- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
Hercules, CA, USA) using the follow
Hercules, CA, USA) using the following conditions: 95 °C for 5min, 50 cycles
at 95 °C for 30 s and 55 °C for1min, with collection of fluorescence
signal at the end of each cycle. Data were collected and processed using
the iCycler iQ™ Real-time Detection System Software version 3.1. Each
unknown and blind samplewas amplified in triplicate and each standard
in duplicate assays. Reference mixtures for calibration curve, blind and
unknown samples were further amplified in independent assays (n =
7, n=4and n = 3, respectively).
To develop a robust quantitative method that can be applied to processedmeat
products, the construction of a normalised calibration curve
was proposed using the real-time PCR cycle threshold (Ct) values from
the amplification of the binary reference mixtures targeting soybean
(lectin gene) and the endogenous control (eukaryotic gene). For that
system, the application of ΔCt method to construct a calibration model
was used by calculating:
ΔCt ¼ Ctsoybean–Cteuk
where Ctsoybean and Cteuk are the cycle thresholds for soybean and
eukaryotic systems, respectively. The calibration curvewas then obtained
by plotting the calculated ΔCt vs. the logarithmof soybean percentage of
five concentration levels.
3. Results and discussion
The several cases of meat adulteration broadcasted by the media in
the last years have intensified consumers' concerns regarding the composition
of the foods they are eating. Likewise, the need to verify the
compliance of labelling with legislation and the detection of economical
frauds also provided a driving force towards the development of specific
and sensitive methods that allow the identification of food ingredients.
Nevertheless, to fully address this need, analyticalmethodologies should
also allow performing accurate quantitative measurements beyond the
specific detection of an ingredient. In particular, quantification of target
ingredients is of major importance when: (i) a certain level of adventitious
contamination is allowed by legislation, such as the case of
authorised geneticallymodified organisms in European Union, whose labelling
in foods is not mandatory when in amounts b0.9% (Commission
Regulation (EC) No. 1829, 1829/2003); (ii) amaximum level of an added
ingredient is established in the legislation for particular products; and
(iii) there is a need to verify the veracity of labels regarding the declared
quantities of used ingredients.
In the presentwork,we propose the development of a real-time PCR
assay for accurate soybean quantification based on the use of primers
and probes targeting specific fragments of the lectin gene of soybean
(Mafra et al., 2008b) and the eukaryotic 18S rRNA gene, as a reference
control for normalisation (López-Andreo et al., 2005). To guarantee
reliable and accurate quantification by real-time PCR, the use of a
reference endogenous gene that takes into account possible amplification
differences due to different DNA recovery and quality/degradation
among extracts is of major importance (Fajardo et al., 2008a, 2008b;
López-Andreo et al., 2005; Soares et al., 2013). This control is of high
importance in the analysis of processed food matrices that produce
low integrity and often low purity DNA extracts, allowing to normalise
the differences that might affect PCR amplification and compromise reliable
quantification (Sawyer, Wood, Shanahan, Gout, & McDowell,
2003; Soares et al., 2013). Itmust be referred that most reported studies
so far, independently of the amplified target, are applied for detection
purposes without achieving true quantification.
3.1. Real-time PCR calibration curve and linearity
The normalised calibration curve obtained by plotting the calculated
ΔCt vs. the logarithmof soybean percentage of five concentration levels
is presented in Fig. 1. Therefore, the estimation of dried soybean was
determined by the equation:
Soybean% ¼ 10
11:732−ΔCt
3:7752 :
This approach allows the estimation of added soybean in the range
of 0.0125% to 6.25% of dried soybean protein, which can be converted
to hydrated textured soybean in meat in the range of 0.1% to 50%. Considering
that the limit of detection (LOD) is the lowest concentration
level with positive identification of the analyte at least in 95% of the
times, the value of 0.0125% of dried soybean protein was considered
the relative LOD of the method since all replicates (14) amplified positively.
The relative limit of quantification (LOQ) achieved was equal to
the LOD since it was within the linear range of the calibration curve.
The equation in Fig. 1 covers a linear dynamic range of a least of 3 orders
of magnitude, as suggested by the MIQE (Minimum Information for
Publication of Quantitative real-time PCR Experiments) guidelines of
Bustin et al. (2009), with a high correlation coefficient (R2 = 0.9986).
The calculation of PCR efficiency is ofmajor relevance to assess the performance
of real-time quantitative PCR assays, being calculated from
the slope of the calibration curve using the following expression:
at 95 °C for 30 s and 55 °C for1min, with collection of fluorescence
signal at the end of each cycle. Data were collected and processed using
the iCycler iQ™ Real-time Detection System Software version 3.1. Each
unknown and blind samplewas amplified in triplicate and each standard
in duplicate assays. Reference mixtures for calibration curve, blind and
unknown samples were further amplified in independent assays (n =
7, n=4and n = 3, respectively).
To develop a robust quantitative method that can be applied to processedmeat
products, the construction of a normalised calibration curve
was proposed using the real-time PCR cycle threshold (Ct) values from
the amplification of the binary reference mixtures targeting soybean
(lectin gene) and the endogenous control (eukaryotic gene). For that
system, the application of ΔCt method to construct a calibration model
was used by calculating:
ΔCt ¼ Ctsoybean–Cteuk
where Ctsoybean and Cteuk are the cycle thresholds for soybean and
eukaryotic systems, respectively. The calibration curvewas then obtained
by plotting the calculated ΔCt vs. the logarithmof soybean percentage of
five concentration levels.
3. Results and discussion
The several cases of meat adulteration broadcasted by the media in
the last years have intensified consumers' concerns regarding the composition
of the foods they are eating. Likewise, the need to verify the
compliance of labelling with legislation and the detection of economical
frauds also provided a driving force towards the development of specific
and sensitive methods that allow the identification of food ingredients.
Nevertheless, to fully address this need, analyticalmethodologies should
also allow performing accurate quantitative measurements beyond the
specific detection of an ingredient. In particular, quantification of target
ingredients is of major importance when: (i) a certain level of adventitious
contamination is allowed by legislation, such as the case of
authorised geneticallymodified organisms in European Union, whose labelling
in foods is not mandatory when in amounts b0.9% (Commission
Regulation (EC) No. 1829, 1829/2003); (ii) amaximum level of an added
ingredient is established in the legislation for particular products; and
(iii) there is a need to verify the veracity of labels regarding the declared
quantities of used ingredients.
In the presentwork,we propose the development of a real-time PCR
assay for accurate soybean quantification based on the use of primers
and probes targeting specific fragments of the lectin gene of soybean
(Mafra et al., 2008b) and the eukaryotic 18S rRNA gene, as a reference
control for normalisation (López-Andreo et al., 2005). To guarantee
reliable and accurate quantification by real-time PCR, the use of a
reference endogenous gene that takes into account possible amplification
differences due to different DNA recovery and quality/degradation
among extracts is of major importance (Fajardo et al., 2008a, 2008b;
López-Andreo et al., 2005; Soares et al., 2013). This control is of high
importance in the analysis of processed food matrices that produce
low integrity and often low purity DNA extracts, allowing to normalise
the differences that might affect PCR amplification and compromise reliable
quantification (Sawyer, Wood, Shanahan, Gout, & McDowell,
2003; Soares et al., 2013). Itmust be referred that most reported studies
so far, independently of the amplified target, are applied for detection
purposes without achieving true quantification.
3.1. Real-time PCR calibration curve and linearity
The normalised calibration curve obtained by plotting the calculated
ΔCt vs. the logarithmof soybean percentage of five concentration levels
is presented in Fig. 1. Therefore, the estimation of dried soybean was
determined by the equation:
Soybean% ¼ 10
11:732−ΔCt
3:7752 :
This approach allows the estimation of added soybean in the range
of 0.0125% to 6.25% of dried soybean protein, which can be converted
to hydrated textured soybean in meat in the range of 0.1% to 50%. Considering
that the limit of detection (LOD) is the lowest concentration
level with positive identification of the analyte at least in 95% of the
times, the value of 0.0125% of dried soybean protein was considered
the relative LOD of the method since all replicates (14) amplified positively.
The relative limit of quantification (LOQ) achieved was equal to
the LOD since it was within the linear range of the calibration curve.
The equation in Fig. 1 covers a linear dynamic range of a least of 3 orders
of magnitude, as suggested by the MIQE (Minimum Information for
Publication of Quantitative real-time PCR Experiments) guidelines of
Bustin et al. (2009), with a high correlation coefficient (R2 = 0.9986).
The calculation of PCR efficiency is ofmajor relevance to assess the performance
of real-time quantitative PCR assays, being calculated from
the slope of the calibration curve using the following expression:
0/5000
Hercules, CA, USA) using the following conditions: 95 °C for 5min, 50 cyclesat 95 °C for 30 s and 55 °C for1min, with collection of fluorescencesignal at the end of each cycle. Data were collected and processed usingthe iCycler iQ™ Real-time Detection System Software version 3.1. Eachunknown and blind samplewas amplified in triplicate and each standardin duplicate assays. Reference mixtures for calibration curve, blind andunknown samples were further amplified in independent assays (n =7, n=4and n = 3, respectively).To develop a robust quantitative method that can be applied to processedmeatproducts, the construction of a normalised calibration curvewas proposed using the real-time PCR cycle threshold (Ct) values fromthe amplification of the binary reference mixtures targeting soybean(lectin gene) and the endogenous control (eukaryotic gene). For thatsystem, the application of ΔCt method to construct a calibration modelwas used by calculating:ΔCt ¼ Ctsoybean–Cteukwhere Ctsoybean and Cteuk are the cycle thresholds for soybean andeukaryotic systems, respectively. The calibration curvewas then obtainedby plotting the calculated ΔCt vs. the logarithmof soybean percentage offive concentration levels.3. Results and discussionThe several cases of meat adulteration broadcasted by the media inthe last years have intensified consumers' concerns regarding the compositionof the foods they are eating. Likewise, the need to verify thecompliance of labelling with legislation and the detection of economical
frauds also provided a driving force towards the development of specific
and sensitive methods that allow the identification of food ingredients.
Nevertheless, to fully address this need, analyticalmethodologies should
also allow performing accurate quantitative measurements beyond the
specific detection of an ingredient. In particular, quantification of target
ingredients is of major importance when: (i) a certain level of adventitious
contamination is allowed by legislation, such as the case of
authorised geneticallymodified organisms in European Union, whose labelling
in foods is not mandatory when in amounts b0.9% (Commission
Regulation (EC) No. 1829, 1829/2003); (ii) amaximum level of an added
ingredient is established in the legislation for particular products; and
(iii) there is a need to verify the veracity of labels regarding the declared
quantities of used ingredients.
In the presentwork,we propose the development of a real-time PCR
assay for accurate soybean quantification based on the use of primers
and probes targeting specific fragments of the lectin gene of soybean
(Mafra et al., 2008b) and the eukaryotic 18S rRNA gene, as a reference
control for normalisation (López-Andreo et al., 2005). To guarantee
reliable and accurate quantification by real-time PCR, the use of a
reference endogenous gene that takes into account possible amplification
differences due to different DNA recovery and quality/degradation
among extracts is of major importance (Fajardo et al., 2008a, 2008b;
López-Andreo et al., 2005; Soares et al., 2013). This control is of high
importance in the analysis of processed food matrices that produce
low integrity and often low purity DNA extracts, allowing to normalise
the differences that might affect PCR amplification and compromise reliable
quantification (Sawyer, Wood, Shanahan, Gout, & McDowell,
2003; Soares et al., 2013). Itmust be referred that most reported studies
so far, independently of the amplified target, are applied for detection
purposes without achieving true quantification.
3.1. Real-time PCR calibration curve and linearity
The normalised calibration curve obtained by plotting the calculated
ΔCt vs. the logarithmof soybean percentage of five concentration levels
is presented in Fig. 1. Therefore, the estimation of dried soybean was
determined by the equation:
Soybean% ¼ 10
11:732−ΔCt
3:7752 :
This approach allows the estimation of added soybean in the range
of 0.0125% to 6.25% of dried soybean protein, which can be converted
to hydrated textured soybean in meat in the range of 0.1% to 50%. Considering
that the limit of detection (LOD) is the lowest concentration
level with positive identification of the analyte at least in 95% of the
times, the value of 0.0125% of dried soybean protein was considered
the relative LOD of the method since all replicates (14) amplified positively.
The relative limit of quantification (LOQ) achieved was equal to
the LOD since it was within the linear range of the calibration curve.
The equation in Fig. 1 covers a linear dynamic range of a least of 3 orders
of magnitude, as suggested by the MIQE (Minimum Information for
Publication of Quantitative real-time PCR Experiments) guidelines of
Bustin et al. (2009), with a high correlation coefficient (R2 = 0.9986).
The calculation of PCR efficiency is ofmajor relevance to assess the performance
of real-time quantitative PCR assays, being calculated from
the slope of the calibration curve using the following expression:
frauds also provided a driving force towards the development of specific
and sensitive methods that allow the identification of food ingredients.
Nevertheless, to fully address this need, analyticalmethodologies should
also allow performing accurate quantitative measurements beyond the
specific detection of an ingredient. In particular, quantification of target
ingredients is of major importance when: (i) a certain level of adventitious
contamination is allowed by legislation, such as the case of
authorised geneticallymodified organisms in European Union, whose labelling
in foods is not mandatory when in amounts b0.9% (Commission
Regulation (EC) No. 1829, 1829/2003); (ii) amaximum level of an added
ingredient is established in the legislation for particular products; and
(iii) there is a need to verify the veracity of labels regarding the declared
quantities of used ingredients.
In the presentwork,we propose the development of a real-time PCR
assay for accurate soybean quantification based on the use of primers
and probes targeting specific fragments of the lectin gene of soybean
(Mafra et al., 2008b) and the eukaryotic 18S rRNA gene, as a reference
control for normalisation (López-Andreo et al., 2005). To guarantee
reliable and accurate quantification by real-time PCR, the use of a
reference endogenous gene that takes into account possible amplification
differences due to different DNA recovery and quality/degradation
among extracts is of major importance (Fajardo et al., 2008a, 2008b;
López-Andreo et al., 2005; Soares et al., 2013). This control is of high
importance in the analysis of processed food matrices that produce
low integrity and often low purity DNA extracts, allowing to normalise
the differences that might affect PCR amplification and compromise reliable
quantification (Sawyer, Wood, Shanahan, Gout, & McDowell,
2003; Soares et al., 2013). Itmust be referred that most reported studies
so far, independently of the amplified target, are applied for detection
purposes without achieving true quantification.
3.1. Real-time PCR calibration curve and linearity
The normalised calibration curve obtained by plotting the calculated
ΔCt vs. the logarithmof soybean percentage of five concentration levels
is presented in Fig. 1. Therefore, the estimation of dried soybean was
determined by the equation:
Soybean% ¼ 10
11:732−ΔCt
3:7752 :
This approach allows the estimation of added soybean in the range
of 0.0125% to 6.25% of dried soybean protein, which can be converted
to hydrated textured soybean in meat in the range of 0.1% to 50%. Considering
that the limit of detection (LOD) is the lowest concentration
level with positive identification of the analyte at least in 95% of the
times, the value of 0.0125% of dried soybean protein was considered
the relative LOD of the method since all replicates (14) amplified positively.
The relative limit of quantification (LOQ) achieved was equal to
the LOD since it was within the linear range of the calibration curve.
The equation in Fig. 1 covers a linear dynamic range of a least of 3 orders
of magnitude, as suggested by the MIQE (Minimum Information for
Publication of Quantitative real-time PCR Experiments) guidelines of
Bustin et al. (2009), with a high correlation coefficient (R2 = 0.9986).
The calculation of PCR efficiency is ofmajor relevance to assess the performance
of real-time quantitative PCR assays, being calculated from
the slope of the calibration curve using the following expression:
การแปล กรุณารอสักครู่..
ดาว CA, USA) โดยใช้เงื่อนไขต่อไปนี้: 95 ° C เป็นเวลา 5 นาที, 50
รอบที่95 ° C เป็นเวลา 30 วินาทีและ 55 ° C for1min
กับคอลเลกชันของการเรืองแสงสัญญาณตอนท้ายของแต่ละรอบ เก็บรวบรวมข้อมูลและประมวลผลโดยใช้
iCycler iQ ™แบบ Real-time รุ่นซอฟแวร์ระบบตรวจจับ 3.1 แต่ละ
samplewas
ไม่รู้จักและคนตาบอดในการขยายเพิ่มขึ้นสามเท่าและแต่ละมาตรฐานในการตรวจซ้ำ ผสมอ้างอิงสำหรับเส้นโค้งการสอบเทียบตาบอดและตัวอย่างที่ไม่รู้จักถูกขยายต่อไปในการตรวจอิสระ (n = 7 n = 4and n = 3 ตามลำดับ). เพื่อพัฒนาวิธีการเชิงปริมาณที่มีประสิทธิภาพที่สามารถนำไปใช้ processedmeat ผลิตภัณฑ์ก่อสร้างปกติที่กราฟมาตรฐานที่เสนอโดยใช้แบบ real-time PCR เกณฑ์วงจร (CT) ค่าจากการขยายของผสมอ้างอิงไบนารีกำหนดเป้าหมายถั่วเหลือง(ยีนเลคติน) และการควบคุมภายนอก (ยีน eukaryotic) การที่ระบบการประยุกต์ใช้วิธีการΔCtเพื่อสร้างรูปแบบการสอบเทียบถูกนำมาใช้โดยการคำนวณ: ΔCt¼ Ctsoybean-Cteuk ที่ Ctsoybean และ Cteuk เป็นเกณฑ์วงจรถั่วเหลืองและระบบeukaryotic ตามลำดับ สอบเทียบ curvewas ได้แล้วโดยวางแผนΔCtคำนวณเทียบกับถั่วเหลืองlogarithmof ร้อยละของห้าระดับความเข้มข้น. 3 ผลการทดลองและการอภิปรายหลายกรณีของการปลอมปนเนื้อออกอากาศโดยสื่อในความกังวลของปีที่ผ่านมามีความรุนแรงของผู้บริโภคเกี่ยวกับองค์ประกอบของอาหารที่พวกเขากำลังรับประทานอาหาร ในทำนองเดียวกันจำเป็นที่จะต้องตรวจสอบการปฏิบัติตามของการติดฉลากที่มีการบังคับใช้กฎหมายและการตรวจสอบของเศรษฐกิจการทุจริตนอกจากนี้ยังเป็นแรงผลักดันไปสู่การพัฒนาของเฉพาะวิธีการและที่สำคัญที่ช่วยให้บัตรประจำตัวของส่วนผสมอาหาร. แต่อย่างเต็มที่อยู่ต้องนี้ analyticalmethodologies ควรยังช่วยให้การดำเนินการการวัดเชิงปริมาณที่ถูกต้องเกินกว่าการตรวจสอบที่เฉพาะเจาะจงของส่วนผสม โดยเฉพาะอย่างยิ่งปริมาณของเป้าหมายส่วนผสมที่มีความสำคัญที่สำคัญเมื่อ: (i) ระดับหนึ่งของความบังเอิญปนเปื้อนที่ได้รับอนุญาตตามกฎหมายเช่นกรณีของสิ่งมีชีวิตgeneticallymodified อำนาจในสหภาพยุโรปที่มีการติดฉลากอาหารไม่จำเป็นเมื่ออยู่ในb0 จำนวน 0.9% (สำนักงานคณะกรรมการกำกับRegulation (EC) เลขที่ 1829, 1829/2003); (ii) ระดับของ amaximum เพิ่มจัดตั้งขึ้นเป็นส่วนผสมในการออกกฎหมายสำหรับผลิตภัณฑ์โดยเฉพาะอย่างยิ่ง และ(iii) มีความจำเป็นที่จะต้องตรวจสอบความจริงของป้ายเกี่ยวกับการประกาศปริมาณของส่วนผสมที่ใช้. ใน presentwork ที่เรานำเสนอการพัฒนาแบบ real-time PCR ตรวจหาปริมาณถั่วเหลืองที่ถูกต้องขึ้นอยู่กับการใช้งานของไพรเมอร์และยานสำรวจกำหนดเป้าหมายชิ้นส่วนที่เฉพาะเจาะจงของยีนเลคตินจากถั่วเหลือง(Mafra et al., 2008b) และยีน 18S rRNA eukaryotic, เป็นข้อมูลอ้างอิงการควบคุมสำหรับการฟื้นฟู(López-Andreo et al., 2005) เพื่อรับประกันปริมาณที่น่าเชื่อถือและถูกต้องโดยวิธี PCR แบบ real-time การใช้ที่ยีนภายนอกอ้างอิงที่จะเข้าสู่การขยายบัญชีที่เป็นไปได้แตกต่างจากการฟื้นตัวของดีเอ็นเอที่แตกต่างกันและคุณภาพ/ ย่อยสลายในหมู่สารสกัดที่มีความสำคัญที่สำคัญ(Fajardo et al., 2008a, 2008b ; López-Andreo et al, 2005;. Soares et al, 2013). การควบคุมนี้จะมีความสูงถึงความสำคัญในการวิเคราะห์การฝึกอบรมอาหารแปรรูปที่ผลิตสมบูรณ์ต่ำและมักจะมีความบริสุทธิ์สารสกัดดีเอ็นเอต่ำที่ช่วยให้ที่จะปรับความแตกต่างที่อาจส่งผลกระทบต่อการขยายPCR และการประนีประนอมที่เชื่อถือได้ปริมาณ(เลื่อยไม้ฮานโรคเกาต์และ McDowell, 2003. Soares et al, 2013) Itmust จะเรียกว่าส่วนใหญ่รายงานการศึกษาเพื่อให้ห่างไกลเป็นอิสระจากการขยายเป้าหมายที่จะนำไปใช้สำหรับการตรวจสอบวัตถุประสงค์โดยไม่ประสบความสำเร็จในปริมาณที่แท้จริง. 3.1 Real-time PCR กราฟมาตรฐานเป็นเส้นตรงและเส้นโค้งการสอบเทียบปกติที่ได้จากการวางแผนคำนวณΔCtกับถั่วเหลืองlogarithmof ร้อยละของระดับความเข้มข้นห้าจะนำเสนอในรูป 1. ดังนั้นการประมาณถั่วเหลืองแห้งที่ถูกกำหนดโดยสมการ:% ถั่วเหลือง¼ 10 11: 732-ΔCt 3: 7752: วิธีการนี้จะช่วยให้การประมาณถั่วเหลืองเพิ่มในช่วงของ 0.0125% เป็น 6.25% ของโปรตีนถั่วเหลืองแห้ง ซึ่งสามารถแปลงไปไฮเดรทถั่วเหลืองพื้นผิวในเนื้อสัตว์ในช่วงของ0.1% ถึง 50% พิจารณาว่าขีด จำกัด ของการตรวจสอบ (LOD) คือความเข้มข้นต่ำสุดที่ระดับที่มีการระบุในเชิงบวกของวิเคราะห์อย่างน้อย95% ของเวลาที่มีค่าของ0.0125% ของโปรตีนถั่วเหลืองแห้งได้รับการพิจารณาล็อดญาติของวิธีการตั้งแต่ซ้ำทั้งหมด( 14) ขยายบวก. จำกัด ญาติของปริมาณ (LOQ) ประสบความสำเร็จเท่ากับล็อดเพราะมันเป็นอยู่ในช่วงโค้งเชิงเส้นของการสอบเทียบ. สมการในรูป 1 ครอบคลุมช่วงแบบไดนามิกเชิงเส้นของอย่างน้อย 3 คำสั่งของขนาดที่แนะนำโดยMIQE (ข้อมูลขั้นต่ำสำหรับการเผยแพร่เชิงปริมาณแบบreal-time PCR ทดลอง) แนวทางของBustin et al, (2009) ที่มีค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์สูง (R2 = 0.9986). การคำนวณประสิทธิภาพ PCR เป็น ofmajor เกี่ยวข้องในการประเมินผลการปฏิบัติงานของreal-time PCR ตรวจเชิงปริมาณจะถูกคำนวณจากความลาดชันของเส้นโค้งการสอบเทียบโดยใช้การแสดงออกต่อไปนี้:
รอบที่95 ° C เป็นเวลา 30 วินาทีและ 55 ° C for1min
กับคอลเลกชันของการเรืองแสงสัญญาณตอนท้ายของแต่ละรอบ เก็บรวบรวมข้อมูลและประมวลผลโดยใช้
iCycler iQ ™แบบ Real-time รุ่นซอฟแวร์ระบบตรวจจับ 3.1 แต่ละ
samplewas
ไม่รู้จักและคนตาบอดในการขยายเพิ่มขึ้นสามเท่าและแต่ละมาตรฐานในการตรวจซ้ำ ผสมอ้างอิงสำหรับเส้นโค้งการสอบเทียบตาบอดและตัวอย่างที่ไม่รู้จักถูกขยายต่อไปในการตรวจอิสระ (n = 7 n = 4and n = 3 ตามลำดับ). เพื่อพัฒนาวิธีการเชิงปริมาณที่มีประสิทธิภาพที่สามารถนำไปใช้ processedmeat ผลิตภัณฑ์ก่อสร้างปกติที่กราฟมาตรฐานที่เสนอโดยใช้แบบ real-time PCR เกณฑ์วงจร (CT) ค่าจากการขยายของผสมอ้างอิงไบนารีกำหนดเป้าหมายถั่วเหลือง(ยีนเลคติน) และการควบคุมภายนอก (ยีน eukaryotic) การที่ระบบการประยุกต์ใช้วิธีการΔCtเพื่อสร้างรูปแบบการสอบเทียบถูกนำมาใช้โดยการคำนวณ: ΔCt¼ Ctsoybean-Cteuk ที่ Ctsoybean และ Cteuk เป็นเกณฑ์วงจรถั่วเหลืองและระบบeukaryotic ตามลำดับ สอบเทียบ curvewas ได้แล้วโดยวางแผนΔCtคำนวณเทียบกับถั่วเหลืองlogarithmof ร้อยละของห้าระดับความเข้มข้น. 3 ผลการทดลองและการอภิปรายหลายกรณีของการปลอมปนเนื้อออกอากาศโดยสื่อในความกังวลของปีที่ผ่านมามีความรุนแรงของผู้บริโภคเกี่ยวกับองค์ประกอบของอาหารที่พวกเขากำลังรับประทานอาหาร ในทำนองเดียวกันจำเป็นที่จะต้องตรวจสอบการปฏิบัติตามของการติดฉลากที่มีการบังคับใช้กฎหมายและการตรวจสอบของเศรษฐกิจการทุจริตนอกจากนี้ยังเป็นแรงผลักดันไปสู่การพัฒนาของเฉพาะวิธีการและที่สำคัญที่ช่วยให้บัตรประจำตัวของส่วนผสมอาหาร. แต่อย่างเต็มที่อยู่ต้องนี้ analyticalmethodologies ควรยังช่วยให้การดำเนินการการวัดเชิงปริมาณที่ถูกต้องเกินกว่าการตรวจสอบที่เฉพาะเจาะจงของส่วนผสม โดยเฉพาะอย่างยิ่งปริมาณของเป้าหมายส่วนผสมที่มีความสำคัญที่สำคัญเมื่อ: (i) ระดับหนึ่งของความบังเอิญปนเปื้อนที่ได้รับอนุญาตตามกฎหมายเช่นกรณีของสิ่งมีชีวิตgeneticallymodified อำนาจในสหภาพยุโรปที่มีการติดฉลากอาหารไม่จำเป็นเมื่ออยู่ในb0 จำนวน 0.9% (สำนักงานคณะกรรมการกำกับRegulation (EC) เลขที่ 1829, 1829/2003); (ii) ระดับของ amaximum เพิ่มจัดตั้งขึ้นเป็นส่วนผสมในการออกกฎหมายสำหรับผลิตภัณฑ์โดยเฉพาะอย่างยิ่ง และ(iii) มีความจำเป็นที่จะต้องตรวจสอบความจริงของป้ายเกี่ยวกับการประกาศปริมาณของส่วนผสมที่ใช้. ใน presentwork ที่เรานำเสนอการพัฒนาแบบ real-time PCR ตรวจหาปริมาณถั่วเหลืองที่ถูกต้องขึ้นอยู่กับการใช้งานของไพรเมอร์และยานสำรวจกำหนดเป้าหมายชิ้นส่วนที่เฉพาะเจาะจงของยีนเลคตินจากถั่วเหลือง(Mafra et al., 2008b) และยีน 18S rRNA eukaryotic, เป็นข้อมูลอ้างอิงการควบคุมสำหรับการฟื้นฟู(López-Andreo et al., 2005) เพื่อรับประกันปริมาณที่น่าเชื่อถือและถูกต้องโดยวิธี PCR แบบ real-time การใช้ที่ยีนภายนอกอ้างอิงที่จะเข้าสู่การขยายบัญชีที่เป็นไปได้แตกต่างจากการฟื้นตัวของดีเอ็นเอที่แตกต่างกันและคุณภาพ/ ย่อยสลายในหมู่สารสกัดที่มีความสำคัญที่สำคัญ(Fajardo et al., 2008a, 2008b ; López-Andreo et al, 2005;. Soares et al, 2013). การควบคุมนี้จะมีความสูงถึงความสำคัญในการวิเคราะห์การฝึกอบรมอาหารแปรรูปที่ผลิตสมบูรณ์ต่ำและมักจะมีความบริสุทธิ์สารสกัดดีเอ็นเอต่ำที่ช่วยให้ที่จะปรับความแตกต่างที่อาจส่งผลกระทบต่อการขยายPCR และการประนีประนอมที่เชื่อถือได้ปริมาณ(เลื่อยไม้ฮานโรคเกาต์และ McDowell, 2003. Soares et al, 2013) Itmust จะเรียกว่าส่วนใหญ่รายงานการศึกษาเพื่อให้ห่างไกลเป็นอิสระจากการขยายเป้าหมายที่จะนำไปใช้สำหรับการตรวจสอบวัตถุประสงค์โดยไม่ประสบความสำเร็จในปริมาณที่แท้จริง. 3.1 Real-time PCR กราฟมาตรฐานเป็นเส้นตรงและเส้นโค้งการสอบเทียบปกติที่ได้จากการวางแผนคำนวณΔCtกับถั่วเหลืองlogarithmof ร้อยละของระดับความเข้มข้นห้าจะนำเสนอในรูป 1. ดังนั้นการประมาณถั่วเหลืองแห้งที่ถูกกำหนดโดยสมการ:% ถั่วเหลือง¼ 10 11: 732-ΔCt 3: 7752: วิธีการนี้จะช่วยให้การประมาณถั่วเหลืองเพิ่มในช่วงของ 0.0125% เป็น 6.25% ของโปรตีนถั่วเหลืองแห้ง ซึ่งสามารถแปลงไปไฮเดรทถั่วเหลืองพื้นผิวในเนื้อสัตว์ในช่วงของ0.1% ถึง 50% พิจารณาว่าขีด จำกัด ของการตรวจสอบ (LOD) คือความเข้มข้นต่ำสุดที่ระดับที่มีการระบุในเชิงบวกของวิเคราะห์อย่างน้อย95% ของเวลาที่มีค่าของ0.0125% ของโปรตีนถั่วเหลืองแห้งได้รับการพิจารณาล็อดญาติของวิธีการตั้งแต่ซ้ำทั้งหมด( 14) ขยายบวก. จำกัด ญาติของปริมาณ (LOQ) ประสบความสำเร็จเท่ากับล็อดเพราะมันเป็นอยู่ในช่วงโค้งเชิงเส้นของการสอบเทียบ. สมการในรูป 1 ครอบคลุมช่วงแบบไดนามิกเชิงเส้นของอย่างน้อย 3 คำสั่งของขนาดที่แนะนำโดยMIQE (ข้อมูลขั้นต่ำสำหรับการเผยแพร่เชิงปริมาณแบบreal-time PCR ทดลอง) แนวทางของBustin et al, (2009) ที่มีค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์สูง (R2 = 0.9986). การคำนวณประสิทธิภาพ PCR เป็น ofmajor เกี่ยวข้องในการประเมินผลการปฏิบัติงานของreal-time PCR ตรวจเชิงปริมาณจะถูกคำนวณจากความลาดชันของเส้นโค้งการสอบเทียบโดยใช้การแสดงออกต่อไปนี้:
การแปล กรุณารอสักครู่..
Hercules , CA , USA ) ใช้เงื่อนไขต่อไปนี้ : 95 องศา C เป็นเวลา 5 นาที , 50 รอบ
ที่ 95 องศา C 30 และ 55 องศา C for1min , กับคอลเลกชันของ fluorescence
สัญญาณในตอนท้ายของแต่ละรอบ การเก็บรวบรวมข้อมูลและประมวลผลด้วย
icycler ไอคิว™เวลาจริงซอฟต์แวร์ระบบตรวจจับรุ่น 3.1 . แต่ละ
ไม่รู้จัก และตาบอด samplewas ขยายทั้งสามใบ และแต่ละมาตรฐาน
ในเลือดซ้ำอ้างอิงจากในรูปโค้ง , ตาบอดและ
ตัวอย่างได้ขยายอิสระในเลือด ( n =
7 N = N = 4 และ 3 ตามลำดับ )
พัฒนาประสิทธิภาพเชิงปริมาณที่สามารถใช้กับ processedmeat
ผลิตภัณฑ์ก่อสร้างในครึ่งปีหลังรูปโค้ง
เสนอใช้เรียลไทม์พีซีอาร์รอบ ธรณีประตู ( CT ) จากค่า
การเพิ่มปริมาณของไบนารีอ้างอิง
( ยีนเลคตินจากถั่วเหลือง เป้าหมาย ) และการควบคุม ( eukaryotic โครงสร้างยีน ) สำหรับที่
ระบบ การประยุกต์วิธี CT Δเพื่อสร้างแบบจำลองการใช้โดยการคำนวณ :
Δ CT ¼ ctsoybean – cteuk
และที่ ctsoybean cteuk เป็นวัฏจักร ซึ่งสำหรับถั่วเหลืองและ
ระบบเข้ามาตามลำดับ การสอบเทียบได้
curvewas จากนั้นโดยจะคำนวณΔ CT กับ logarithmof ถั่วเหลือง 5 ระดับความเข้มข้นร้อยละ
.
3 ผลและการอภิปราย
กรณีหลายเนื้อสัตว์ปลอมปน ออกอากาศ โดยสื่อใน
ปีสุดท้ายมีมากขึ้นของผู้บริโภคเกี่ยวกับองค์ประกอบ
ของอาหารที่พวกเขากิน อนึ่ง ต้องตรวจสอบ
การปฏิบัติตามการติดฉลากกับกฎหมายและการตรวจสอบทุจริตประหยัด
ยังให้พลังขับเคลื่อนไปสู่การพัฒนาที่เฉพาะเจาะจงและวิธีการที่อนุญาตให้ไว
รหัสของส่วนประกอบอาหาร อย่างไรก็ตาม อย่างที่อยู่ต้องนี้ analyticalmethodologies ควร
ยังให้แสดงปริมาณการวัดที่ถูกต้องนอกเหนือจาก
ตรวจจับเฉพาะของส่วนประกอบโดยเฉพาะ ปริมาณของส่วนผสมเป้าหมาย
เป็นหลักสําคัญเมื่อ : ( ฉัน ) ระดับของการปนเปื้อนปากดี
ได้รับอนุญาตโดยกฎหมาย เช่น กรณีของ
อนุญาต geneticallymodified สิ่งมีชีวิตในสหภาพยุโรปที่มีฉลาก
ในอาหารจะไม่บังคับ เมื่อปริมาณ b0.9 % ( ระเบียบคณะกรรมการ
( EC ) เลขที่ 1829 1829 / 2003 ) ; ( 2 ) ระดับของการเพิ่ม
amaximumส่วนผสม ก่อตั้งขึ้นในผลิตภัณฑ์เฉพาะและกฎหมาย ;
( 3 ) ต้องมีการตรวจสอบข้อเท็จจริงของป้ายเกี่ยวกับปริมาณของส่วนผสมที่ใช้ประกาศ
.
ใน presentwork เรานำเสนอการพัฒนาวิธี PCR แบบเรียลไทม์สำหรับปริมาณถั่วเหลือง
ถูกต้องขึ้นอยู่กับการใช้ไพรเมอร์
โพรบและเป้าหมายที่เฉพาะเจาะจง ชิ้นส่วนของยีนเลคตินจากถั่วเหลือง
( มาฟรา et al . , 2008b ) และยูคาริโอติก 18S rRNA ยีน เป็นการอ้างอิง
ควบคุมสำหรับการฟื้นฟู ( โลเปซ andreo et al . , 2005 ) รับประกัน
น่าเชื่อถือและถูกต้องปริมาณโดยวิธี PCR แบบเรียลไทม์ ใช้ของ
อ้างอิงภายในยีนคำนึงถึงที่สุด (
ความแตกต่างเนื่องจากการกู้คืน ดีเอ็นเอที่แตกต่างกันและคุณภาพ / การสลายตัว
ระหว่างสารสกัดเป็นหลักสําคัญ ( ฟาจาร์โด้ et al .2008a 2008b ;
, , โลเปซ andreo et al . , 2005 ; Soares et al . , 2013 ) การควบคุมนี้มีความสำคัญสูง
ในการวิเคราะห์เมทริกซ์ที่ผลิตอาหารแปรรูปต่ำและมักจะสกัดดีเอ็นเอ
ความความบริสุทธิ์ต่ำให้ปกติ
ความแตกต่างที่อาจมีผลต่อการขยาย PCR และการประนีประนอมปริมาณที่เชื่อถือได้
( เลื่อยไม้ , ไม้ , แชเนอแฮน , เกาต์ , & McDowell ,
2003 ; Soares et al . , 2013 ) .ต้องเรียกว่าส่วนใหญ่รายงานการศึกษา
ดังนั้นไกล เป็นอิสระจากการขยายเป้าหมาย มีการใช้เพื่อวัตถุประสงค์ในการตรวจหาปริมาณโดยไม่บรรลุจริง
.
1 . เวลาจริงและการสอบเทียบเส้นโค้งและเส้นตรง
เนื่องจากรูปโค้งได้พล็อตค่า
Δ CT กับ logarithmof ถั่วเหลืองร้อยละห้าระดับความเข้มข้นที่แสดงในรูปที่ 1
. ดังนั้นการประมาณค่าของถั่วเหลืองอบแห้ง
กำหนดโดยสมการ :
% ¼ถั่วเหลือง 10
11:732 −Δ CT 3:7752 : วิธีนี้ช่วยให้การเพิ่มถั่วเหลืองในช่วงร้อยละ 6.25 ตัด
ของโปรตีนถั่วเหลืองแห้งซึ่งสามารถแปลง
เพื่อ hydrated พื้นผิว ถั่วเหลือง เนื้อสัตว์ในช่วง 0.1 % - 50 % ที่ขีด จำกัด ของการพิจารณา
( LOD ) คือความเข้มข้นต่ำสุดระดับการเชิงบวกของครูอย่างน้อย 95% ของ
ครั้ง ค่าตัด % ของโปรตีนถั่วเหลืองแห้งถือว่า
LOD สัมพัทธ์ของวิธีการทั้งหมดตั้งแต่ซ้ำ ( 14 ) ขยายบวก .
จำกัดสัมพัทธ์ของปริมาณ ( loq ) ได้เท่ากับ
LOD ตั้งแต่มันอยู่ใน ช่วงเชิงเส้นของรูปโค้ง .
ในรูปสมการ1 ครอบคลุมช่วงไดนามิคเชิงเส้นของอย่างน้อย 3 คำสั่ง
ขนาดตามที่แนะนำโดย miqe ( ข้อมูลขั้นต่ำสำหรับสิ่งพิมพ์ของปริมาณ PCR แบบเรียลไทม์ (
) แนวทาง bustin et al . ( 2009 ) กับค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์สูง ( R2 = 0.9986 ) .
การคำนวณประสิทธิภาพของ PCR ofmajor ความเกี่ยวข้องเพื่อประเมินประสิทธิภาพของวิธีการเชิงปริมาณ PCR แบบเรียลไทม์
,การคํานวณจากความชันของเส้นโค้งสอบเทียบ
โดยใช้การแสดงออกดังต่อไปนี้ :
ที่ 95 องศา C 30 และ 55 องศา C for1min , กับคอลเลกชันของ fluorescence
สัญญาณในตอนท้ายของแต่ละรอบ การเก็บรวบรวมข้อมูลและประมวลผลด้วย
icycler ไอคิว™เวลาจริงซอฟต์แวร์ระบบตรวจจับรุ่น 3.1 . แต่ละ
ไม่รู้จัก และตาบอด samplewas ขยายทั้งสามใบ และแต่ละมาตรฐาน
ในเลือดซ้ำอ้างอิงจากในรูปโค้ง , ตาบอดและ
ตัวอย่างได้ขยายอิสระในเลือด ( n =
7 N = N = 4 และ 3 ตามลำดับ )
พัฒนาประสิทธิภาพเชิงปริมาณที่สามารถใช้กับ processedmeat
ผลิตภัณฑ์ก่อสร้างในครึ่งปีหลังรูปโค้ง
เสนอใช้เรียลไทม์พีซีอาร์รอบ ธรณีประตู ( CT ) จากค่า
การเพิ่มปริมาณของไบนารีอ้างอิง
( ยีนเลคตินจากถั่วเหลือง เป้าหมาย ) และการควบคุม ( eukaryotic โครงสร้างยีน ) สำหรับที่
ระบบ การประยุกต์วิธี CT Δเพื่อสร้างแบบจำลองการใช้โดยการคำนวณ :
Δ CT ¼ ctsoybean – cteuk
และที่ ctsoybean cteuk เป็นวัฏจักร ซึ่งสำหรับถั่วเหลืองและ
ระบบเข้ามาตามลำดับ การสอบเทียบได้
curvewas จากนั้นโดยจะคำนวณΔ CT กับ logarithmof ถั่วเหลือง 5 ระดับความเข้มข้นร้อยละ
.
3 ผลและการอภิปราย
กรณีหลายเนื้อสัตว์ปลอมปน ออกอากาศ โดยสื่อใน
ปีสุดท้ายมีมากขึ้นของผู้บริโภคเกี่ยวกับองค์ประกอบ
ของอาหารที่พวกเขากิน อนึ่ง ต้องตรวจสอบ
การปฏิบัติตามการติดฉลากกับกฎหมายและการตรวจสอบทุจริตประหยัด
ยังให้พลังขับเคลื่อนไปสู่การพัฒนาที่เฉพาะเจาะจงและวิธีการที่อนุญาตให้ไว
รหัสของส่วนประกอบอาหาร อย่างไรก็ตาม อย่างที่อยู่ต้องนี้ analyticalmethodologies ควร
ยังให้แสดงปริมาณการวัดที่ถูกต้องนอกเหนือจาก
ตรวจจับเฉพาะของส่วนประกอบโดยเฉพาะ ปริมาณของส่วนผสมเป้าหมาย
เป็นหลักสําคัญเมื่อ : ( ฉัน ) ระดับของการปนเปื้อนปากดี
ได้รับอนุญาตโดยกฎหมาย เช่น กรณีของ
อนุญาต geneticallymodified สิ่งมีชีวิตในสหภาพยุโรปที่มีฉลาก
ในอาหารจะไม่บังคับ เมื่อปริมาณ b0.9 % ( ระเบียบคณะกรรมการ
( EC ) เลขที่ 1829 1829 / 2003 ) ; ( 2 ) ระดับของการเพิ่ม
amaximumส่วนผสม ก่อตั้งขึ้นในผลิตภัณฑ์เฉพาะและกฎหมาย ;
( 3 ) ต้องมีการตรวจสอบข้อเท็จจริงของป้ายเกี่ยวกับปริมาณของส่วนผสมที่ใช้ประกาศ
.
ใน presentwork เรานำเสนอการพัฒนาวิธี PCR แบบเรียลไทม์สำหรับปริมาณถั่วเหลือง
ถูกต้องขึ้นอยู่กับการใช้ไพรเมอร์
โพรบและเป้าหมายที่เฉพาะเจาะจง ชิ้นส่วนของยีนเลคตินจากถั่วเหลือง
( มาฟรา et al . , 2008b ) และยูคาริโอติก 18S rRNA ยีน เป็นการอ้างอิง
ควบคุมสำหรับการฟื้นฟู ( โลเปซ andreo et al . , 2005 ) รับประกัน
น่าเชื่อถือและถูกต้องปริมาณโดยวิธี PCR แบบเรียลไทม์ ใช้ของ
อ้างอิงภายในยีนคำนึงถึงที่สุด (
ความแตกต่างเนื่องจากการกู้คืน ดีเอ็นเอที่แตกต่างกันและคุณภาพ / การสลายตัว
ระหว่างสารสกัดเป็นหลักสําคัญ ( ฟาจาร์โด้ et al .2008a 2008b ;
, , โลเปซ andreo et al . , 2005 ; Soares et al . , 2013 ) การควบคุมนี้มีความสำคัญสูง
ในการวิเคราะห์เมทริกซ์ที่ผลิตอาหารแปรรูปต่ำและมักจะสกัดดีเอ็นเอ
ความความบริสุทธิ์ต่ำให้ปกติ
ความแตกต่างที่อาจมีผลต่อการขยาย PCR และการประนีประนอมปริมาณที่เชื่อถือได้
( เลื่อยไม้ , ไม้ , แชเนอแฮน , เกาต์ , & McDowell ,
2003 ; Soares et al . , 2013 ) .ต้องเรียกว่าส่วนใหญ่รายงานการศึกษา
ดังนั้นไกล เป็นอิสระจากการขยายเป้าหมาย มีการใช้เพื่อวัตถุประสงค์ในการตรวจหาปริมาณโดยไม่บรรลุจริง
.
1 . เวลาจริงและการสอบเทียบเส้นโค้งและเส้นตรง
เนื่องจากรูปโค้งได้พล็อตค่า
Δ CT กับ logarithmof ถั่วเหลืองร้อยละห้าระดับความเข้มข้นที่แสดงในรูปที่ 1
. ดังนั้นการประมาณค่าของถั่วเหลืองอบแห้ง
กำหนดโดยสมการ :
% ¼ถั่วเหลือง 10
11:732 −Δ CT 3:7752 : วิธีนี้ช่วยให้การเพิ่มถั่วเหลืองในช่วงร้อยละ 6.25 ตัด
ของโปรตีนถั่วเหลืองแห้งซึ่งสามารถแปลง
เพื่อ hydrated พื้นผิว ถั่วเหลือง เนื้อสัตว์ในช่วง 0.1 % - 50 % ที่ขีด จำกัด ของการพิจารณา
( LOD ) คือความเข้มข้นต่ำสุดระดับการเชิงบวกของครูอย่างน้อย 95% ของ
ครั้ง ค่าตัด % ของโปรตีนถั่วเหลืองแห้งถือว่า
LOD สัมพัทธ์ของวิธีการทั้งหมดตั้งแต่ซ้ำ ( 14 ) ขยายบวก .
จำกัดสัมพัทธ์ของปริมาณ ( loq ) ได้เท่ากับ
LOD ตั้งแต่มันอยู่ใน ช่วงเชิงเส้นของรูปโค้ง .
ในรูปสมการ1 ครอบคลุมช่วงไดนามิคเชิงเส้นของอย่างน้อย 3 คำสั่ง
ขนาดตามที่แนะนำโดย miqe ( ข้อมูลขั้นต่ำสำหรับสิ่งพิมพ์ของปริมาณ PCR แบบเรียลไทม์ (
) แนวทาง bustin et al . ( 2009 ) กับค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์สูง ( R2 = 0.9986 ) .
การคำนวณประสิทธิภาพของ PCR ofmajor ความเกี่ยวข้องเพื่อประเมินประสิทธิภาพของวิธีการเชิงปริมาณ PCR แบบเรียลไทม์
,การคํานวณจากความชันของเส้นโค้งสอบเทียบ
โดยใช้การแสดงออกดังต่อไปนี้ :
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- เครื่องปั้นดินเผามีความผูกพันกับการดำรงช
- A series of unknown bacteria samples wer
- great
- That in itself
- เรื่องเริ่มขึ้นเมื่อโรเมโอกับเพื่อนของเข
- ได้เเก่
- gross profit
- ฉันอาศัยอยุ่ลำปาง
- ฉันรีดเสื้อนักเรียน
- ได้เเก่
- เครื่องปั้นดินเผามีความผูกพันกับการดำรงช
- Time to eat food with relatives and frie
- In the present
- A 4-week low dosage (500 mg/day) L-carni
- บ้านรวมรัก
- each treatment was aseptically excised,
- เครื่องปั้นดินเผามีความผูกพันกับการดำรงช
- ฉันรีดเสื้อนักเรียน
- Marketing Department
- น้ำมันพืช
- 英镑
- thai language is quite difficult for for
- Innovation Management
- ฉันชอบทุกๆภาพของคุณ
