio - threitol 5 มม. และ ( iv ) ฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือ หลังจากที่แต่ละแยกวัสดุที่ไม่ละลายน้ำ เพื่อปั่น 6000 x G สำหรับ 20 นาทีและ supernatants ทิ้ง ในที่สุดตัวอย่างที่ล้างด้วยน้ำและแห้งใน p205 สภาวะสุญญากาศนี้เป็นไปในทางเดียวกันกว่า 4 องศาอบแห้งวัสดุ resuspended ในซูลู - tion ของเอนไซม์เปปซิน ( Sigma P 7012 ) 0.4 M กรดอะซิติกที่ 1mg / ml เอนไซม์เปปซิน การย่อยได้ อย่างต่อเนื่องที่ 18 ° C เป็นเวลา 72 ชั่วโมงปลายเหนือสุดกวน ทุกขั้นตอนมีการขน - 4 ° C ย่อยเปปซินคือระดับ 1 H ที่ 16 000 x G และนำ dialysed กับ 0.02 M na2hp04 ค้างคืน คอลลาเจนบริสุทธิ์ต่อไปได้ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ 161 .