Selection of and immune response to

Selection of and immune response to recombinant MHVA59
expressing the LCMV CD8
epitope gp33. We have selected
a recombinant MHV-A59 (RA59) expressing a foreign
CD8
T-cell epitope, gp33, derived from the glycoprotein (or
G protein) of LCMV. The gp33 epitope is expressed as a
fusion protein, sandwiched between a 9-amino-acid fragment
of the MHV ORF4a protein (37) and the EGFP (4). A schematic
diagram of the genome of this virus (RA59-gfp/gp33) as
well as a previously described recombinant MHV-A59 expressing
the EGFP protein alone (RA59-gfp), is shown in Fig. 1. In
both genomes the nonessential gene 4 is replaced by the foreign
sequences. Selection of RA59-gfp was described previously
(5). RA59-gfp/gp33 was selected using techniques similar
to those used in the selection of RA59-gfp and is described in
the Materials and Methods. Briefly, recombination occurred
between fMHV and an RNA encoding, in place of gene 4, a
recombinant protein containing 9 amino acids from ORF4a
and 9 amino acids of gp33 fused in frame with the EGFP gene.
Such recombinants were selected and plaque purified on murine
L2 cells all as previously described (26) and were characterized
further.
Cells infected with these viruses were notably less fluorescent
than RA59-gfp, suggesting that the N-terminal addition to
the EGFP protein may interfere with its function. Alternatively
there may be less transcription or translation due to differences
near the intergenic sequences (5, 20). RA59-gfp/gp33 (log10
50% lethal dose [LD50]  5.6) displayed a similar level of
virulence to RA59-gfp (log10 LD50  5.5). As previously published
(5), RA59-gfp is somewhat attenuated relative to wildtype
recombinant RA59 (log10 LD50  4); thus, both EGFPexpressing
viruses display LD50 values approximately 10-fold
higher than those displayed by wild-type RA59.
We quantified the epitope-specific CD8
T-cell response to
RA59-gfp/gp33 in the spleen and in the CNS after both i.c. and
i.p. inoculation. Thus, 4-week-old B6 mice were inoculated
either i.c. or i.p. and animals were sacrificed at day 7 postinfection
(after i.c. inoculation) and on day 8 postinfection (after
i.p. inoculation), the peak of inflammation for each route.
Splenocytes were isolated from both sets of mice; CNS mononuclear
cells were isolated from only those mice inoculated by
the i.c. route. An intracellular IFN- assay was used to quantify
the percentage of CD8
T cells specific for the MHV spike
protein CD8
T-cell epitope S598 and for gp33 (19, 25). As
shown in Fig. 2, S598 and gp33 epitope-specific CD8
T cells
are detected in both the spleen and the CNS. Response in the
spleen is similar whether inoculation is carried out either i.c. or
i.p.; following i.c. infection, the levels of CD8
T cells specific
for both epitopes are higher in the CNS, the site of viral
replication, than in the spleen, as observed previously (3, 17).
Epitope-specific CD8
T cells confer protection against infection
with RA59-gfp/gp33. We wanted to determine the ability
of the CD8
T-cell response against a single epitope to
protect mice from MHV replication and disease. The strategy
was to carry out immunization with an rLm expressing gp33
(rLm-gp33) followed by challenge with RA59-gfp/gp33.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Selection of and immune response to recombinant MHVA59expressing the LCMV CD8
epitope gp33. We have selecteda recombinant MHV-A59 (RA59) expressing a foreignCD8
T-cell epitope, gp33, derived from the glycoprotein (orG protein) of LCMV. The gp33 epitope is expressed as afusion protein, sandwiched between a 9-amino-acid fragmentof the MHV ORF4a protein (37) and the EGFP (4). A schematicdiagram of the genome of this virus (RA59-gfp/gp33) aswell as a previously described recombinant MHV-A59 expressingthe EGFP protein alone (RA59-gfp), is shown in Fig. 1. Inboth genomes the nonessential gene 4 is replaced by the foreignsequences. Selection of RA59-gfp was described previously(5). RA59-gfp/gp33 was selected using techniques similarto those used in the selection of RA59-gfp and is described inthe Materials and Methods. Briefly, recombination occurredbetween fMHV and an RNA encoding, in place of gene 4, arecombinant protein containing 9 amino acids from ORF4aand 9 amino acids of gp33 fused in frame with the EGFP gene.Such recombinants were selected and plaque purified on murineL2 cells all as previously described (26) and were characterizedfurther.Cells infected with these viruses were notably less fluorescentthan RA59-gfp, suggesting that the N-terminal addition tothe EGFP protein may interfere with its function. Alternativelythere may be less transcription or translation due to differencesใกล้ลำดับ intergenic (5, 20) RA59-gfp/gp33 (log1050% ยายุทธภัณฑ์ [LD50] 5.6) แสดงระดับคล้ายคลึงกันvirulence เพื่อ RA59-gfp (log10 LD50 5.5) ก่อนหน้านี้เป็น การเผยแพร่(5), ค่อนข้างมีการไฟฟ้าเคร... RA59-gfp สัมพันธ์ wildtyperecombinant RA59 (log10 LD50 4); ดังนั้น ทั้งสอง EGFPexpressingไวรัสแสดงค่า LD50 ประมาณ 10-foldสูงกว่าผู้ที่แสดง โดยไวลด์ไทป์ RA59เรา quantified การเฉพาะ epitope CD8 T เซลล์ตอบสนองต่อRA59-gfp/gp33 ม้าม และ CNS หลังทั้งซี และi.p. inoculation นั้น ดังนั้น ที่ inoculated หนู B6 อายุ 4 สัปดาห์ทั้งซี หรือ i.p. และสัตว์เสียสละในวัน 7 postinfection(หลังจากซี inoculation) และ postinfection 8 วัน (หลังจากi.p. inoculation), จุดสูงสุดของแต่ละกระบวนการSplenocytes ถูกแยกต่างหากจากทั้งสองชุดของหนู CNS mononuclearเซลล์ถูกแยกต่างหากจากเฉพาะหนูที่ inoculated ด้วยกระบวนการซี IFN-วิเคราะห์การ intracellular ถูกใช้เพื่อกำหนดปริมาณเปอร์เซ็นต์ของเซลล์ CD8 T เฉพาะสำหรับสไปค์ MHVepitope T เซลล์ CD8 โปรตีน S598 และ gp33 (19, 25) เป็นแสดงในเซลล์ CD8 T epitope เฉพาะ Fig. 2, S598 และ gp33จะพบในม้ามและ CNS ตอบสนองในการม้ามจะคล้ายกันว่าทำ inoculation ออกซีใด หรือi.p. ต่อไปนี้ซีติดเชื้อ ระดับของเซลล์ CD8 T เฉพาะทั้ง epitopes จะสูงใน CNS ของไวรัสจำลอง กว่าม้าม เป็นที่สังเกตไว้ก่อนหน้านี้ (3, 17)เซลล์ CD8 T Epitope เฉพาะประสาทป้องกันการติดเชื้อกับ RA59-gfp/gp33 เราต้องการกำหนดความสามารถในของ CD8 T เซลล์ตอบสนองต่อ epitope เดียวเพื่อป้องกันหนูจาก MHV จำลองและโรค กลยุทธ์จะดำเนินการรับวัคซีนกับ rLm การแสดง gp33(rLm-gp33) ตาม ด้วยความท้าทายด้วย RA59-gfp/gp33