2.3. TLC-overlay assayAsialo-GM1 an

2.3. TLC-overlay assay
Asialo-GM1 and sulfatide were obtained from Sigma
Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). TLC-overlay assays
were carried out as described previously with some modi
¢cations [14]. TLC was performed on silica gel-precoated
plates (Polygram, Sil G plastic plate; Macherey-Nagel
Co., Du«ran, Germany). The plates were developed in
chloroform^methanol^0.25% KCl (50:40:10), and then
dried. For visualization of glycolipids, the plate was
sprayed with orcinol reagent (500 mg orcinol in 3 mol
l31 sulfuric solution) and incubated at 100³C for color
development. For binding assay, the plate was blocked
with PBS containing 1% (w/v) gelatin and 0.02% (w/v)
sodium azide for 2 h. After being washed three times
with 1% (w/v) bovine serum albumin (BSA)-PBS with gentle
shaking (50 rpm) for 10 min, the plate was overlaid
with biotin-labeled bacterial cells (5U108 cells ml3) in
BSA-PBS with gentle shaking for 2 h at 37³C. The suspension
was removed by aspiration and the plate was
washed three times with BSA-PBS. The plate was then
dipped into BSA-PBS for 1 h, washed three times with
BSA-PBS and then incubated for 2 h with alkaline phosphatase-
conjugated streptavidin (Roche Diagnostics
GmbH, Mannheim, Germany) diluted to 1/2000 with
BSA-PBS. Thorough washing with BSA-PBS followed
by PBS preceded incubation with the enzyme substrate
solution kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).
The binding intensity was estimated by densitometric analysis
of stained TLC plates using an imagescanner and a
computer program (NIH Image).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3 การทดสอบ TLC แบบโอเวอร์เลย์Asialo GM1 และ sulfatide ได้รับมาจากซิกมาเคมี จำกัด (St. Louis, MO สหรัฐอเมริกา) Assays TLC ซ้อนทับได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้กับบาง modiหมายเลขเป็นของหายาก [14] ทำตามซิลิก้าเจล precoated TLCแผ่น (Polygram ภาษาศาสตร์ G แผ่นพลาสติก Macherey-Nagelบริษัท Du «วิ่ง เยอรมนี) แผ่นได้รับการพัฒนาในchloroform^methanol^0.25% KCl (50:40:10), และจากนั้นแห้ง สำหรับการแสดงภาพประกอบเพลงของ glycolipids จานได้ฉีดพ่น ด้วยรีเอเจนต์ orcinol (orcinol 500 มิลลิกรัมใน 3 โมลโซลูชัน l31 กำมะถัน) และ incubated ที่ C 100³ สีการพัฒนา สำหรับวิเคราะห์ผูก จานถูกบล็อกด้วย PBS ประกอบด้วยตุ๋น 1% (w/v) และ 0.02% (w/v)azide โซเดียมสำหรับ 2 h หลังจากการล้าง 3 ครั้งกับ 1% (w/v) วัว serum albumin (บีเอสเอ) -PBS กับใจสั่น (50 รอบต่อนาที) สำหรับ 10 นาที จานเป็น overlaidชื่อไบโอตินแบคทีเรียเซลล์ (5U108 เซลล์ ml3) ในบีเอสเอ-PBS กับสั่นอ่อนโยนสำหรับ h 2 ที่ซี 37³ การระงับถูกเอาออก โดยปณิธานและจานได้ล้าง 3 ครั้ง ด้วย PBS บีเอสเอ จานได้แล้วจุ่มลงในบีเอสเอ-PBS สำหรับ h 1 ล้างสามครั้งด้วยบีเอสเอ-PBS แล้ว incubated สำหรับ h 2 และอัลคาไลน์ฟอสฟาเตสstreptavidin กลวง (วินิจฉัยโรชมันน์ไฮม์ ประเทศเยอรมนี GmbH) ทำให้เจือจางเป็น 1/2000 ด้วยบีเอสเอ-PBS อย่างล้าง ด้วย PBS บีเอสเอด้วยโดย PBS หน้าบ่มกับพื้นผิวของเอนไซม์ชุดโซลูชัน (ห้องปฏิบัติการชีวภาพ Rad เฮอร์คิวลิส CA, USA)ความเข้มผูกถูกประมาณ โดยการวิเคราะห์ densitometricของ TLC ทิ้งคราบแผ่นใช้เป็น imagescanner และโปรแกรมคอมพิวเตอร์ (NIH ภาพ)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3 วิธี TLC-ซ้อนทับ
Asialo-GM1 และ sulfatide ที่ได้รับจาก Sigma
เคมี จำกัด (St. Louis, MO, USA) ตรวจ TLC-ซ้อนทับ
ได้ดำเนินการตามที่ระบุไว้ก่อนหน้านี้กับ Modi บาง
¢ไพเพอร์ [14] TLC ได้รับการดำเนินการบนซิลิกาเจล precoated
แผ่น (โพลี, Sil G แผ่นพลาสติก Macherey-แจคกี้
Co. , Du «วิ่ง, เยอรมนี) แผ่นถูกพัฒนาขึ้นใน
คลอโรฟอร์มเมทานอล ^ ^ 0.25% KCl (50:40:10) แล้ว
แห้ง สำหรับการแสดงของ glycolipids แผ่นได้รับการ
ฉีดพ่นด้วยน้ำยา orcinol (500 มิลลิกรัม orcinol ใน 3 mol
L31 แก้ปัญหากำมะถัน) และบ่มที่100³Cสี
พัฒนา สำหรับการผูกทดสอบแผ่นถูกบล็อก
กับพีบีเอสที่มี 1% (w / v) เจลาตินและ 0.02% (w / v)
โซเดียมเอไซด์เป็นเวลา 2 ชั่วโมง หลังจากได้รับการล้างสามครั้ง
กับ 1% (w / v) ซีรั่มอัลบูมิวัว (BSA) -PBS กับอ่อนโยน
สั่น (50 รอบต่อนาที) เป็นเวลา 10 นาที, แผ่นถูกซ้อนทับ
ด้วยไบโอตินที่มีสัญลักษณ์เซลล์แบคทีเรีย (5U108 เซลล์ ML3) ใน
BSA- พีบีเอสที่มีความอ่อนโยนเขย่าเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่37³C ระงับ
ถูกลบออกโดยความทะเยอทะยานและแผ่นถูก
ล้างสามครั้งกับ BSA-พีบีเอส แผ่นแล้ว
จุ่มลงไปใน BSA-พีบีเอสเป็นเวลา 1 ชั่วโมงล้างสามครั้งกับ
BSA-พีบีเอสและจากนั้นบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงกับอัลคาไลน์ phosphatase-
ผัน streptavidin (Roche Diagnostics
GmbH, ไฮม์, เยอรมนี) ปรับลดถึง 1/2000 กับ
BSA-พีบีเอส . ซักผ้าอย่างละเอียดกับบีเอสเอพีบีเอส-ตาม
โดยพีบีเอสนำบ่มกับสารตั้งต้นเอนไซม์
ชุดโซลูชั่น (ห้องปฏิบัติการ Bio-Rad, ดาว, CA, USA).
ความเข้มผูกพันเป็นที่คาดกันโดยการวิเคราะห์ densitometric
ของเพลต TLC สีโดยใช้ ImageScanner และ
โปรแกรมคอมพิวเตอร์ ( ภาพ NIH)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 (
asialo-gm1 sulfatide TLC ซ้อนทับและได้รับจาก Sigma
Chemical Co . ( St . Louis , MO , USA ) ( ทับ )
ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้กับโมดิ
¢แคตไอออน [ 14 ] คือใช้แผ่น TLC ซิลิกาเจล ( polygram
แผ่น , แผ่นพลาสติกซิล G ;
. macherey นาเกล ดู«รัน เยอรมนี ) จานถูกพัฒนาในเมทานอลคลอโรฟอร์ม


0.25 % โพแทสเซียม ( 50:40:10
) , และจากนั้นแห้ง สำหรับการแสดงผลของไกลโคลิปิด , จาน
พ่นด้วยสารเคมี ( ออร์ซินอล 500 มก. ออร์ซินอล 3 โมล
l31 สารละลายกรดซัลฟูริกและบ่มที่อุณหภูมิ 100 ³ C การพัฒนาสี

ผูกพันโดยจานอุดตัน
กับ PBS ที่มี 1% ( w / v ) เจลาตินและ 0.02 % ( w / v )
โซเดียมไซด์ 2 ชั่วโมงหลังจากการล้าง 3 ครั้ง
1 % ( w / v ) อัลบูมิน ( BSA ) - อ่อนโยน
PBS ด้วยสั่น ( 50 RPM ) เป็นเวลา 10 นาที จานหุ้ม
กับไบโอติน ( 5u108 ติดป้ายเซลล์แบคทีเรียเซลล์ ml3 )
bsa-pbs ด้วยความอ่อนโยนสั่น 2 ชั่วโมง 37 ³ซี. ช่วงล่าง
ถูกลบออกโดยปณิธานและจาน
ซักสามครั้งกับ bsa-pbs . จาน แล้วจุ่มลงใน bsa-pbs
1 H , ล้างสามครั้งด้วย
bsa-pbs แล้วบ่ม 2 H -
กับอัลคาไลน์ ฟอสฟาเตสและ streptavidin ( โรชวินิจฉัย
GmbH , Mannheim , เยอรมนี ) ประมาณ 1 / 2000 ด้วย
bsa-pbs . ล้างด้วย bsa-pbs อย่างละเอียดตาม
โดย PBS นำหน้าบ่มด้วยเอนไซม์ตั้งต้น
โซลูชั่นชุด ( ไบโอ ราดห้องปฏิบัติการ , Hercules , CA , USA ) .
เข้มผูกเป็นประมาณโดย densitometric การวิเคราะห์
แอม TLC จานใช้ imagescanner และ
โปรแกรมคอมพิวเตอร์ ( รวมภาพ )