Pure cultures of T. halophilus MS33

Pure cultures of T. halophilus MS33 and Virgibacillus sp. SK37
(100 mL) equivalent to 10e106 CFU/mL were centrifuged in 1.5-mL
microcentrifuge tubes at 10,000  g for 10 min to collect cell pellets
that were then washed twice with 1 mL of 1 Phosphate
Buffered Saline (1  PBS). The pellets were resuspended in 180 mL of
lysis buffer (20mMTriseHCl, pH 8.0, 2mMEDTA,1.2% Triton X-100,
20 mg/mL lysozyme) and incubated at 37
C for 30 min. DNA was
extracted from the cell lysates using the DNeasy® tissue kit (QIAGEN,
Mississauga, ON, Canada) according to the manufacturer's
instructions. DNA was eluted in 100 mL of AE buffer (10 mM
TriseHCl, 0.5 mM EDTA, pH 9.0). DNA concentration and quality
were assessed based on the OD260 and the ratio of OD260/OD280,
respectively, using a Nanodrop 2000 spectrophotometer (Thermo
Scientific, Wilmington, DE, USA).
Fish sauce samples (100 mL) were mixed with 1 mL of 1  PBS
and centrifuged at 10,000  g for 10 min. The pellets were resuspended
in 500 mL of 1  PBS, and propiodium monoazide (PMA)
was then added to a final concentration of 100 mM. The mixturewas
incubated in the dark at a shaking speed of 600 rpm for 20 min,
followed by light exposure on ice for 5 min at a distance of 20 cm.
The samples were subsequently washed and centrifuged at
10,000  g for 10 min to collect the pellets. A recombinant E. coli
culture containing a plasmid as an exogenous internal control was
added to the sample pellets at 1.66  104 CFU/sample to monitor
the DNA extraction and subsequent procedures. The DNA was 60
C for 30 s. Fluorescence was read at 60
C using 7500 software
V2.0.1 (Life Technologies). The quantification cycle (Cq) values were
assigned automatically using the system software. The delta Cq
(DCq) between the Cq of the samples and the Cq of IC was used for
normalization.
Fish sauce samples were processed for DNA extraction in
duplicate, and PCR was carried out in duplicate for each DNA
extract. DNA preparations of pure cultures of Virgibacillus sp. SK37
and T. halophilus MS33 were used as positive controls. The PCR
master mix without a DNA templatewas used as a negative control.
IC was included in each PCR reaction to monitor PCR inhibition or
PCR failure to safeguard against false negative results.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัฒนธรรมบริสุทธิ์ของ T. halophilus MS33 และ Virgibacillus sp. SK37เทียบเท่า 10e106 ได้จาก CFU/mL ใน 1.5 มิลลิลิตร (100 มล.)หลอดไมโครที่ 10,000 g 10 นาทีเก็บเซลล์เม็ดที่ถูกแล้วล้างสองครั้ง ด้วยฟอสเฟต 1 มิลลิลิตร 1น้ำเกลือบัฟเฟอร์ (1 PBS) เม็ดถูก resuspended ใน 180 มล.lysis บัฟเฟอร์ (20mMTriseHCl, pH 8.0, Triton X-100, 2mMEDTA,1.2%lysozyme 20 mg/mL) และได้รับการกกที่ 37 C สำหรับ 30 นาทีดีเอ็นเอสกัดจากเซลล์ lysates ใช้ชุดเนื้อเยื่อ DNeasy® (QIAGENมิสซิสซอกา บน แคนาดา) ตามผู้ผลิตคำแนะนำ ดีเอ็นเอเป็น eluted ใน 100 มิลลิลิตรของ AE บัฟเฟอร์ (10 mMTriseHCl, EDTA 0.5 มม. pH 9.0) คุณภาพและความเข้มข้นของดีเอ็นเอถูกประเมินตามอัตราส่วนของ OD260/OD280 และ OD260ตามลำดับ โดยใช้สเปคเครื่อง Nanodrop 2000 (เทอร์โมวิทยาศาสตร์ วิลมิลตัน DE สหรัฐอเมริกา)ตัวอย่างซอสปลา (100 มล) มาผสมกับ 1 มิลลิลิตร 1 PBSและเหวี่ยงที่ 10,000 g 10 นาที เม็ดถูก resuspendedใน 500 มล. 1 PBS และ propiodium monoazide (PMA)แล้วถูกความเข้มข้นสุดท้ายของ 100 mM Mixturewas การรับการกกในมืดด้วยความเร็ว 600 รอบต่อนาที 20 นาที สั่นตาม ด้วยแสงบนน้ำแข็ง 5 นาทีในระยะ 20 ซม.ตัวอย่างต่อมาล้างทำความสะอาด และผลิตภัณฑ์ที่ก. 10,000 10 นาทีเก็บเม็ด Recombinant E. coliวัฒนธรรมที่ประกอบด้วย plasmid เป็นตัวควบคุมภายในภายนอกเพิ่มเม็ดอย่างที่ 1.66 104 CFU/ตัว อย่างการตรวจสอบการสกัดดีเอ็นเอและกระบวนการ ดีเอ็นเอถูก 60 C สำหรับเรืองแสงปา 30 ถูกอ่านที่ 60 C ใช้ซอฟต์แวร์ 7500นซอร์ส V2.0.1 (ชีวิตเทคโนโลยี) มีค่านับรอบ (Cq)กำหนดให้โดยอัตโนมัติโดยใช้ซอฟต์แวร์ระบบ เดลต้า Cq(DCq) ระหว่าง Cq ตัวอย่างและ Cq IC ใช้สำหรับฟื้นฟูตัวอย่างซอสปลาถูกประมวลผลสำหรับการสกัดดีเอ็นเอในซ้ำ และ PCR ถูกดำเนินการซ้ำสำหรับแต่ละดีเอ็นเอสารสกัดจาก การเตรียมดีเอ็นเอบริสุทธิ์วัฒนธรรมของ Virgibacillus sp. SK37และ T. halophilus MS33 ถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงบวก การ PCRส่วนผสมหลักโดยไม่ templatewas ดีเอ็นเอที่ใช้เป็นตัวควบคุมค่าลบIC ถูกรวมอยู่ในแต่ละปฏิกิริยา PCR ในการตรวจสอบการยับยั้ง PCR หรือความล้มเหลวของ PCR เพื่อหาผลลบเท็จ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัฒนธรรมอันบริสุทธิ์ของ T. MS33 halophilus และ Virgibacillus SP SK37
(100 มิลลิลิตร) เทียบเท่ากับ 10e106 CFU / mL ถูกปั่นใน 1.5 มิลลิลิตร
หลอดไมโคร 10,000? กรัมเป็นเวลา 10 นาทีในการเก็บรวบรวมเม็ดเซลล์
ที่ถูกล้างแล้วสองครั้งกับ 1 มิลลิลิตร 1? ฟอสเฟต
Buffered Saline (1? พีบีเอส) เม็ดถูก resuspended ใน 180 มล
บัฟเฟอร์สลาย (20mMTriseHCl ค่า pH 8.0 2mMEDTA 1.2% Triton X-100,
20 mg / ml lysozyme) และบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที ดีเอ็นเอ
ที่สกัดจาก lysates เซลล์โดยใช้ชุดเนื้อเยื่อDNeasy® (QIAGEN,
Mississauga, ON, Canada) ตามที่ผู้ผลิต
คำแนะนำ ดีเอ็นเอชะใน 100 มล AE บัฟเฟอร์ (10 มิลลิ
TriseHCl, 0.5 มิลลิ EDTA, ค่า pH 9.0) ความเข้มข้นของดีเอ็นเอที่มีคุณภาพและ
ได้รับการประเมินบนพื้นฐานของ OD260 และอัตราส่วนของ OD260 / OD280 ที่
ตามลำดับโดยใช้ Nanodrop 2000 spectrophotometer (เทอร์โม
วิทยาศาสตร์ Wilmington, DE, สหรัฐอเมริกา).
ตัวอย่างน้ำปลา (100 มิลลิลิตร) ผสมกับ 1 มิลลิลิตร 1 ? พีบีเอส
และหมุนเหวี่ยงที่ 10,000? กรัมเป็นเวลา 10 นาที เม็ดถูก resuspended
ใน 500 มิลลิลิตร 1? พีบีเอสและ propiodium monoazide (PMA)
ถูกเพิ่มเข้ามาแล้วจะมีความเข้มข้นสุดท้ายของ 100 มิลลิเมตร mixturewas
บ่มในที่มืดที่ความเร็วเขย่า 600 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 20 นาที
ตามด้วยการเปิดรับแสงบนน้ำแข็งเป็นเวลา 5 นาทีในระยะทาง 20 ซม.
กลุ่มตัวอย่างถูกล้างและต่อมาหมุนเหวี่ยงที่
10,000? กรัมเป็นเวลา 10 นาทีในการเก็บรวบรวมเม็ด ตัดต่อพันธุกรรมเชื้อ E. coli
วัฒนธรรมที่มีพลาสมิดเป็นระบบการควบคุมภายในภายนอกถูก
เพิ่มเข้าไปในเม็ดตัวอย่างที่ 1.66? 104 CFU / ตัวอย่างในการตรวจสอบ
การสกัดดีเอ็นเอและขั้นตอนต่อมา ดีเอ็นเอเป็น 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที การเรืองแสงได้อ่านที่ 60 องศาเซลเซียสโดยใช้ซอฟแวร์ 7500
v2.0.1 (ไลฟ์เทคโนโลยี) วงจรปริมาณ (Cq) ค่าถูก
กำหนดโดยอัตโนมัติโดยใช้ซอฟต์แวร์ระบบ เดลต้า Cq
(ก๊าซธรรมชาติ) ระหว่าง Cq ของกลุ่มตัวอย่างและ Cq ของ IC ที่ใช้สำหรับ
การฟื้นฟู.
ตัวอย่างน้ำปลาที่ถูกประมวลผลในการสกัดดีเอ็นเอใน
ที่ซ้ำกันและ PCR ได้ดำเนินการในที่ซ้ำกันสำหรับแต่ละดีเอ็นเอ
สารสกัดจาก การเตรียมดีเอ็นเอของเชื้อบริสุทธิ์ของ Virgibacillus SP SK37
ตันและ halophilus MS33 ถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมในเชิงบวก PCR
ผสมต้นแบบโดยไม่ต้องดีเอ็นเอ templatewas ใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบ.
IC ถูกรวมอยู่ในแต่ละปฏิกิริยา PCR ในการตรวจสอบการยับยั้ง PCR หรือ
ความล้มเหลวของ PCR เพื่อป้องกันผลลบเท็จ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เชื้อบริสุทธิ์ของ halophilus ms33 sk37 virgibacillus sp . และ( 100 มิลลิลิตร ) เท่ากับ 10e106 cfu / ml มีไฟฟ้าใน 1.5-mlหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ที่ 10 , 000 G 10 นาทีเพื่อเก็บเซลล์เม็ดที่ถูก แล้วล้าง 2 ครั้ง 1 มิลลิลิตร 1 ฟอสเฟตในน้ำเกลือ ( 1 ช่อง ) เม็ดเป็น resuspended 180 มิลลิลิตรการสลายบัฟเฟอร์ ( 20mmtrisehcl pH 8.0 , 2mmedta 1.2 % Triton X-100 ,20 มก. / มล. และไลโซไซม์ ) บ่มที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที ดีเอ็นเอคือสกัดจากเซลล์ lysates ใช้ dneasy ®เนื้อเยื่อ ( เพิ่มชุด ,Mississauga , แคนาดา ) ตามการของผู้ผลิตคําแนะนํา ตัวอย่างดีเอ็นเอ ใน 100 มิลลิลิตรของ เอ บัฟเฟอร์ ( 10 มม.trisehcl 0.5 mM EDTA pH 9.0 ) ความเข้มข้นของดีเอ็นเอ และคุณภาพมีการประเมินตาม od260 และอัตราส่วนของ od280 od260 / ,ตามลำดับ การใช้ nanodrop 2000 Spectrophotometer ( เทอร์โมวิทยาศาสตร์ , Wilmington , DE , USA )ตัวอย่างน้ำปลา ( 100 มิลลิลิตรผสมกับ 1 มิลลิลิตร 1 ช่องไฟฟ้า 10 , 000 กรัมต่อ 10 นาที ( resuspended เม็ดกลม500 มิลลิลิตร 1 ช่อง และ propiodium monoazide ( PMA )แล้วเพิ่มความเข้มข้นสุดท้ายของ 100 มม. การ mixturewasเลี้ยงในที่มืดที่เขย่าที่ความเร็ว 600 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 20 นาทีตามด้วยการเปิดรับแสงในน้ำแข็งเป็นเวลา 5 นาที ระยะห่าง 20 ซม.ตัวอย่างต่อมาล้าง และระดับที่10 , 000 กรัมต่อ 10 นาทีเพื่อเก็บเม็ด เป็นเซลล์ E . coliวัฒนธรรมที่มีพลาสมิดเป็นผู้ตรวจสอบภายในจากภายนอกคือเพิ่มจำนวนเม็ดที่ 1.66 104 CFU / ตัวอย่างเพื่อตรวจสอบการสกัดดีเอ็นเอและขั้นตอนที่ตามมา ดีเอ็นเอ 60 C เป็นเวลา 30 วินาที การได้อ่านที่ 60 C ใช้ 7 , 500 ซอฟต์แวร์v2.0.1 ( เทคโนโลยีกับชีวิต ) วงจรปริมาณ ( CQ ) ค่าคือที่ได้รับมอบหมายโดยอัตโนมัติโดยใช้ซอฟต์แวร์ของระบบ เดลต้าซีคิว( dcq ) ระหว่าง CQ ของกลุ่มตัวอย่างและ CQ ของ IC ที่ใช้สำหรับการฟื้นฟู . "ตัวอย่างปลาถูกประมวลผลสำหรับการสกัดดีเอ็นเอในตรวจซ้ำ และได้ดำเนินการในแต่ละซ้ำสำหรับดีเอ็นเอสารสกัด การเตรียมดีเอ็นเอของเชื้อบริสุทธิ์ของ sk37 virgibacillus sp .และ ต. halophilus ms33 ถูกใช้เป็นตัวควบคุมบวก pcrต้นแบบผสม ไม่มีดีเอ็นเอ templatewas ใช้เป็นตัวควบคุมลบIC อยู่ในปฏิกิริยา PCR PCR แต่ละเพื่อตรวจสอบหรือยับยั้งจากความล้มเหลวที่จะปกป้องผลเชิงลบเท็จ