2.4. Slow-type of myosin heavy chai

2.4. Slow-type of myosin heavy chain
The percentage of slow myosin heavy chain (MyHCI)in the muscle was determined with a specific MyHC-I monoclonal antibody by the ELISA technique
Muscle sample extracts were obtained by homogenizing 200 mg of frozen muscle in 10 ml of pH
8.0 buffer solution: 50 mM Tris (hydroxymethyl)-aminomethane, 0.5 M NaCl, 20 mM disodium pyrophosphate, 1mM EDTA and 1mM DTT (Dithiothreitol), left on ice for 10 min and centrifuged for 10 min at 2500g (4 C).
The supernatant was then mixed with glycerol to a final concentration of 50% (v/v) and stored
at20 C until analysis.
Sample protein concentration was determined (Bradford, 1976), using bovine serum albumin as a standard.
For the assay, samples were diluted to a concentration of 2.4 mg of protein / ml and
the microtiter-plate wells were filled with 50 ml each (triplicates).
A specific MyHC-I monoclonal antibody prepared from a human ventricle specimen was used (clone
F36.5B9, 2C8, isotype Mouse IgG2a, Biocytex Biotechnology) to recognise the MyHC I myosin isoform in the muscle samples.
A second antibody, (anti-mouse IgG Fab fragment from sheep, Boehringer Mannheim Biochemica) alkaline phosphatase conjugated was used.
This provided the enzymatic reaction that enabled the detection in the variation of absorbance at 405 nm, by using 4-nitrophenylphosphate (Sigma) as substrate.
The percentage of the MyHC-I in each sample was calculated by means of a standard curve prepared from Masseter (100% MyHC-I) and BSA (0% MyHC-I), which was run in each microtiter-plate

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.4 . พิมพ์ช้าของ myosin โซ่หนัก
เปอร์เซ็นต์ของช้า myosin หนักโซ่ ( myhci ) ในกล้ามเนื้อ ตั้งใจกับเฉพาะ myhc-i โมโนโคลนอล แอนติบอดี โดยเทคนิค ELISA
กล้ามเนื้อตัวอย่างสารสกัดที่ได้จากการผสมยาง 200 มิลลิกรัมของแช่แข็ง 10 มิลลิลิตรกล้ามเนื้อในสารละลายบัฟเฟอร์ pH
8 : 50 มม. โดยการใช้เสียงระดับต่ำ ( ซี ) , 0.5 โมลาร์โซเดียมไพโร 20 มม. ,และ 1mm EDTA 1mm DTT ( บัตรแข็ง ) ซ้ายบนน้ำแข็ง 10 นาทีและไฟฟ้าสำหรับ 10 นาทีที่ 2500g ( 4  C )
แล้วนำผสมกับกลีเซอรอลเพื่อความเข้มข้นสุดท้าย 50 % ( v / v ) และเก็บไว้
ที่  20  C จนถึงการวิเคราะห์
ตัวอย่างกำหนดระดับความเข้มข้นโปรตีน ( แบรดฟอร์ด , 1976 ) , การใช้อัลบูมินเป็นมาตรฐาน
สำหรับการทดสอบตัวอย่างเพื่อลดความเข้มข้นของ 24 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรและโปรตีน
แผ่นไมโครบ่อที่เต็มไปด้วย 50 ml ( ล้อม ) .
เฉพาะ myhc-i โมโนโคลนอลแอนติบอดีที่เตรียมจากตัวอย่างห้องล่างของหัวใจมนุษย์ที่ใช้ ( โคลน
f36.5b9 2c8 igg2a , เมาส์ , เทคโนโลยีชีวภาพและ biocytex ) ตัวผม myhc ไมโอซินในกล้ามเนื้อไอโซฟอร์มตัวอย่าง
a แอนติบอดี IgG anti mouse 2 ( Fab fragment จากแกะBoehringer Mannheim biochemica ) อัลคาไลน์ ฟอสฟาเตสและใช้ .
นี้ให้เอนไซม์ ปฏิกิริยาที่ใช้ตรวจจับในความผันแปรของการดูดกลืนแสงที่ 405 นาโนเมตร โดยใช้ 4-nitrophenylphosphate ( Sigma ) เป็นสับสเตรท
เปอร์เซ็นต์ของ myhc-i ในแต่ละตัวอย่างถูกคำนวณโดยวิธีการของมาตรฐานเส้นโค้งที่เตรียมจากแมสซีเตอร์ ( 100% myhc-i ) และกลุ่ม ( 0% myhc-i )ซึ่งถูกเรียกใช้ในแต่ละไมโครเพลท