The variable V3 region of the 16S r

The variable V3 region of the 16S rRNA gene (200 bp)
for each isolate and reference strains were amplified using
the universal primer R518 (5-ATTACCGCGGCTGCTGG-
3) and F357-GC (5-CGCCCGCCGCGCGCGGC
GGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3)
(Muyzer et al. 1993). The 50 L PCR mixtures contained 100 ng
DNA template, 0.2 mM dNTPs (TaKaRa), 5 L Taq DNA buffer,
2 mM MgCl2 (TaKaRa), 2.5 U Taq DNA polymerase (TaKaRa), and
10 pmol of each primer. Amplification was performed in PTC-200
Peltier Thermal Cycler (MJ Research, USA) with a touchdown PCR.
The reaction procedure was as follows: initial denaturation of
template DNA was performed at 94 ◦C for 5 min, followed by 20
touchdown cycles in which the procedure was denatured at 94 ◦C
for 1 min, annealing at 65 ◦C for 1 min and decreased at a rate of
0.5 ◦C per cycle, extension at 72 ◦C for 1 min, then performed 10
cycles of 94 ◦C for 1 min; 55 ◦C for 1 min, 72 ◦C for 1 min, and a
final elongation at 72 ◦C for 5 min. The size and quantity of PCR
products were checked by 1.5% agarose gel electrophoresis, stained
in ethidium bromide solution for 30 min, and visualized by UVP
Biolmaying Systems (GDS-8000 System, Ultra-Violet Products Ltd.,
Cambridge, UK).
2.4.2. Construction of ladder marker

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ภาค V3 ตัวแปรของการ 16S rRNA ยีน (200 bp)สำหรับแยกและการอ้างอิงแต่ละ สายพันธุ์ได้ถูกขยายโดยใช้รองพื้นสากล R518 (5 - ATTACCGCGGCTGCTGG-3) และ F357 GC (5 - CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3)(Muyzer et al. 1993) น้ำยาผสม PCR 50 L อยู่ 100 ngดีเอ็นเอต้นแบบ 0.2 mM dNTPs (TaKaRa), 5 L Taq DNA บัฟเฟอร์2 มม. MgCl2 (TaKaRa), 2.5 U Taq DNA พอลิเมอเรส (TaKaRa), และpmol 10 พื้นแต่ละ ทำการขยายใน PTC-200Peltier ร้อน Cycler (MJ วิจัย สหรัฐอเมริกา) กับเหรียญ PCRขั้นตอนของปฏิกิริยาเป็นดังนี้: denaturation เริ่มต้นของทำแม่แบบดีเอ็นเอที่ ◦C 94 สำหรับ 5 นาที ตาม ด้วย 20เหรียญรอบซึ่งขั้นตอนมี denatured ที่ 94 ◦Cใน 1 นาที การอบเหนียวที่ 65 ◦C ใน 1 นาที และลดลงในอัตรา◦C 0.5 ต่อวงจร ◦C 72 ใน 1 นาที 10 ที่ทำแล้ววงจรของ 94 ◦C 1 นาที ◦C 55 สำหรับ 1 นาที ◦C 72 ใน 1 นาที และelongation ขั้นสุดท้ายที่ ◦C 72 สำหรับ 5 นาที ขนาดและปริมาณของ PCRผลิตภัณฑ์ถูกตรวจสอบ โดย 1.5% agarose electrophoresis เจล สีในโซลูชันโบรไมด์ ethidium สำหรับ 30 นาที และ visualized โดย UVPระบบ Biolmaying (GDS 8000 ระบบ Ultra-Violet ผลิตภัณฑ์ จำกัดเคมบริดจ์ สหราชอาณาจักร)2.4.2 การก่อสร้างบันไดเครื่องหมาย

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ภูมิภาค V3 ตัวแปรของยีน 16S rRNA (200 bp)
สำหรับแต่ละสายพันธุ์ที่แยกและการอ้างอิงถูกขยายโดยใช้ไพรเมอร์สากล R518 (5? -ATTACCGCGGCTGCTGG- 3?) และ GC-F357 (5? -CGCCCGCCGCGCGCGGC GGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3?) ( Muyzer et al. 1993) 50? ผสม PCR L ที่มีอยู่ 100 ng แม่แบบดีเอ็นเอ 0.2 มิลลิ dNTPs (Takara) 5? L Taq บัฟเฟอร์ดีเอ็นเอ2 มิลลิ MgCl2 (Takara) 2.5 U Taq ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ (Takara) และ10 pmol ของแต่ละไพรเมอร์ ขยายได้ดำเนินการใน PTC-200 Peltier Cycler ความร้อน (MJ วิจัยสหรัฐอเมริกา) กับดาว์น PCR. ขั้นตอนปฏิกิริยาดังนี้ denaturation เริ่มต้นของดีเอ็นเอแม่แบบเป็นที่94 ◦Cเป็นเวลา 5 นาทีตามด้วย 20 รอบทัชดาวน์ที่ ขั้นตอนที่ถูกเอทิลแอลกอฮอล์ที่ 94 ◦Cเป็นเวลา1 นาที, การอบที่ 65 ◦Cเป็นเวลา 1 นาทีและลดลงในอัตรา0.5 ◦Cต่อวงจรขยายที่ 72 ◦Cเป็นเวลา 1 นาทีจากนั้นดำเนินการ 10 รอบ 94 ◦Cสำหรับ 1 นาที; 55 ◦Cเป็นเวลา 1 นาที 72 ◦Cเป็นเวลา 1 นาทีและยืดตัวสุดท้ายที่72 ◦Cเป็นเวลา 5 นาที ขนาดและปริมาณของ PCR ผลิตภัณฑ์ถูกตรวจสอบ 1.5% ข่าวคราว agarose เปื้อนในการแก้ปัญหาethidium bromide เป็นเวลา 30 นาทีและมองเห็นโดย UVP Biolmaying ระบบ (GDS-8000 ระบบอัลตร้าไวโอเล็ต จำกัด ผลิตภัณฑ์เคมบริดจ์สหราชอาณาจักร). 2.4 0.2 การก่อสร้างบันไดเครื่องหมาย

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ตัวแปรเขตของยีน 16S rRNA V3 ( 200 BP )
สำหรับแต่ละแยกและสายพันธุ์อ้างอิงถูกขยายด้วย
r518 รองพื้นสากล ( 5  - attaccgcggctgctgg -
3  ) และ f357-gc ( 5  - cgcccgccgcgcgcggc
gggcggggcgggggcacggggggcctacgggaggcagcag-3  )
( muyzer et al . 1993 ) 50  ผม PCR ผสมที่มีอยู่ 100 ng
ดีเอ็นเอแม่แบบ , 0.2 มม. dntps ( ทาการะ ) , 5  ผมแทคดีเอ็นเอ บัฟเฟอร์ ,
2 มม. ชุด ( ทาการะ ) , 2 .5 U แท็ค DNA polymerase ( ทาการะ ) และ
10 pmol แต่ละรองพื้น การสื่อสารในการปฏิบัติ ptc-200 Peltier Thermal cycler
( สหรัฐอเมริกาการวิจัย MJ ) กับทัชดาวน์ ) .
กระบวนการปฏิกิริยาดังนี้ ( เริ่มต้นของดีเอ็นเอแม่แบบ
ดำเนินการโดย◦ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที ตามด้วย 20
เทพนิรมิตรอบซึ่งในกระบวนการเกิดที่ 94 ◦ C
1 นาที ,อบอ่อนที่อุณหภูมิ 65 องศาเซลเซียสนาน 1 นาที◦และลดลงในอัตรา 0.5 ◦
c ต่อวงจรขยายที่ 72 ◦องศาเซลเซียสนาน 1 นาที แล้วทำการ 10
รอบ 94 ◦องศาเซลเซียสนาน 1 นาที ; 55 ◦องศาเซลเซียสนาน 1 นาที 72 ◦ C เป็นเวลา 1 นาทีและ
ยืดตัวสุดท้ายที่ 72 ◦องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที ขนาดและปริมาณของผลิตภัณฑ์ PCR
ดู 1.5% เจลอิเล็กเปื้อน
ในสารละลายโบรไมด์คู่ 30 นาที และมองเห็น uvp
โดยbiolmaying ระบบ ( gds-8000 ระบบอัลตร้าไวโอเลตผลิตภัณฑ์ Ltd .
Cambridge , UK ) .
2.4.2 . บันไดเครื่องหมายการก่อสร้าง