2.3. Development of HPLC methodMeth

2.3. Development of HPLC method
Method development experiments were conducted using a
Waters HPLC system equipped with a Model 2695 Separations
Module coupled to a Waters model 996 photodiode array detector
(PAD) (Waters Corp., Milford, Massachusetts, USA). Chromatography
was achieved using a 4.6  100 mm Kinetex 2.6 lm C-18 column
(Phenomenex Inc., Torrance, California, USA) equipped with a
KrudKatcher Ultra in-line column filter. Instrument control and
data acquisition were accomplished using Masslynx (Version
4.0). Analyses were conducted at constant temperature of 30 C
using a flow rate 1.8 mL/min and a sample injection volume of
10 lL. Detector wavelengths of 270 nm for gallic acid, 254 nm for
ellagic acid and 378 nm for punicalagin A and B were used. Parameters
recommend by the column manufacturer for the analysis of
phenolics in green tea (Phenomenex HPLC Application ID No.
18549) were used as a starting point and subsequently modified
through a series of experiments directed towards optimising the
separation of the targeted compounds while minimising the overall
sample analysis time. Modifications to the gradient conditions
and mobile phase were explored and a finalised method developed.
Performance of the finalised method also was confirmed
through a series of experiments evaluating the LOD, LOQ, quantitative
concentration range and quantitative equation obtained for
each of the polyphenol standards. For LOD and LOQ experiments,
limits were determined empirically using standards with concentrations
as low as 0.03, 0.03 and 0.19 mg/L for gallic and ellagic
acids, and punicalagin A and B, respectively. A pomegranate marc
extract was used for evaluating within day and day-to-day variability
and was also used for spike recovery experiments.
For the finalised method, a biphasic mobile phase consisting of
0.1% (v/v) H3PO4 in HPLC water (A) and 0.1% (v/v) H3PO4 in acetonitrile
(B) was utilised. Prior to use, mobile phase A was filtered
through a 0.45 lm HA membrane filter and B was filtered through
a 0.45 lmZapCap-CR Bottle-Top filter (Schleicher & Schuell, Keene,
New Hampshire, USA). The elution conditions were as follows: isocratic
elution 1% B, 0–1.5 min; linear gradient from 1% B to 4.5% B,

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3 การพัฒนาวิธี HPLCวิธีการพัฒนาทดลองได้ดำเนินการโดยใช้การระบบ HPLC น้ำเพียบพร้อมไป ด้วยประโยชน์รุ่น 2695โมดูลที่ควบคู่ไปกับน้ำรุ่น 996 photodiode เรย์จับ(แผ่น) (น้ำ Corp. ลฟอร์ด รัฐแมสซาชูเซตส์ สหรัฐอเมริกา) Chromatographyสำเร็จโดยใช้คอลัมน์ lm C 18 100 มม. Kinetex 2.6 4.6(Phenomenex Inc. รันซ์ แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา) พร้อมกับการตัวกรองข้อมูลในรายการคอลัมน์อัลตร้า KrudKatcher เครื่องควบคุม และซื้อข้อมูลก็ทำได้โดยใช้ Masslynx (รุ่น4.0) วิเคราะห์ได้ดำเนินการที่อุณหภูมิคง 30 Cขั้นตอนการใช้อัตรา 1.8 mL/min และปริมาตรการฉีดตัวอย่างของ10 จะ เครื่องตรวจจับความยาวคลื่นของ 270 nm สำหรับกรด gallic, 254 nm สำหรับกรด ellagic และ 378 nm สำหรับ punicalagin A และ B ใช้ พารามิเตอร์แนะนำ โดยผู้ผลิตคอลัมน์สำหรับการวิเคราะห์ของphenolics ในชาเขียว (Phenomenex HPLC สมัคร ID หมายเลข18549) ถูกใช้เป็นจุดเริ่มต้น และปรับเปลี่ยนในเวลาต่อมาผ่านชุดของการทดลองโดยตรงต่อ optimisingแยกสารเป้าหมายในขณะที่ minimising โดยรวมเวลาวิเคราะห์ตัวอย่าง ปรับเปลี่ยนเงื่อนไขการไล่ระดับสีและระยะเคลื่อนที่สำรวจ และพัฒนาวิธีการ finalisedประสิทธิภาพของวิธี finalised ยังได้รับการยืนยันผ่านชุดของการทดลองประเมินลอด LOQ เชิงปริมาณช่วงความเข้มข้นและสมการเชิงปริมาณได้แต่ละมาตรฐาน polyphenol สำหรับการทดลองลอดและ LOQมีกำหนดวงเงิน empirically ด้วยมาตรฐานความเข้มข้นต่ำสุด 0.03, 0.03 และ 0.19 mg/L สำหรับ gallic และ ellagicกรด และ punicalagin A และ B ตามลำดับ มาร์คทับทิมสารสกัดใช้ในการประเมินภายในวันและประจำวันสำหรับความผันผวนและยังใช้สำหรับการทดลองเก็บชั่วคราวกู้คืนสำหรับวิธี finalised ระยะเคลื่อน biphasic ประกอบด้วย0.1% (v/v) H3PO4 ใน HPLC น้ำ (A) และ 0.1% (v/v) H3PO4 ใน acetonitrile(ข) ถูกใช้ ก่อนที่จะใช้ โทรศัพท์มือถือระยะ A กรองผ่านเมมเบรนฮา lm 0.45 B และตัวกรองที่กรองผ่านขวด 0.45 lmZapCap CR-กรองด้านบน (Schleicher & Schuell เคนน์ใหม่แฮมเชียร์ สหรัฐอเมริกา) Elution เงื่อนไขได้ดังนี้: isocratic คิดelution 1% B, 0-1.5 นาที เส้นไล่ระดับจาก 1% B 4.5% B

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3 การพัฒนาวิธี HPLC
ทดลองพัฒนาวิธีที่ได้รับการดำเนินการโดยใช้
ระบบน้ำ HPLC พร้อมกับรุ่น 2695 แยก
โมดูลคู่กับรูปแบบน้ำ 996 เครื่องตรวจจับโฟโตไดโอดอาร์เรย์
(PAD) (วอเตอร์คอร์ป, ฟอร์ด, แมสซาชูเซต, ประเทศสหรัฐอเมริกา) โครมา
ก็ประสบความสำเร็จโดยใช้ 4.6? 100 มิลลิเมตร KINETEX 2.6 LM C-18 คอลัมน์
(Phenomenex อิงค์ Torrance, แคลิฟอร์เนียสหรัฐอเมริกา) พร้อมกับ
KrudKatcher อัลตร้าในบรรทัดกรองคอลัมน์ ในการควบคุมและ
เก็บข้อมูลได้รับการประสบความสำเร็จโดยใช้ Masslynx (เวอร์ชั่น
4.0) การวิเคราะห์ได้ดำเนินการที่อุณหภูมิคงที่ที่ 30 องศาเซลเซียส
โดยใช้อัตราการไหล 1.8 มิลลิลิตร / นาทีและปริมาณการฉีดตัวอย่าง
10 lL เครื่องตรวจจับความยาวคลื่น 270 นาโนเมตรสำหรับกรดแกลลิ, 254 นาโนเมตรสำหรับ
กรด ellagic และ 378 นาโนเมตรสำหรับ punicalagin A และ B ถูกนำมาใช้ พารามิเตอร์
แนะนำโดยผู้ผลิตคอลัมน์สำหรับการวิเคราะห์ของ
ฟีนอลในชาเขียว (Phenomenex HPLC แอพลิเคชันเลข
18549) ถูกนำมาใช้เป็นจุดเริ่มต้นและแก้ไขต่อมา
ผ่านชุดของการทดลองโดยตรงต่อการเพิ่มประสิทธิภาพ
การแยกสารประกอบที่กำหนดเป้าหมายในขณะที่ลดโดยรวม
เวลาวิเคราะห์ตัวอย่าง การปรับเปลี่ยนเงื่อนไขการไล่ระดับสี
และเฟสเคลื่อนที่ได้รับการสำรวจและพัฒนาวิธีการสรุป.
ประสิทธิภาพของวิธีการสรุปยังได้รับการยืนยัน
ผ่านชุดของการทดลองประเมินล็อด LOQ ปริมาณ
ช่วงความเข้มข้นและสมการเชิงปริมาณที่ได้รับสำหรับ
แต่ละมาตรฐานโพลีฟีน สำหรับ LOD และการทดลอง LOQ,
ข้อ จำกัด ได้รับการพิจารณาสังเกตุการใช้มาตรฐานที่มีความเข้มข้น
ต่ำเป็น 0.03, 0.03 และ 0.19 มิลลิกรัม / ลิตรสำหรับฝรั่งเศสและ ellagic
กรดและ punicalagin A และ B ตามลำดับ ทับทิมรายการ MARC
สารสกัดถูกนำมาใช้สำหรับการประเมินภายในวันและความแปรปรวนวันต่อวัน
และยังใช้สำหรับการทดลองการกู้คืนขัดขวาง.
สำหรับวิธีการสรุป, เฟสเคลื่อนที่ biphasic ประกอบด้วย
0.1% (v / v) H3PO4 ในน้ำ HPLC ( ) และ 0.1% (v / v) H3PO4 ใน acetonitrile
(B) ถูกนำมาใช้ ก่อนที่จะใช้เฟสเคลื่อนที่ถูกกรอง
ผ่าน 0.45 LM HA กรองเมมเบรนและ B ถูกกรองผ่าน
0.45 lmZapCap-CR กรองขวด-Top (Schleicher & Schuell, คีน,
New Hampshire, USA) เงื่อนไขชะมีดังนี้ Isocratic
ชะ 1% B, 0-1.5 นาที; ลาดเชิงเส้นจาก 1% B ถึง 4.5% B,

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 การพัฒนาเทคนิควิธีการการพัฒนาวิธีการทดลองใช้
น้ำ HPLC ระบบติดตั้งแบบแยก 2695
โมดูลคู่กับน้ำรุ่น 996 โฟโตไดโอดเรย์ตรวจจับ
( แผ่น ) ( น้ำคอร์ป , ฟอร์ด , Massachusetts , USA ) โครมาโตกราฟี
สําเร็จใช้ 4.6  100 มม. kinetex 2.6 LM - คอลัมน์
( phenomenex อิงค์ , Torrance , California , USA ) พร้อมกับ
krudkatcher กรอง Ultra ในคอลัมน์ ควบคุมเครื่องมือวัดและการใช้ข้อมูลได้ (

masslynx รุ่น 4.0 ) การวิเคราะห์การทดลองที่อุณหภูมิ 30  C
โดยใช้อัตราการไหล 2 มล. / นาทีและตัวอย่างการฉีดปริมาณของ
10 จะ เครื่องตรวจจับความยาวคลื่น 270 nm สำหรับเพิ่มขึ้น , 254 nm สำหรับ
กรดลาจิก 378 nm สำหรับ punicalagin A และ B มาใช้ พารามิเตอร์
คอลัมน์แนะนำโดยผู้ผลิตสำหรับการวิเคราะห์
โพลีฟีนอลในชาเขียว ( phenomenex HPLC สมัคร ID ไม่
18549 ) ถูกใช้เป็นจุดเริ่มต้นและต่อมาปรับเปลี่ยน
ผ่านชุดของการทดลองโดยตรงต่อซ
แยกสารประกอบเป้าหมายในขณะที่การลดโดยรวม
ตัวอย่างการวิเคราะห์เวลา การปรับเปลี่ยนเงื่อนไขการ
และ เฟสเคลื่อนที่เป็นสำรวจและสรุปวิธีการพัฒนา ประสิทธิภาพของการสรุปวิธี

ยังยืนยันผ่านชุดของการทดลองประเมินโลด loq เชิงปริมาณและความเข้มข้นของสมการเชิงปริมาณได้

ช่วงสำหรับแต่ละของโพลีมาตรฐาน และสำหรับ LOD loq การทดลอง
จำกัดเป็นเชิงประจักษ์โดยใช้มาตรฐานที่มีความเข้มข้น
เป็นต่ำเป็น 0.03 ,0.03 และ 0.19 มก. / ล. และกอลลาจิก
กรด และ punicalagin A และ B ตามลำดับ ทับทิมมาร์ค
g ใช้สำหรับการประเมินภายในวัน และแต่ละวันแปรปรวน
และยังใช้สำหรับการกู้คืนการทดลองขัดขวาง .
สำหรับการสรุปแบบ biphasic เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วย
0.1 เปอร์เซ็นต์ ( v / v ) H3PO4 ในน้ำ ( HPLC ) และ 0.1 เปอร์เซ็นต์ ( v / v )
( H3PO4 ในไน B ) คือใช้ . ก่อนที่จะใช้เฟสเคลื่อนที่ถูกกรองผ่าน 0.45 อิมฮา
เยื่อกรองและ B ถูกกรองผ่าน : 0.45 lmzapcap CR ขวดด้านบนกรอง ( ไชลเคอร์& schuell คีน ,
, นิวแฮมป์เชียร์ , สหรัฐอเมริกา เงื่อนไขที่ใช้มีดังนี้ ( Isocratic
1 % b , 0 – 1.5 มินเชิงเส้นไล่ระดับจาก 1 % เป็น 4.5 % B B