Transient expression assay SPL10 ef

Transient expression assay
SPL10 effector constructs were prepared by fusing various
fragments of SPL10 or mSPL10 amplifi ed by PCR to the DNAbinding
domain of yeast transcription factor GAL4 (GAL4DB),
in-frame. The mSPL10 gene, in which the target site of
miR156/157 was mutated, was generated by site-directed
mutagenesis with the appropriate primers (Supplementary
Table S2). The fi refl y luciferase reporter gene under the
control of a promoter containing fi ve repeats of the GAL4
binding site was used as a reporter ( Ohta et al. 2000 ).
Effector, reporter and reference ( 35S:RLUC ; Ohta et al. 2000 )
plasmids were co-bombarded into juvenile (third and
fourth leaves) or adult (seventh to ninth leaves) rosette
leaves of Arabidopsis, and luciferase activity was measured
as described previously ( Fujimoto et al. 2000 ).
Chimeric repressor-expressing plants
and overexpressing plants
For chimeric repressor and overexpression constructs, the
coding sequences of SPL10 , SPL11 and SPL2 , without and
with stop codons, were amplifi ed with appropriate primers.
Each fragment was cloned into p35SSRDXG and p35SSG
entry vectors, respectively ( Mitsuda et al. 2006 ). For
ProSPL10:SPL10SRDX and ProSPL11:SPL11SRDX constructs,
the promoter regions used in the constructs for the GUS
assay and coding regions without stop codons were cloned
into pSRDX-NOS entry vector, which is a modifi ed vector of
p35SSRDXG. Mutations in the miR156 target site of
SPL10 , SPL11 and SPL2 were introduced by site-directed
mutagenesis with the appropriate primers (Supplementary
Table S2). To produce the 35S:miR157b construct, a genomic
fragment was amplifi ed with the appropriate primers
(Supplementary Table S2) and introduced into the p35SSG
entry vector. Each transgene was transferred to pBCKH or
pBCKK plant expression vectors ( Mitsuda et al. 2006 ).
Arabidopsis was transformed using the fl oral dip method
( Clough and Bent 1998 ).
Measurement of developmental transition
Abaxial trichomes on rosette leaves and sepal trichomes on
fl owers were scored with a stereomicroscope. Time to fl oral
transition was determined by counting both the day and the
number of total leaves at bolting. The number of adaxial
trichomes was counted in the second cauline leaves of the
second lateral infl orescence of plants that had two cauline
leaves on both the main and second lateral infl orescences.
The leaf index was calculated by dividing the leaf length by
the leaf width.
Supplementary data
Supplementary data are available at PCP online.
Funding
Core Research for Evolutional Science and Technology
(CREST); Japan Science and Technology Agency (JST).
Acknowledgments
The authors thank the Institut National de la Recherche
Agronomique and the Arabidopsis Biological Resource
Center for providing seeds of T-DNA insertion lines. We
also thank Y. Kimura, N. Ujiie, N. Kawanami, K. Yamaguchi,
A. Kuwazawa and Y. Takiguchi for their skilled technical
assistance.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วิเคราะห์นิพจน์แบบฉับพลัน มีเตรียมโครงสร้าง effector SPL10 ต่าง ๆ โดยชิ้นส่วนของ amplifi SPL10 หรือ mSPL10 ed โดย PCR ไป DNAbindingโดเมนของยีสต์ transcription ปัจจัย GAL4 (GAL4DB),ในกรอบ ยีน mSPL10 ที่ไซต์เป้าหมายของmiR156/157 ได้กลาย สร้าง โดยเว็บไซต์โดยตรงmutagenesis ด้วยไพรเมอร์ที่เหมาะสม (Supplementaryตาราง S2) แบบไร้สาย refl y luciferase โปรแกรมรายงานยีนภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ที่ประกอบด้วย ve ไว้ซ้ำของ GAL4รวมไซต์ถูกใช้เป็นผู้สื่อข่าว (Ohta et al. 2000)Effector โปรแกรมรายงาน และอ้างอิง (35S:RLUC Ohta et al. 2000)plasmids ได้ร่วมระดมยิงเข้าไปในคดีเด็กและเยาวชน (ที่สาม และสี่ ใบ) หรือผู้ใหญ่ (เจ็ดถึงเก้าใบ) rosetteใบของ Arabidopsis กิจกรรม luciferase เป็นวัดตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (ฟุจิโมะโตะ et al. 2000) พืชแสดง repressor chimericและ overexpressing พืช Chimeric repressor และ overexpression โครงสร้าง การรหัสลำดับ SPL10, SPL11 และ SPL2 ไม่มี และมีหยุด codons ถูก amplifi ed ด้วยไพรเมอร์ที่เหมาะสมแต่ละส่วนถูกโคลนเป็น p35SSRDXG และ p35SSGรายการเวกเตอร์ ตามลำดับ (Mitsuda et al. 2006) สำหรับProSPL10:SPL10SRDX และ ProSPL11:SPL11SRDX โครงสร้างภูมิภาคโปรโมเตอร์ที่ใช้ในโครงสร้าง GUSวิเคราะห์และกำหนดขอบเขตโดยไม่หยุด codons ได้โคลนเป็นเวกเตอร์ในรายการหมายเลข pSRDX ซึ่งเป็นการ modifi ed เวกเตอร์ของp35SSRDXG การกลายพันธุ์ในไซต์เป้าหมาย miR156 ของSPL10, SPL11 และ SPL2 ได้แนะนำตามเว็บไซต์โดยตรงmutagenesis ด้วยไพรเมอร์ที่เหมาะสม (Supplementaryตาราง S2) การผลิต 35S:miR157b สร้าง การ genomicส่วน amplifi ed ด้วยไพรเมอร์ที่เหมาะสม(เสริมตาราง S2) และนำเข้าสู่การ p35SSGรายการเวกเตอร์ แต่ละ transgene ถูกโอนย้ายไปที่ pBCKH หรือpBCKK พืชนิพจน์เวกเตอร์ (Mitsuda et al. 2006)Arabidopsis ถูกแปลงโดยใช้วิธีจุ่มปาก fl(คลัฟและโค้ง 1998) การวัดการเปลี่ยนแปลงพัฒนา Trichomes abaxial rosette ใบและ trichomes sepal บนfl owers ได้คะแนน ด้วยการ stereomicroscope เวลาปาก flเปลี่ยนถูกกำหนด โดยการนับวันทั้งสองและผลรวมจำนวนใบที่ bolting หมายเลข adaxialtrichomes ถูกนับในใบ cauline ที่สองของการสองด้านข้าง infl orescence ของพืชที่มีสอง caulineใบบน orescences ทั้งสองหลัก และสอง infl ด้านข้างดัชนีใบไม้ถูกคำนวณ โดยการหารความยาวของใบโดยความกว้างของใบ ข้อมูลเสริม ข้อมูลเพิ่มเติมได้มาออนไลน์ จัดหาเงินทุน วิจัยหลัก Evolutional วิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี(หงอน); ญี่ปุ่นวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยีสำนักงาน (JST) ตอบ ผู้เขียนขอขอบคุณสถาบันชาติ de la RechercheAgronomique และทรัพยากรชีวภาพ Arabidopsisศูนย์เมล็ดพันธุ์ของดีเอ็นเอทีแทรกบรรทัดให้ เราขอบคุณ Y. คิมุระโย N. Ujiie, N. Kawanami คุณ YamaguchiA. Kuwazawa และ Takiguchi Y. สำหรับเทคนิคมีทักษะของพวกเขาความช่วยเหลือ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การวิเคราะห์การแสดงออกชั่วคราวโครงสร้าง effector SPL10 ถูกจัดทำขึ้นโดยการหลอมรวมต่างๆชิ้นส่วนของSPL10 หรือ mSPL10 amplifi เอ็ดโดยวิธี PCR กับ DNAbinding โดเมนของการถอดความปัจจัยยีสต์ GAL4 (GAL4DB) ในกรอบ ยีน mSPL10 ซึ่งในเว็บไซต์เป้าหมายของmiR156 / 157 ได้กลายพันธุ์ที่ถูกสร้างขึ้นโดยเว็บไซต์กำกับฉับกับไพรเมอร์ที่เหมาะสม(เสริมตาราง S2) สาย refl y ที่ luciferase ยีนนักข่าวภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ที่มีไฟได้ซ้ำของGAL4 เว็บไซต์ที่มีผลผูกพันใช้เป็นนักข่าว (Ohta et al, 2000).. Effector นักข่าวและการอ้างอิง (35S. RLUC; Ohta et al, 2000 ) พลาสมิดที่ถูกร่วมจู่โจมเข้าไปในเด็กและเยาวชน (ที่สามและสี่ใบ) หรือผู้ใหญ่ (เจ็ดใบที่เก้า) ดอกกุหลาบใบของArabidopsis และกิจกรรม luciferase วัดตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้(Fujimoto et al. 2000). ลูกผสมอดกลั้น-แสดงพืชและ overexpressing พืชสำหรับอดกลั้นลูกผสมและโครงสร้างแสดงออกที่ลำดับการเข้ารหัสของSPL10, SPL11 และ SPL2 โดยไม่ต้องและมีcodons หยุดเป็นเอ็ด amplifi กับไพรเมอร์ที่เหมาะสม. แต่ละส่วนเป็นโคลนเข้าไปใน p35SSRDXG และ p35SSG เวกเตอร์รายการตามลำดับ (Mitsuda et al. 2006) . สำหรับProSPL10: SPL10SRDX และ ProSPL11: สร้าง SPL11SRDX, ภูมิภาคก่อการที่ใช้ในการสร้างสำหรับ GUS ทดสอบและการเข้ารหัสภูมิภาคโดยไม่ต้องหยุด codons ถูกโคลนเข้าไปในรายการpSRDX-NOS เวกเตอร์ซึ่งเป็นเวกเตอร์เอ็ด modifi ของp35SSRDXG การกลายพันธุ์ในเว็บไซต์เป้าหมายของ miR156 SPL10, SPL11 SPL2 และได้รับการแนะนำโดยเว็บไซต์กำกับฉับกับไพรเมอร์ที่เหมาะสม(เสริมตาราง S2) เพื่อผลิต 35S นี้: miR157b สร้างเป็นจีโนมส่วนเป็นเอ็ดamplifi กับไพรเมอร์ที่เหมาะสม(ตารางที่เสริม S2) และนำเข้าสู่ p35SSG รายการเวกเตอร์ ยีนแต่ละคนถูกย้ายไป pBCKH หรือpBCKK เวกเตอร์แสดงออกพืช (Mitsuda et al. 2006). Arabidopsis ถูกเปลี่ยนโดยใช้วิธีการแช่ในช่องปากชั้น(คลอฟและก้ม 1998). การวัดของการเปลี่ยนแปลงการพัฒนาAbaxial trichomes บนใบดอกกุหลาบและ trichomes กลีบเลี้ยงบนOwers ชั้น ถูกยิงด้วยสเตอริโอ ใช้เวลาในการในช่องปากชั้นการเปลี่ยนแปลงที่ถูกกำหนดโดยการนับทั้งวันและจำนวนใบรวมbolting จำนวน adaxial trichomes ถูกนับรวมอยู่ในใบ cauline ที่สองของorescence infl ด้านข้างที่สองของพืชที่มีสอง cauline ใบทั้ง orescences infl หลักและด้านข้างที่สอง. ดัชนีใบที่ได้รับการคำนวณโดยการหารความยาวของใบโดยความกว้างของใบข้อมูลเพิ่มเติมข้อมูลเพิ่มเติมสามารถดูได้ที่ PCP ออนไลน์. เงินทุนวิจัยหลักสำหรับ evolutional วิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี (CREST); ญี่ปุ่นวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี (JST). กิตติกรรมประกาศผู้เขียนขอขอบคุณสถาบันแห่งชาติ de la Recherche Agronomique และ Arabidopsis ทรัพยากรชีวภาพศูนย์สำหรับการให้บริการของสายเมล็ดแทรกT-DNA เรายังขอขอบคุณวายคิมูระเอ็น Ujiie เอ็น Kawanami พยามากูชิก Kuwazawa และวาย Takiguchi สำหรับเทคนิคของพวกเขาที่มีทักษะความช่วยเหลือ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ชั่วคราว (
spl10 การแสดงออก ( โครงสร้างเตรียมโดยรวมของชิ้นส่วนต่าง ๆ
spl10 หรือ mspl10 amplifi เอ็ดโดยวิธี PCR เพื่อ dnabinding
โดเมนของยีสต์ถอดความปัจจัย gal4 ( gal4db ) ,
ในกรอบ การ mspl10 ยีน ซึ่งเป้าหมายของเว็บไซต์
mir156 / 157 กลายพันธุ์ , ถูกสร้างขึ้นโดยเว็บไซต์ของไพรเมอร์ที่เหมาะสมกับการนำ
( เสริม
ตาราง S1 )fi refl Y ลูซิเฟอเรส นักข่าวจีนภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ที่มี
fi ได้ซ้ำของ gal4
ผูกพันเว็บไซต์ถูกใช้เป็นนักข่าว ( โอห์ตา et al . 2000 )
( นักข่าวและอ้างอิง ( 35s : rluc ; โอห์ตา et al . 2000 )
) เป็น Co ระดมยิงเป็นเยาวชน ( 3
ใบที่สี่ ) หรือผู้ใหญ่ ( 7 ใบที่เก้า Rosette ใบของ Arabidopsis )
,และกิจกรรมเอนไซม์ลูซิเฟอเรสถูกวัด
ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( ฟูจิโมโตะ et al . 2000 ) .
ที่ผู้ควบคุมการแสดงพืชและพืช

overexpressing สำหรับผู้ควบคุมและโครงสร้างที่ overexpression ,
รหัสลำดับของ spl10 spl11 spl2 , และ , โดยไม่ต้องหยุดและ
ras , amplifi เอ็ดด้วย primers ที่เหมาะสม .
แต่ละส่วนถูกโคลนและเป็น p35ssrdxg p35ssg
เวกเตอร์รายการตามลำดับ ( mitsuda et al . 2006 ) สำหรับ
prospl10 : spl10srdx prospl11 : spl11srdx และโครงสร้าง
โปรโมเตอร์ภูมิภาคที่ใช้ในโครงสร้างสำหรับการทดสอบกัส
และรหัสภูมิภาคโดยไม่หยุดซิสถูกโคลน
เป็น psrdx ไม่มีรายการเวกเตอร์ซึ่งเป็นโมดิฟาย ed เวกเตอร์ของ
p35ssrdxg . การกลายพันธุ์ใน mir156 เป้าหมายเว็บไซต์ของ
spl10 spl11 spl2 , และถูกแนะนำโดยกำกับ
เว็บไซต์ฉับกับไพรเมอร์ที่เหมาะสม ( เสริม
ตาราง S1 ) ผลิต 35s : mir157b สร้างชิ้นส่วนจีโนม
คือ amplifi เอ็ดด้วย primers ที่เหมาะสม
( เสริมตาราง S1 ) และนำเข้าสู่ p35ssg
รายการเวกเตอร์ แต่ละยีนก็ถูกย้ายไป pbckh หรือ
pbckk พืชแสดงออกเวกเตอร์ ( mitsuda et al . 2006 ) .
Arabidopsis ถูกเปลี่ยนใช้วิธี
ชั้นปากจุ่ม( คลัฟและงอ 1998 ) .
การวัดพัฒนาการเปลี่ยนแปลง
ซื้อสิทธิ์ขายเสียงไตรโคมบนใบและดอกกุหลาบกาไตรโคมบน
FL ทาวเวอร์ถูกยิงด้วย stereomicroscope . เวลาในการเปลี่ยนแปลงในช่องปาก
ถูกกําหนดโดยการนับวันและ
จำนวนใบทั้งหมดที่ bolting จํานวนแก่
ไตรโคมถูกนับใน cauline สองใบของ