The protocol for evaluation of β-en

The protocol for evaluation of β-end in plasma was performed according to the guidelines in β-end ELISA kit (Catalog Number EDRF.96, MD Biosciences, Inc. USA). 500 μl of plasma was acidified with 500 μl of 1% trifluoroacetic acid (TFA) and mixed, then centrifuged at 10,000 × g for 20 min at 4degrees C. We then equilibrated a SEP-Column (200 mg of C18) by washing with 60% acetonitrite in 1% TFA (1,000 μl) followed 3 times with 1% trifluoroacetic acid (3000 μl). We loaded the acidified plasma solution onto the pre-treated C-18 SEP- Column, slowly washed the column with 1% trifluoroacetic acid and collected eluant. We evaporated the eluant to dryness in a centrifugal concentrator and collected this in a polypropylene tube and kept he dried sample at -20 degress C. In the ELISA system, the dried sample was reconstituted with assay buffer and a 50 μl of sample, 25 μl of primary anti-serum, and 25 μl of biotinlyated β-end was loaded into each wells. After incubation for 2 hr at room temperature, wells were washed washed three times, and dried. We then added 100 μl of diluted SA-HRP solution in each well, except for the blank, and incubated for 1 hr at room temperature. The plate was washed again three times and dried. Finally, we added 100 μl of TMB solution to each well, and incubated for 1 hr at room temperature. The reaction was stopped with 2N HCL and absorbance read at 450 nm. The concentration of β-end was calculated with the standard curve of standard β-end (0.01-1,000 ng/mL).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

โพรโทคอลสำหรับการประเมินβ-สิ้นสุดในพลาสมาทำตามคำแนะนำในβ-ELISA kit (แค็ตตาล็อกหมายเลข EDRF.96, MD เวลาออก Inc. สหรัฐอเมริกา) Μl 500 ของพลาสมาถูก acidified ด้วย 500 μl ของกรด 1% trifluoroacetic (TFA) และผสม แล้ว centrifuged ที่ 10000 × g สำหรับ 20 นาทีที่ 4degrees C. เรา equilibrated SEP-คอลัมน์ (200 มิลลิกรัมของ C18) โดยการซักผ้าด้วย 60% acetonitrite % 1 แล้ว TFA (1000 μl) ตาม 3 ครั้ง ด้วยกรด trifluoroacetic 1% (3000 μl) เราโหลดโซลูชันพลาสม่า acidified ลง C-18 SEP - คอลัมน์ก่อนบำบัด ช้าล้างคอลัมน์ ด้วยกรด trifluoroacetic 1% แล้วรวบรวม eluant เรา eluant กับความแห้งกร้านในอาทิตย์หัวแรงเหวี่ยงที่หายไป และรวบรวมนี้ในหลอด polypropylene และเก็บเขาแห้งอย่างที่-20 องศาเซลเซียส ในระบบ ELISA ตัวอย่างแห้งถูก reconstituted กับวิเคราะห์บัฟเฟอร์ และ μl 50 ของตัวอย่าง μl 25 ของซีรั่มป้องกันหลัก และ μl 25 ของ biotinlyated β-สิ้นสุดถูกโหลดลงในแต่ละบ่อ หลังจากฟักตัวใน 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง บ่อถูกล้างหินสามครั้ง และอบแห้ง เราแล้วเพิ่ม μl 100 ของ SA HRP แตกออกในแต่ละดี ยกเว้นว่าง และ incubated สำหรับ 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง จานไม่ล้างอีกสามครั้ง และแห้ง สุดท้าย เราเพิ่ม μl 100 ของทหารไทยดีแต่ละ และ incubated สำหรับ 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง หยุดปฏิกิริยา ด้วย 2N HCL และอ่าน absorbance ที่ 450 nm มีคำนวณความเข้มข้นของβ-สิ้นสุดกับเส้นโค้งมาตรฐานของมาตรฐานβ-สิ้นสุด (0.01-1000 ng/mL)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

โปรโตคอลสำหรับการประเมินผลของβ-end ในพลาสม่าได้ดำเนินการตามแนวทางในβ-end ที่ชุด ELISA (รายการสินค้าจำนวน EDRF.96, MD ชีววิทยาศาสตร์, Inc สหรัฐอเมริกา) 500 ไมโครลิตรของพลาสม่าถูกกรด 500 ไมโครลิตร 1% กรด TRIFLUOROACETIC (TFA) และผสมแล้วหมุนเหวี่ยงที่ 10,000 ×กรัมเป็นเวลา 20 นาทีที่ 4degrees ซีจากนั้นเรา equilibrated กันยายนคอลัมน์ (200 มิลลิกรัม C18) โดยการล้างด้วย 60 acetonitrite% ใน 1% TFA (1,000 ไมโครลิตร) ตาม 3 ครั้งกับ 1% กรด TRIFLUOROACETIC (3000 ไมโครลิตร) เราโหลดทางออกที่พลาสม่ากรดบนก่อนรับการรักษา C-18 ก.ย. คอลัมน์ล้างช้าคอลัมน์ที่มี 1% กรด TRIFLUOROACETIC eluant และเก็บรวบรวม เรา eluant ระเหยแห้งในหัวแรงเหวี่ยงและเก็บรวบรวมนี้ในหลอดโพรพิลีนและเก็บตัวอย่างเขาแห้งที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียสในระบบวิธี ELISA ตัวอย่างแห้งที่ถูกสร้างขึ้นด้วยกันชนทดสอบและ 50 ไมโครลิตรของกลุ่มตัวอย่าง 25 ไมโครลิตร ของการต่อต้านในซีรั่มหลักและ 25 ไมโครลิตรของ biotinlyated β-end ที่ถูกโหลดลงในหลุมแต่ละ หลังจากการบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องหลุมถูกล้างล้างสามครั้งและแห้ง จากนั้นเราจะเพิ่ม 100 ไมโครลิตรของการแก้ปัญหาการปรับลด SA-HRP ในแต่ละดียกเว้นว่างเปล่าและบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง จานถูกล้างอีกครั้งสามครั้งและแห้ง สุดท้ายเราเพิ่ม 100 ไมโครลิตรของการแก้ปัญหาให้กับแต่ละธนาคารทหารไทยดีและบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ปฏิกิริยาก็หยุดด้วย 2N HCL และการดูดกลืนแสงที่ 450 อ่านนาโนเมตร ความเข้มข้นของβ-end ที่คำนวณได้กับกราฟมาตรฐานของβสิ้นมาตรฐาน (0.01-1,000 นาโนกรัม / มิลลิลิตร)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ขั้นตอนการประเมินของบีตา - สิ้นสุดในพลาสมามีการปฏิบัติตามแนวทางในบีตา - จบชุด ELISA ( หมายเลขบัญชีรายชื่อ edrf.96 MD BIOSCIENCES ( สหรัฐอเมริกา ) 500 μ l ระดับน้ำปรับ 500 μลิตร 1 % กรดไตรฟลูออโรอะซิติก ( ประชาธิปไตย ) และ ผสม แล้ว ระดับที่ 10 × G สำหรับ 20 นาทีที่ 4degrees Cจากนั้นเรา equilibrated เป็นก.ย. คอลัมน์ ( 200 มิลลิกรัม c18 ) ซัก 60 % acetonitrite 1% กรดไขมัน ( 1000 μ L ) ตาม 3 ครั้งกับ 1 % กรดไตรฟลูออโรอะซิติก ( 3000 μ L ) เราโหลดปรับโซลูชั่นบนพลาสมาก่อนปฏิบัติ - ก.ย. - คอลัมน์ ค่อยๆล้างคอลัมน์ 1 % กรดไตรฟลูออโรอะซิติกและรวบรวม eluant .เรา eluant ระเหยแห้งในหัวเหวี่ยงและเก็บในท่อโพลีโพรพิลีน และเก็บเขาแห้งตัวอย่างที่อุณหภูมิ - 20 องศา C ในระบบ ELISA , แห้งตัวอย่างสร้างบัฟเฟอร์ในμ 50 ลิตรจำนวน 25 μลิตรหลัก anti ซีรั่ม และ 25 μล. บีตา - biotinlyated สุดท้ายถูกโหลดลงในแต่ละหลุม หลังจากบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิห้องเวลส์ถูกล้าง 3 ครั้ง และอบแห้ง เราเพิ่มแล้ว 100 μล. เจือจางสารละลายในแต่ละ sa-hrp ยกเว้นช่องว่าง และบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิห้อง จานล้างอีกสามครั้งและแห้ง สุดท้าย เราได้เพิ่ม 100 μลิตร ( โซลูชั่นกัน และบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิห้อง ปฏิกิริยาที่ถูกหยุดด้วย 2 นอร์มัลและค่าอ่าน 450 nm .ความเข้มข้นของบีตา - ปลายคำนวณกับเส้นโค้งมาตรฐานของบีตา - มาตรฐาน ( 0.01-1000 ng / ml )