Soil samples (0.5 g wet weight) for

Soil samples (0.5 g wet weight) for each site were used for DNA ex- traction performed with the FastDNA® spin kit for soil (Bio 101,Vista, CA) using the FastPrep homogenizer (Qbiogene, Irvine, CA; 2× 20 s at speed setting 4.0).
To amplify bacterium from soils, the bacterium-specific primer pair 341f+GC (Ferris et al., 1996)/907r (Casamayor et al., 2000; Teske et al., 1996) was used to obtain DNA fragments 566 bp in length. All PCR was performed with a PTC-200 thermal cycler (MJ Research, Waltham MA). The PCR protocol initial denaturation was at 94 °C for 5 min; 20 touchdown cycles of denaturation (at 94 °C for 1 min), an- nealing (at 65–55 °C for 1 min, decreasing 0.5 °C each cycle) and exten- sion (at 72 °C for 3 min); 10 standard cycles of denaturation (at 94 °C for 1 min), annealing (at 55 °C for 1 min) and extension (at 72 °C for 3 min), and a final extension at 72 °C for 5 min. The reaction mixtures (50 μL volume) contained 1× PCR reaction buffer (TaKaRa, Japan), 10 ng DNA template, 20 pmol/L of forward and reverse primers, 200 μmol/L dNTP mix, and 2.5 U of Ex Taq DNA Polymerase (TaKaRa, Japan). The PCR products were then verified by running a 1.2% (w/v) agarose gel electrophoresis.
DGGE was performed using a DCode Universal Mutation Detection System (Bio-Rad, Richmond, CA). A 6% acrylamide (37.5:1 acrylamide– bisacrylamide) gel was formed between 30% and 60% denaturant, with 100% denaturant defined as 7 M urea and 40% (v/v) formamide. The gelwasrunat180Vfor6hataconstanttemperatureof60°Cin7L 1× TAE buffer, then stained with Genefinder dye (Bio-V, Xiamen, China) for 30 min. The image was analyzed by the software package Quantity One 2.1 (Bio-Rad). The DGGE bands of interest were cut from the gel, and soaked in 50 μL TE buffer (10 mM Tris–Cl, pH 7.5, 1 mM EDTA) at 4 °C overnight. One microliter was used for reamplification and verification by DGGE three times to ensure a single band at the same location. A total of predominant 5 DGGE bands were sequenced successfully. The PCR–DGGE banding pattern was analyzed by Quantity One image analysis software (Bio-Rad). The Shannon diversity index was calculated to examine the diversity of the bacterium community in different samples, and a cluster dendrogram was constructed using UPGMA. The correlation relationship between the bacterium community of different samples, which is represented by the intensity (peak area) of the bands in each lane in the DGGE profile, and the environmental factors were analyzed by CCA using the CANOCO software. The 16S rDNA gene sequences of excised DGGE bands were used to search the GenBank da- tabase using the program BLAST.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ตัวอย่างดิน (0.5 กรัมน้ำหนักเปียก) สำหรับแต่ละไซต์มีใช้ในอดีตดีเอ็นเอดำเนินการกับชุดหมุน FastDNA ®สำหรับดิน (ไบโอ 101, Vista, CA) ใช้ homogenizer FastPrep (Qbiogene เออร์วิน CA, s × 20 2 ที่ความเร็ว 4.0 การตั้งค่า) ลากขยายแบคทีเรียจากดินเนื้อปูน พื้นแบคทีเรียเฉพาะคู่ 341f + GC (Ferris et al., 1996) / 907r (Casamayor et al., 2000 Teske et al., 1996) ถูกใช้เพื่อรับ bp 566 ชิ้นส่วนดีเอ็นเอยาว ทำ PCR ทั้งหมด มีเป็น PTC 200 ร้อน cycler (วิจัย MJ, Waltham MA) Denaturation เริ่มต้นโพรโทคอลการ PCR ได้ที่ 94 ° C สำหรับ 5 นาที 20 เหรียญวงจรการ denaturation (ที่ 94 ° C สำหรับ 1 นาที), เป็น nealing (ที่ 65-55 ° C สำหรับ 1 นาที ลด 0.5 ° C แต่ละรอบ) และ exten-น (ที่ 72 ° C สำหรับ 3 นาที); วงจรมาตรฐาน 10 denaturation (ที่ 94 ° C สำหรับ 1 นาที), การอบเหนียว (ที่ 55 ° C สำหรับ 1 นาที) และนามสกุล (ที่ 72 ° C สำหรับ 3 นาที), และส่วนขยายเป็นขั้นสุดท้ายที่ 72 ° C สำหรับ 5 นาที น้ำยาผสมปฏิกิริยา (50 μL ปริมาตร) อยู่ 1 × PCR ปฏิกิริยาบัฟเฟอร์ (TaKaRa ญี่ปุ่น), 10 ng ดีเอ็นเอแม่แบบ 20 pmol/L ของไพรเมอร์ไปข้างหน้า และย้อนกลับ 200 μmol L dNTP ผสม และ 2.5 U ของอดีต Taq DNA พอลิเมอเรส (TaKaRa ญี่ปุ่น) มีการตรวจสอบผลิตภัณฑ์ PCR ได้แล้ว โดยใช้ electrophoresis เป็นเจล agarose 1.2% (w/v)DGGE ที่ดำเนินการโดยใช้ DCode สากลกลายพันธุ์ตรวจสอบระบบ (Bio Rad ริชมอนด์ CA) เจล 6% อะคริลาไมด์ (37.5:1 อะคริลาไมด์ – bisacrylamide) ก่อตั้งขึ้นระหว่าง 30% และ 60% denaturant, 100% denaturant กำหนดเป็น 7 M ยูเรียและ formamide 40% (v/v) Gelwasrunat180Vfor6hataconstanttemperatureof60 ° Cin7L 1 ×เต้บัฟเฟอร์ แล้วสีย้อม Genefinder (ไบโอ-V มิน จีน) สีสำหรับ 30 นาที รูปถูกวิเคราะห์ โดยแพคเกจซอฟต์แวร์ปริมาณหนึ่ง 2.1 (ไบ-Rad) วง DGGE น่าสนใจถูกตัดจากเจ และนำไปแช่ใน 50 μL ติบัฟเฟอร์ (10 mM ตรี – Cl, pH 7.5, 1 mM EDTA) ที่ 4 ° C ค้างคืน ไมโครลิตรหนึ่งใช้สำหรับ reamplification และการตรวจสอบ โดย DGGE สามครั้งให้วงเดียวที่ตำแหน่งเดียวกัน รวมกัน 5 DGGE วงถูกเรียงลำดับเรียบร้อยแล้ว รูปแบบ banding PCR – DGGE ได้วิเคราะห์ปริมาณหนึ่งรูปวิเคราะห์ซอฟต์แวร์ (ไบ-Rad) มีคำนวณดัชนีความหลากหลายแชนนอนเพื่อตรวจสอบความหลากหลายของแบคทีเรียในตัวอย่างที่แตกต่างกัน และ dendrogram คลัสเตอร์ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ UPGMA มีวิเคราะห์ความสัมพันธ์ของความสัมพันธ์ระหว่างชุมชนแบคทีเรียอย่างอื่น ซึ่งจะถูกแสดง ด้วยความรุนแรง (พื้นที่สูงสุด) ของวงในแต่ละเลนในโพ DGGE ปัจจัยด้านสิ่งแวดล้อม โดยใช้ซอฟต์แวร์ CANOCO CCA ลำดับยีน rDNA 16S ของวง DGGE excised ถูกใช้เพื่อค้นหาดา-tabase GenBank ที่ใช้โปรแกรมระเบิด

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ตัวอย่างดิน (0.5 กรัมน้ำหนักเปียก) สำหรับแต่ละเว็บไซต์ถูกนำมาใช้สำหรับการลากอดีตดีเอ็นเอดำเนินการกับชุดปั่นFastDNA®ดิน (ไบโอ 101, Vista, CA) โดยใช้ FastPrep โฮโมจีไน (Qbiogene, Irvine, CA; 2 × 20 S . ที่ความเร็ว 4.0 การตั้งค่า)
เพื่อขยายแบคทีเรียจากดินไพรแบคทีเรียเฉพาะคู่ 341f + GC (ชิงช้าสวรรค์, et al, 1996) / 907r (Casamayor et al, 2000;... Teske, et al, 1996) ถูกนำมาใช้เพื่อให้ได้ ดีเอ็นเอชิ้นส่วน 566 bp ในความยาว PCR ทั้งหมดได้ดำเนินการกับ Cycler ความร้อน PTC-200 (MJ วิจัย Waltham MA) โปรโตคอล PCR denaturation เริ่มต้นอยู่ที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที; ดาว์น 20 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติ (ที่ 94 ° C เป็นเวลา 1 นาที) An- nealing (ที่ 65-55 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาทีลดลง 0.5 ° C แต่ละรอบ) และหัวเรื่องไซออน (ที่ 72 ° C เป็นเวลา 3 นาที); 10 รอบมาตรฐานของการสูญเสียสภาพธรรมชาติ (ที่ 94 ° C เป็นเวลา 1 นาที), การอบ (ที่ 55 ° C เป็นเวลา 1 นาที) และการขยาย (ที่ 72 ° C เป็นเวลา 3 นาที) และขยายสุดท้ายที่ 72 ° C เป็นเวลา 5 นาที ผสมปฏิกิริยา (50 ปริมาณไมโครลิตร) มี 1 × PCR บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา (TaKaRa, ญี่ปุ่น), 10 เส้นทางแม่แบบดีเอ็นเอ, 20 pmol / ลิตรไปข้างหน้าและย้อนกลับไพร, 200 ไมโครโมล / ลิตรผสม dNTP และ 2.5 U ของ Ex Taq DNA Polymerase (TaKaRa, ญี่ปุ่น) ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ได้รับการตรวจสอบแล้วโดยใช้ 1.2% (w / v) เจลอิเล็ก agarose.
DGGE ได้รับการดำเนินการโดยใช้ DCode สากลระบบการตรวจสอบการกลายพันธุ์ (Bio-Rad ริชมอนด์, CA) ริลาไมด์ 6% (37.5: 1 acrylamide- bisacrylamide) เจลที่ถูกสร้างขึ้นระหว่าง 30% และ 60% denaturant กับ denaturant 100% กำหนดให้เป็น 7 M ยูเรียและ 40% (v / v) Formamide gelwasrunat180Vfor6hataconstanttemperatureof60 ° Cin7L 1 ×บัฟเฟอร์ TAE, ย้อมสีแล้วด้วยสีย้อม Genefinder (Bio-V, เซียะเหมิ, จีน) เป็นเวลา 30 นาที ภาพที่ได้รับการวิเคราะห์โดยแพคเกจซอฟต์แวร์จำนวนหนึ่ง 2.1 (Bio-Rad) วง DGGE ที่น่าสนใจถูกตัดออกจากเจลและแช่ใน 50 บัฟเฟอร์ไมโครลิตร TE (10 mM Tris-Cl, พีเอช 7.5, EDTA 1 มิลลิเมตร) 4 ° C ในชั่วข้ามคืน หนึ่งไมโครลิตรที่ใช้สำหรับ reamplification และการตรวจสอบโดย DGGE สามครั้งเพื่อให้แน่ใจว่าเป็นวงเดียวในสถานที่เดียวกัน รวมของเด่น 5 วง DGGE มีลำดับขั้นตอนที่ประสบความสำเร็จ PCR-DGGE รูปแบบแถบได้รับการวิเคราะห์โดยจำนวนหนึ่งซอฟต์แวร์การวิเคราะห์ภาพ (Bio-Rad) ดัชนีความหลากหลายแชนนอนที่คำนวณได้ในการตรวจสอบความหลากหลายของชุมชนแบคทีเรียในตัวอย่างที่แตกต่างกันและ dendrogram คลัสเตอร์ที่ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ UPGMA ความสัมพันธ์ของความสัมพันธ์ระหว่างชุมชนแบคทีเรียของกลุ่มตัวอย่างแตกต่างกันซึ่งเป็นตัวแทนจากความเข้ม (พื้นที่ยอด) ของวงในแต่ละช่องทางในรายละเอียด DGGE และปัจจัยด้านสิ่งแวดล้อมที่ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ CCA CANOCO 16S rDNA ลำดับยีนของวง DGGE พอถูกนำมาใช้ในการค้นหา GenBank DA- tabase ใช้โปรแกรม BLAST