- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
2.1. Organisms and maintenanceG. di
2.1. Organisms and maintenance
G. diazotrophicus PAL 5 (ATCC 49037) (Cavalcante and
Döbereiner, 1988) and a -glucuronidase marked G. diazotrophicus
strain UAP5541/pRGS561 (Fuentes-Ramírez et al., 1999) were
maintained at 4 ◦C on potato medium (Stephan et al., 1991) with
nalidixic acid (Nal) (15 g ml−1) and Nal and streptomycin (Sm)
(45 g ml−1), respectively.
2.2. Culture conditions
Bacterial strains were grown in flasks (1 l) containing 250 ml of
LGI medium (Stephan et al., 1991) with glycerol (10 g l−1) and yeast
extract (1 g l−1) at pH 6.0, on a rotatory shaker at 200 rpm and 30 ◦C
for 48 h.
2.3. Inoculum preparation
To study the colonization pattern of inoculated bacteria, cultures
of G. diazotrophicus PAL 5 or UAP 5541/pRGS561 were centrifuged
and resuspended in the same volume of pH 6.0 phosphate saline
buffer (PBS) and used as inocula (Luna et al., 2010). For greenhouse
experiments bacterial cultures (approximately 1.109 CFU ml−1)
were used as inocula.
2.4. Plant experiments
Two types of experiments were performed inoculating tomato
plants (Lycopersicum esculentum cv. “superman”, Seminis): one to
evaluate the colonization pattern of G. diazotrophicus PAL 5 or UAP
5541/pRGS561 under gnotobiotic conditions; and the other one
to test fruit yield by inoculation with G. diazotrophicus PAL 5 in
greenhouse.
2.4.1. Colonization experiments
Tomato seeds were surface disinfected with 70% ethanol for
5 min followed by one wash with sterile water and immersion in
2% sodium hypochlorite for 10 min followed by three washes with
sterile water. Seeds were germinated for 4 days at 28 ◦C in the dark
on semisolid medium (0.5% agar). Seedlings were immersed in an
appropriate volume of the bacterial inoculum (G. diazotrophicus PAL
5 or UAP 5541/pRGS561) with constant shaking for 10 min. Negative
controls were immersed in an appropriate volume of sterile
pH 6.0 PBS. Inoculated seedlings were placed into flasks containing
100 ml of semi solid Fahräeus medium (0.5% agar). Plants were
grown in a controlled growth chamber under a light/dark cycle of
16 and 8 h, respectively, at 28 ◦C for 25 days. Three independent
experiments with three treatments each (non-inoculated controls,
inoculated with G. diazotrophicus PAL 5 and inoculated with G. diazotrophicus
UAP 5541/pRGS561), and 50 plants/treatment, were
performed.
Plants were harvested two days after seedling inoculation
(when it is possible to separate roots and stems) and then at 2–3
days intervals. Roots and stems were then separated. For each tissue
three samples were combined and three replicates of tissue
samples collected (9 plants each time) to determine the average
colonization and fresh weight (fw). To determine endophytic
population, plant tissues were rinsed with sterile distilled water
and disinfected with 2% sodium hypochlorite for three minutes
with constant agitation for roots and 2 min for stems. Samples
were then washed four times with sterilized water and manually
crushed using a mortar and pestle. The homogenates were
resuspended in 1 ml of PBS and vortexed. This suspension was 10-
fold serially diluted and plated on LGI agar plates, containing Nal,
Sm and X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-d-glucuronide
cyclohexylammonium salt, 40 g ml−1) for gusA-marked strain or
Nal for strain PAL 5. Colony forming units were counted after incubation
at 28 ◦C for 3 days. As previously described by Luna et al.
(2010) three control procedures were performed to ensure the efficiency
of the surface disinfection method: (1) disinfected plant
tissue samples taken 96 h postinoculation (P.I.) (with the gusAmarked
strain) were observed by optical microscopy after staining,
(2) disinfected tissues were placed for 1 min onto plates containing
LGI, removed and plates were incubated at 28 ◦C, (3) the wash
solution from the last rinse was cultured on LGI plates.
To determine the extent of total colonization (rhizoplane and
endophytic population) of inoculated seedlings, another set of
plantlets were removed from the agar. Roots were rinsed with
sterile distilled water and processed as above, without surface disinfection.
Rhizoplane population was determined by subtracting
the inside population from the total bacterial counts determined
without surface disinfection (Gyaneshwar et al., 2001).
Plants inoculated with strain UAP 5541/pRGS561 were harvested
and separated into roots and stems. GUS activity was tested
daily during the first week after inoculation and at three-day intervals
thereafter. The plants were carefully removed from the growth
medium and roots were gently washed with sterile water in order
to wash the remaining agar away. The staining procedure was carried
out as described by Jefferson et al. (1987). Non-inoculated
plants were analyzed at the same time intervals. Samples were
observed after staining and photographed using a Carl Zeiss Photomicroscope.
Multiple samples were examined either directly or
by using hand-cut sections of plant tissues immersed in agarose
blocks.
G. diazotrophicus PAL 5 (ATCC 49037) (Cavalcante and
Döbereiner, 1988) and a -glucuronidase marked G. diazotrophicus
strain UAP5541/pRGS561 (Fuentes-Ramírez et al., 1999) were
maintained at 4 ◦C on potato medium (Stephan et al., 1991) with
nalidixic acid (Nal) (15 g ml−1) and Nal and streptomycin (Sm)
(45 g ml−1), respectively.
2.2. Culture conditions
Bacterial strains were grown in flasks (1 l) containing 250 ml of
LGI medium (Stephan et al., 1991) with glycerol (10 g l−1) and yeast
extract (1 g l−1) at pH 6.0, on a rotatory shaker at 200 rpm and 30 ◦C
for 48 h.
2.3. Inoculum preparation
To study the colonization pattern of inoculated bacteria, cultures
of G. diazotrophicus PAL 5 or UAP 5541/pRGS561 were centrifuged
and resuspended in the same volume of pH 6.0 phosphate saline
buffer (PBS) and used as inocula (Luna et al., 2010). For greenhouse
experiments bacterial cultures (approximately 1.109 CFU ml−1)
were used as inocula.
2.4. Plant experiments
Two types of experiments were performed inoculating tomato
plants (Lycopersicum esculentum cv. “superman”, Seminis): one to
evaluate the colonization pattern of G. diazotrophicus PAL 5 or UAP
5541/pRGS561 under gnotobiotic conditions; and the other one
to test fruit yield by inoculation with G. diazotrophicus PAL 5 in
greenhouse.
2.4.1. Colonization experiments
Tomato seeds were surface disinfected with 70% ethanol for
5 min followed by one wash with sterile water and immersion in
2% sodium hypochlorite for 10 min followed by three washes with
sterile water. Seeds were germinated for 4 days at 28 ◦C in the dark
on semisolid medium (0.5% agar). Seedlings were immersed in an
appropriate volume of the bacterial inoculum (G. diazotrophicus PAL
5 or UAP 5541/pRGS561) with constant shaking for 10 min. Negative
controls were immersed in an appropriate volume of sterile
pH 6.0 PBS. Inoculated seedlings were placed into flasks containing
100 ml of semi solid Fahräeus medium (0.5% agar). Plants were
grown in a controlled growth chamber under a light/dark cycle of
16 and 8 h, respectively, at 28 ◦C for 25 days. Three independent
experiments with three treatments each (non-inoculated controls,
inoculated with G. diazotrophicus PAL 5 and inoculated with G. diazotrophicus
UAP 5541/pRGS561), and 50 plants/treatment, were
performed.
Plants were harvested two days after seedling inoculation
(when it is possible to separate roots and stems) and then at 2–3
days intervals. Roots and stems were then separated. For each tissue
three samples were combined and three replicates of tissue
samples collected (9 plants each time) to determine the average
colonization and fresh weight (fw). To determine endophytic
population, plant tissues were rinsed with sterile distilled water
and disinfected with 2% sodium hypochlorite for three minutes
with constant agitation for roots and 2 min for stems. Samples
were then washed four times with sterilized water and manually
crushed using a mortar and pestle. The homogenates were
resuspended in 1 ml of PBS and vortexed. This suspension was 10-
fold serially diluted and plated on LGI agar plates, containing Nal,
Sm and X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-d-glucuronide
cyclohexylammonium salt, 40 g ml−1) for gusA-marked strain or
Nal for strain PAL 5. Colony forming units were counted after incubation
at 28 ◦C for 3 days. As previously described by Luna et al.
(2010) three control procedures were performed to ensure the efficiency
of the surface disinfection method: (1) disinfected plant
tissue samples taken 96 h postinoculation (P.I.) (with the gusAmarked
strain) were observed by optical microscopy after staining,
(2) disinfected tissues were placed for 1 min onto plates containing
LGI, removed and plates were incubated at 28 ◦C, (3) the wash
solution from the last rinse was cultured on LGI plates.
To determine the extent of total colonization (rhizoplane and
endophytic population) of inoculated seedlings, another set of
plantlets were removed from the agar. Roots were rinsed with
sterile distilled water and processed as above, without surface disinfection.
Rhizoplane population was determined by subtracting
the inside population from the total bacterial counts determined
without surface disinfection (Gyaneshwar et al., 2001).
Plants inoculated with strain UAP 5541/pRGS561 were harvested
and separated into roots and stems. GUS activity was tested
daily during the first week after inoculation and at three-day intervals
thereafter. The plants were carefully removed from the growth
medium and roots were gently washed with sterile water in order
to wash the remaining agar away. The staining procedure was carried
out as described by Jefferson et al. (1987). Non-inoculated
plants were analyzed at the same time intervals. Samples were
observed after staining and photographed using a Carl Zeiss Photomicroscope.
Multiple samples were examined either directly or
by using hand-cut sections of plant tissues immersed in agarose
blocks.
0/5000
2.1. สิ่งมีชีวิตและการบำรุงรักษาDiazotrophicus กรัม 5 PAL (ATCC 49037) (Cavalcante และDöbereiner, 1988) และ - glucuronidase เครื่อง diazotrophicus กรัมไม่ต้องใช้ UAP5541/pRGS561 (Fuentes Ramírez et al., 1999)รักษาที่ ◦C 4 บนมันฝรั่งขนาดกลาง (Stephan et al., 1991) ด้วยกรดนาลิดิซิก (Nal) (15 g ml−1) และ Nal และ streptomycin (Sm)(45 g ml−1), ตามลำดับ2.2. วัฒนธรรมเงื่อนไขแบคทีเรียสายพันธุ์ที่ปลูกในน้ำ (1 ลิตร) ที่ประกอบด้วย 250 ml ของLGI กลาง (Stephan et al., 1991) กับกลีเซอร (10 g l−1) และยีสต์แยก (l−1 1 g) ที่ pH 6.0 ในเชคเกอร์ rotatory ที่ 200 รอบต่อนาทีและ 30 ◦Cสำหรับ 48 h2.3 เตรียม inoculumการศึกษารูปแบบสนามของแบคทีเรีย inoculated วัฒนธรรมมี centrifuged diazotrophicus PAL 5 หรือสตริคแอ 5541/pRGS561 ของกรัมและ resuspended ในระดับเดียวกับน้ำเกลือฟอสเฟต pH 6.0บัฟเฟอร์ (PBS) และใช้เป็น inocula (Luna et al., 2010) ในเรือนกระจกทดลองแบคทีเรียวัฒนธรรม (ประมาณ 1.109 CFU ml−1)ถูกใช้เป็น inocula2.4. พืชทดลองดำเนินการทดลองสองชนิด inoculating มะเขือเทศพืช (Lycopersicum esculentum พันธุ์ "ซูเปอร์แมน" Seminis): การประเมินรูปแบบสนาม PAL 5 หรือสตริคแอกรัม diazotrophicus5541/pRGS561 ภายใต้เงื่อนไขที่ gnotobiotic และอีกหนึ่งการทดสอบผลผลิตผลไม้ โดย inoculation กับ diazotrophicus PAL 5 กรัมในเรือนกระจก2.4.1. สนามทดลองเมล็ดมะเขือเทศถูกฆ่าเชื้อ ด้วย 70% เอทานอลสำหรับผิว5 นาทีตาม ด้วยล้างหนึ่งกับน้ำที่ผ่านการฆ่าเชื้อและแช่ใน2% ฟอกขาวใน 10 นาทีตาม ด้วย washes สามด้วยกระบอกน้ำ เมล็ดมีเปลือกงอก 4 วันที่ 28 ◦C ในมืดใน semisolid ปานกลาง (0.5% agar) กล้าไม้แช่อยู่ในตัวปริมาณที่เหมาะสมของ inoculum แบคทีเรีย (กรัม diazotrophicus พาล5 หรือสตริคแอ 5541/pRGS561) ด้วยการสั่นคงที่สำหรับ 10 นาทีลบตัวควบคุมถูกชนิดในปริมาณเหมาะสมของกอซpH 6.0 PBS กล้าไม้ inoculated ถูกวางลงในน้ำที่ประกอบด้วย100 มลของกึ่งแข็ง (agar 0.5%) ขนาดกลาง Fahräeus พืชได้ปลูกในห้องควบคุมการเจริญเติบโตภายใต้วงจรไฟ/มืด16 และ 8 h ตามลำดับ ใน ◦C 28 วันที่ 25 อิสระ 3ทดลองกับสามรักษาแต่ละ (ไม่ใช่ inoculated ควบคุมinoculated กับ diazotrophicus กรัม PAL 5 และ inoculated กับ diazotrophicus กรัมสตริคแอ 5541/pRGS561), และพืช 50/รักษา ถูกดำเนินการพืชเก็บเกี่ยวสองวันหลังจากแหล่ง inoculation(เมื่อจำเป็นต้องแยกราก และลำต้น) และ ใน 2-3 แล้วช่วงเวลาของวัน รากและลำต้นก็แยกออกแล้ว ในแต่ละเนื้อเยื่อมีรวมตัวอย่างสาม และสามเหมือนกับของเนื้อเยื่อตัวอย่างการรวบรวม (9 พืชแต่ละครั้ง) เพื่อกำหนดค่าเฉลี่ยสนามและน้ำหนักสด (fw) กำหนด endophyticประชากร พืชเนื้อเยื่อถูก rinsed ด้วยกอซกลั่นน้ำและฆ่าเชื้อ ด้วย 2% ฟอกเวลาสามนาทีด้วยคงอาการกังวลต่อราก และใกลสำหรับลำต้น ตัวอย่างแล้วถูกล้าง 4 ครั้งน้ำ sterilized และด้วยตนเองบดใช้เป็นโกร่ง ได้ homogenatesresuspended ใน 1 ml ของ PBS และ vortexed ระบบกันสะเทือนนี้ถูก 10-พับผสม และเคลือบบนแผ่น agar LGI ประกอบด้วย Nal, seriallySm และ X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-d-glucuronidecyclohexylammonium เกลือ 40 g ml−1) สำหรับเครื่อง gusA ต้องใช้ หรือNal สำหรับต้องใช้ PAL 5 หน่วยโคโลนีขึ้นรูปนับได้หลังจากบ่มที่ ◦C 28 วัน 3 ก่อนหน้านี้ที่ อธิบายไว้โดย Luna et al(2010) ขั้นตอนการควบคุมสามได้ดำเนินการให้มีประสิทธิภาพวิธีฆ่าเชื้อพื้นผิว: โรงงานฆ่าเชื้อ (1)ตัวอย่างเนื้อเยื่อนำ 96 h postinoculation (P.I.) (ด้วยการ gusAmarkedต้องใช้) ถูกตรวจสอบ โดยแสง microscopy หลังย้อมสี(2) เนื้อเยื่อฆ่าเชื้อที่ถูกวางใน 1 นาทีลงบนแผ่นที่ประกอบด้วยLGI ลบและแผ่นก็ incubated ที่ 28 ◦C, (3) ล้างโซลูชั่นจากล้างสุดท้ายถูกอ่างบนแผ่น LGIการกำหนดขอบเขตของสนามทั้งหมด (rhizoplane และประชากร endophytic) ของกล้าไม้ inoculated อีกชุดplantlets ถูกเอาออกจาก agar รากมี rinsed ด้วยใส่น้ำกลั่น และประมวลผลดังกล่าว โดยไม่ต้องฆ่าเชื้อพื้นผิวRhizoplane ประชากรถูกตามลบภายในประชากรจากรวมแบคทีเรียนับกำหนดโดยผิวฆ่าเชื้อ (Gyaneshwar et al., 2001)มีการเก็บเกี่ยวพืช inoculated ด้วยต้องใช้สตริคแอ 5541/pRGS561และแยกเป็นรากและลำต้น ทดสอบกิจกรรม GUSทุกวันในช่วงสัปดาห์แรกหลัง จาก inoculation และ ในช่วงเวลาสามวันหลังจากนั้น พืชถูกเอาออกอย่างระมัดระวังจากการเจริญเติบโตปานกลางและรากถูกเบา ๆ ล้าง ด้วยน้ำยาฆ่าเชื้อตามลำดับล้าง agar ที่เหลือเก็บ ทำขั้นตอน stainingออกตามที่อธิบายไว้โดย Jefferson et al. (1987) Inoculated ไม่ใช่มีวิเคราะห์พืชในช่วงเวลาเดียวกัน ตัวอย่างดีสังเกตหลังจากการย้อมสี และการถ่ายภาพใช้เป็น Carl Zeiss Photomicroscopeหลายตัวอย่างตรวจสอบทั้งโดยตรง หรือโดยใช้มือตัดส่วนของเนื้อเยื่อพืชที่แช่อยู่ใน agaroseบล็อก
การแปล กรุณารอสักครู่..
2.1 สิ่งมีชีวิตและการบำรุงรักษา
G. diazotrophicus PAL 5 (ATCC 49037) (Cavalcante และ
Döbereiner, 1988) และ? -glucuronidase ทำเครื่องหมาย G. diazotrophicus
ความเครียด UAP5541 / pRGS561 (ฟู-Ramírez et al., 1999) ได้รับการ
เก็บรักษาไว้ที่ 4 ◦Cกลางมันฝรั่ง (สเตฟานและคณะ ., 1991) กับ
กรด nalidixic (เอ็น) (15? กรัมมล-1) และเอ็นและ streptomycin (SM)
(45? กรัมมล-1) ตามลำดับ.
2.2 เงื่อนไขวัฒนธรรม
สายพันธุ์แบคทีเรียที่ถูกปลูกในขวด (1 ลิตร) ที่มีขนาด 250 ml ของ
กลาง LGI (สเตฟาน et al., 1991) กับกลีเซอรอล (10 GL-1) และยีสต์
สารสกัดจาก (1 GL-1) ที่ pH 6.0 อุณหภูมิในการสับเปลี่ยน เครื่องปั่นที่ 200 รอบต่อนาทีและ 30 ◦C
เวลา 48 ชั่วโมง.
2.3 การเตรียมหัวเชื้อ
ในการศึกษารูปแบบการล่าอาณานิคมของแบคทีเรียเชื้อวัฒนธรรม
ของ G. diazotrophicus PAL 5 หรือ UAP 5541 / pRGS561 ถูกปั่น
และ resuspended ในปริมาณเดียวกันของค่า pH 6.0 สารละลายฟอสเฟต
บัฟเฟอร์ (พีบีเอส) และใช้เป็น inocula (Luna et al., 2010) สำหรับเรือนกระจก
ทดลองวัฒนธรรมแบคทีเรีย (ประมาณ 1.109 CFU มล-1)
ถูกนำมาใช้เป็น inocula.
2.4 การทดลองพืช
สองชนิดของการทดลองได้ดำเนินการฉีดวัคซีนมะเขือเทศ
พืช (lycopersicum esculentum พันธุ์ "ซูเปอร์แมน" Seminis.) หนึ่งที่จะ
ประเมินรูปแบบการตั้งรกรากของ G. diazotrophicus PAL 5 หรือ UAP
5541 / pRGS561 ภายใต้เงื่อนไข gnotobiotic; และอีกคนหนึ่ง
ที่จะทดสอบผลผลิตโดยการฉีดวัคซีนด้วย G. diazotrophicus PAL 5 ใน
เรือนกระจก.
2.4.1 การทดลองรกราก
เมล็ดมะเขือเทศถูกฆ่าเชื้อพื้นผิวที่มีเอทานอล 70% สำหรับ
5 นาทีตามด้วยการล้างด้วยน้ำสะอาดผ่านการฆ่าเชื้อและการแช่ใน
โซเดียมไฮโปคลอไรต์ 2% เป็นเวลา 10 นาทีตามด้วยสามล้างด้วย
น้ำหมัน เมล็ดงอกเป็นเวลา 4 วันที่ 28 ◦Cในที่มืด
บนอาหารกึ่งของแข็ง (0.5% วุ้น) ต้นกล้าที่ถูกแช่อยู่ใน
ปริมาณที่เหมาะสมของเชื้อแบคทีเรีย (G. diazotrophicus PAL
5 หรือ UAP 5541 / pRGS561) ที่มีอย่างต่อเนื่องเขย่าเป็นเวลา 10 นาที เชิงลบ
ควบคุมถูกแช่อยู่ในปริมาณที่เหมาะสมของการฆ่าเชื้อ
พีเอช 6.0 พีบีเอส ต้นกล้าเชื้อถูกวางลงในขวดที่มี
ขนาด 100 ml ของกลางFahräeusกึ่งของแข็ง (0.5% วุ้น) พืช
ที่ปลูกในห้องควบคุมการเจริญเติบโตภายใต้แสง / รอบมืดของ
16 และ 8 ชั่วโมงตามลำดับวันที่ 28 ◦C 25 วัน สามอิสระ
ทดลองกับสามการรักษาแต่ละ (ที่ไม่ใช่เชื้อควบคุม
เชื้อด้วย G. diazotrophicus PAL 5 และเชื้อด้วย G. diazotrophicus
UAP 5541 / pRGS561) และ 50 ต้น / การรักษาได้รับการ
ดำเนินการ.
พืชเก็บเกี่ยวสองวันหลังจากการฉีดวัคซีนของต้นกล้า
( เมื่อมันเป็นไปได้ที่จะแยกรากและลำต้น) แล้วที่ 2-3
ช่วงวันที่ รากและลำต้นถูกแยกออกแล้ว สำหรับแต่ละเนื้อเยื่อ
สามตัวอย่างที่ถูกรวมกันและสามซ้ำของเนื้อเยื่อ
ตัวอย่างที่เก็บรวบรวม (9 พืชแต่ละครั้ง) เพื่อตรวจสอบค่าเฉลี่ยของ
การล่าอาณานิคมและน้ำหนักสด (FW) การตรวจสอบเอนโดไฟท์
ประชากรเนื้อเยื่อพืชได้รับการล้างด้วยน้ำกลั่นผ่านการฆ่าเชื้อ
และฆ่าเชื้อด้วยโซเดียมไฮโปคลอไรต์ 2% สำหรับสามนาที
กับการกวนคงที่สำหรับรากและ 2 นาทีสำหรับลำต้น ตัวอย่าง
ถูกล้างแล้วสี่ครั้งด้วยน้ำและฆ่าเชื้อด้วยตนเอง
บดโดยใช้ครกและสาก homogenates ถูก
resuspended ใน 1 มิลลิลิตรของพีบีเอสและการ vortex นี้ถูกระงับ 10
เท่าปรับลดลำดับและชุบบนจานอาหารเลี้ยงเชื้อ LGI มีเอ็น,
Sm X-Gluc (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide
เกลือ cyclohexylammonium 40? กรัมมล-1 ) สำหรับสายพันธุ์ gusA ทำเครื่องหมายหรือ
เอ็นสำหรับสายพันธุ์ PAL 5. หน่วยการสร้างอาณานิคมนับหลังจากบ่ม
ที่อุณหภูมิ 28 ◦Cเป็นเวลา 3 วัน . ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดย Luna, et al
(2010) สามขั้นตอนการควบคุมได้ดำเนินการให้มีประสิทธิภาพ
ของวิธีการฆ่าเชื้อพื้นผิว (1) การฆ่าเชื้อพืช
ตัวอย่างเนื้อเยื่อนำ 96 ชั่วโมง postinoculation (PI) (กับ gusAmarked
สายพันธุ์) ถูกตั้งข้อสังเกตจากแสง กล้องจุลทรรศน์หลังจากการย้อมสี,
(2) การฆ่าเชื้อเนื้อเยื่อถูกวางไว้เป็นเวลา 1 นาทีใส่ลงในจานที่มี
LGI ออกและแผ่นบ่มที่อุณหภูมิ 28 ◦C (3) การซัก
ล้างการแก้ปัญหาจากที่ผ่านมาเป็นที่เพาะเลี้ยงบนจาน LGI.
เพื่อกำหนดขอบเขตของ การล่าอาณานิคมทั้งหมด (rhizoplane และ
ประชากรเอนโดไฟต์) ของต้นกล้าเชื้อ, ชุดของอีก
ต้นถูกถอดออกจากวุ้น รากถูกล้างด้วย
น้ำกลั่นผ่านการฆ่าเชื้อและประมวลผลดังกล่าวข้างต้นโดยไม่ต้องฆ่าเชื้อพื้นผิว.
ประชากร Rhizoplane ถูกกำหนดโดยการลบ
ประชากรภายในจากแบคทีเรียรวมกำหนด
โดยไม่ต้องฆ่าเชื้อพื้นผิว (Gyaneshwar et al., 2001).
พืชเชื้อด้วยความเครียด UAP 5541 / pRGS561 เก็บเกี่ยว
และแยกออกเป็นรากและลำต้น กิจกรรม GUS ได้รับการทดสอบ
ในชีวิตประจำวันในช่วงสัปดาห์แรกหลังการฉีดวัคซีนและในช่วงเวลาสามวัน
หลังจากนั้น พืชที่ถูกถอดออกอย่างระมัดระวังจากการเจริญเติบโตของ
กลางและรากถูกล้างเบา ๆ ด้วยน้ำหมันในการสั่งซื้อ
เพื่อล้างวุ้นที่เหลือออกไป ขั้นตอนการย้อมสีที่ได้รับการดำเนิน
การตามที่อธิบายไว้โดยเจฟเฟอร์สันและคณะ (1987) ไม่เชื้อ
พืชที่ได้มาวิเคราะห์ในช่วงเวลาเดียวกัน ตัวอย่างที่ถูก
ตั้งข้อสังเกตหลังจากการย้อมสีและถ่ายภาพโดยใช้เลนส์ Carl Zeiss Photomicroscope.
ตัวอย่างหลายมีการตรวจสอบไม่ว่าจะโดยตรงหรือ
โดยใช้ส่วนมือตัดของเนื้อเยื่อพืชแช่อยู่ใน agarose
บล็อก
G. diazotrophicus PAL 5 (ATCC 49037) (Cavalcante และ
Döbereiner, 1988) และ? -glucuronidase ทำเครื่องหมาย G. diazotrophicus
ความเครียด UAP5541 / pRGS561 (ฟู-Ramírez et al., 1999) ได้รับการ
เก็บรักษาไว้ที่ 4 ◦Cกลางมันฝรั่ง (สเตฟานและคณะ ., 1991) กับ
กรด nalidixic (เอ็น) (15? กรัมมล-1) และเอ็นและ streptomycin (SM)
(45? กรัมมล-1) ตามลำดับ.
2.2 เงื่อนไขวัฒนธรรม
สายพันธุ์แบคทีเรียที่ถูกปลูกในขวด (1 ลิตร) ที่มีขนาด 250 ml ของ
กลาง LGI (สเตฟาน et al., 1991) กับกลีเซอรอล (10 GL-1) และยีสต์
สารสกัดจาก (1 GL-1) ที่ pH 6.0 อุณหภูมิในการสับเปลี่ยน เครื่องปั่นที่ 200 รอบต่อนาทีและ 30 ◦C
เวลา 48 ชั่วโมง.
2.3 การเตรียมหัวเชื้อ
ในการศึกษารูปแบบการล่าอาณานิคมของแบคทีเรียเชื้อวัฒนธรรม
ของ G. diazotrophicus PAL 5 หรือ UAP 5541 / pRGS561 ถูกปั่น
และ resuspended ในปริมาณเดียวกันของค่า pH 6.0 สารละลายฟอสเฟต
บัฟเฟอร์ (พีบีเอส) และใช้เป็น inocula (Luna et al., 2010) สำหรับเรือนกระจก
ทดลองวัฒนธรรมแบคทีเรีย (ประมาณ 1.109 CFU มล-1)
ถูกนำมาใช้เป็น inocula.
2.4 การทดลองพืช
สองชนิดของการทดลองได้ดำเนินการฉีดวัคซีนมะเขือเทศ
พืช (lycopersicum esculentum พันธุ์ "ซูเปอร์แมน" Seminis.) หนึ่งที่จะ
ประเมินรูปแบบการตั้งรกรากของ G. diazotrophicus PAL 5 หรือ UAP
5541 / pRGS561 ภายใต้เงื่อนไข gnotobiotic; และอีกคนหนึ่ง
ที่จะทดสอบผลผลิตโดยการฉีดวัคซีนด้วย G. diazotrophicus PAL 5 ใน
เรือนกระจก.
2.4.1 การทดลองรกราก
เมล็ดมะเขือเทศถูกฆ่าเชื้อพื้นผิวที่มีเอทานอล 70% สำหรับ
5 นาทีตามด้วยการล้างด้วยน้ำสะอาดผ่านการฆ่าเชื้อและการแช่ใน
โซเดียมไฮโปคลอไรต์ 2% เป็นเวลา 10 นาทีตามด้วยสามล้างด้วย
น้ำหมัน เมล็ดงอกเป็นเวลา 4 วันที่ 28 ◦Cในที่มืด
บนอาหารกึ่งของแข็ง (0.5% วุ้น) ต้นกล้าที่ถูกแช่อยู่ใน
ปริมาณที่เหมาะสมของเชื้อแบคทีเรีย (G. diazotrophicus PAL
5 หรือ UAP 5541 / pRGS561) ที่มีอย่างต่อเนื่องเขย่าเป็นเวลา 10 นาที เชิงลบ
ควบคุมถูกแช่อยู่ในปริมาณที่เหมาะสมของการฆ่าเชื้อ
พีเอช 6.0 พีบีเอส ต้นกล้าเชื้อถูกวางลงในขวดที่มี
ขนาด 100 ml ของกลางFahräeusกึ่งของแข็ง (0.5% วุ้น) พืช
ที่ปลูกในห้องควบคุมการเจริญเติบโตภายใต้แสง / รอบมืดของ
16 และ 8 ชั่วโมงตามลำดับวันที่ 28 ◦C 25 วัน สามอิสระ
ทดลองกับสามการรักษาแต่ละ (ที่ไม่ใช่เชื้อควบคุม
เชื้อด้วย G. diazotrophicus PAL 5 และเชื้อด้วย G. diazotrophicus
UAP 5541 / pRGS561) และ 50 ต้น / การรักษาได้รับการ
ดำเนินการ.
พืชเก็บเกี่ยวสองวันหลังจากการฉีดวัคซีนของต้นกล้า
( เมื่อมันเป็นไปได้ที่จะแยกรากและลำต้น) แล้วที่ 2-3
ช่วงวันที่ รากและลำต้นถูกแยกออกแล้ว สำหรับแต่ละเนื้อเยื่อ
สามตัวอย่างที่ถูกรวมกันและสามซ้ำของเนื้อเยื่อ
ตัวอย่างที่เก็บรวบรวม (9 พืชแต่ละครั้ง) เพื่อตรวจสอบค่าเฉลี่ยของ
การล่าอาณานิคมและน้ำหนักสด (FW) การตรวจสอบเอนโดไฟท์
ประชากรเนื้อเยื่อพืชได้รับการล้างด้วยน้ำกลั่นผ่านการฆ่าเชื้อ
และฆ่าเชื้อด้วยโซเดียมไฮโปคลอไรต์ 2% สำหรับสามนาที
กับการกวนคงที่สำหรับรากและ 2 นาทีสำหรับลำต้น ตัวอย่าง
ถูกล้างแล้วสี่ครั้งด้วยน้ำและฆ่าเชื้อด้วยตนเอง
บดโดยใช้ครกและสาก homogenates ถูก
resuspended ใน 1 มิลลิลิตรของพีบีเอสและการ vortex นี้ถูกระงับ 10
เท่าปรับลดลำดับและชุบบนจานอาหารเลี้ยงเชื้อ LGI มีเอ็น,
Sm X-Gluc (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide
เกลือ cyclohexylammonium 40? กรัมมล-1 ) สำหรับสายพันธุ์ gusA ทำเครื่องหมายหรือ
เอ็นสำหรับสายพันธุ์ PAL 5. หน่วยการสร้างอาณานิคมนับหลังจากบ่ม
ที่อุณหภูมิ 28 ◦Cเป็นเวลา 3 วัน . ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดย Luna, et al
(2010) สามขั้นตอนการควบคุมได้ดำเนินการให้มีประสิทธิภาพ
ของวิธีการฆ่าเชื้อพื้นผิว (1) การฆ่าเชื้อพืช
ตัวอย่างเนื้อเยื่อนำ 96 ชั่วโมง postinoculation (PI) (กับ gusAmarked
สายพันธุ์) ถูกตั้งข้อสังเกตจากแสง กล้องจุลทรรศน์หลังจากการย้อมสี,
(2) การฆ่าเชื้อเนื้อเยื่อถูกวางไว้เป็นเวลา 1 นาทีใส่ลงในจานที่มี
LGI ออกและแผ่นบ่มที่อุณหภูมิ 28 ◦C (3) การซัก
ล้างการแก้ปัญหาจากที่ผ่านมาเป็นที่เพาะเลี้ยงบนจาน LGI.
เพื่อกำหนดขอบเขตของ การล่าอาณานิคมทั้งหมด (rhizoplane และ
ประชากรเอนโดไฟต์) ของต้นกล้าเชื้อ, ชุดของอีก
ต้นถูกถอดออกจากวุ้น รากถูกล้างด้วย
น้ำกลั่นผ่านการฆ่าเชื้อและประมวลผลดังกล่าวข้างต้นโดยไม่ต้องฆ่าเชื้อพื้นผิว.
ประชากร Rhizoplane ถูกกำหนดโดยการลบ
ประชากรภายในจากแบคทีเรียรวมกำหนด
โดยไม่ต้องฆ่าเชื้อพื้นผิว (Gyaneshwar et al., 2001).
พืชเชื้อด้วยความเครียด UAP 5541 / pRGS561 เก็บเกี่ยว
และแยกออกเป็นรากและลำต้น กิจกรรม GUS ได้รับการทดสอบ
ในชีวิตประจำวันในช่วงสัปดาห์แรกหลังการฉีดวัคซีนและในช่วงเวลาสามวัน
หลังจากนั้น พืชที่ถูกถอดออกอย่างระมัดระวังจากการเจริญเติบโตของ
กลางและรากถูกล้างเบา ๆ ด้วยน้ำหมันในการสั่งซื้อ
เพื่อล้างวุ้นที่เหลือออกไป ขั้นตอนการย้อมสีที่ได้รับการดำเนิน
การตามที่อธิบายไว้โดยเจฟเฟอร์สันและคณะ (1987) ไม่เชื้อ
พืชที่ได้มาวิเคราะห์ในช่วงเวลาเดียวกัน ตัวอย่างที่ถูก
ตั้งข้อสังเกตหลังจากการย้อมสีและถ่ายภาพโดยใช้เลนส์ Carl Zeiss Photomicroscope.
ตัวอย่างหลายมีการตรวจสอบไม่ว่าจะโดยตรงหรือ
โดยใช้ส่วนมือตัดของเนื้อเยื่อพืชแช่อยู่ใน agarose
บล็อก
การแปล กรุณารอสักครู่..
2.1 . สิ่งมีชีวิตและการบำรุงรักษา
G diazotrophicus พัล 5 ( ATCC 49037 ) ( cavalcante และ
D ö bereiner , 1988 ) และ ที่มีอวัยวะเครื่องหมายกรัม diazotrophicus
เมื่อย uap5541 / prgs561 ( Fuentes Ram í rez et al . , 1999 )
4 C ไว้ที่◦มันฝรั่งขนาดกลาง ( สตีเฟ่น et al . , 1991 ) กับ
สะพานกรุงธน ( นานาชาติ ) ( 15 กรัมต่อมิลลิลิตรและ− 1 ) นัล และ streptomycin ( SM )
( 45 กรัมต่อมิลลิลิตร− 1 ) ตามลำดับ .
2.2 . สภาพการเลี้ยง
แบคทีเรียสายพันธุ์ปลูกในขวด ( 1 ลิตร ) ประกอบด้วย
lgi ขนาดกลาง 250 ml ( สตีเฟ่น et al . , 1991 ) กับกลีเซอรอล ( 10 g L − 1 ) และสารสกัดจากยีสต์
( 1 G L − 1 ) ที่ pH 6.0 ในเครื่องปั่นซึ่งทำให้หมุนรอบที่ 200 รอบต่อนาทีและ 30 ◦ C
เป็นเวลา 48 ชั่วโมง
2.3 การเตรียมเชื้อ
ศึกษาการรูปแบบของแบคทีเรีย , วัฒนธรรม
G . diazotrophicus พัล 5 หรือ uap เอเซีย / prgs561 ไฟฟ้า
คือและ resuspended ในปริมาณเดียวกันของเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์พีเอช 6.0
( PBS ) และใช้เป็น inocula ( ลูน่า et al . , 2010 ) สำหรับเรือนกระจก
ทดลองวัฒนธรรมแบคทีเรีย ( ประมาณ 1.109 CFU ml − 1 ) ถูกใช้เป็น inocula
.
2.4 . การทดลองปลูก
สองประเภททดลองณ
( lycopersicum มะเขือเทศพืชมะเขือเทศพันธุ์ " ซุปเปอร์แมน " เซมินิสหนึ่ง
)ประเมินการล่าอาณานิคมแบบกรัม diazotrophicus พัล 5 หรือ uap
เอเซีย / prgs561 ภายใต้เงื่อนไข gnotobiotic ; และอีกหนึ่ง
ทดสอบผลผลิต โดยการ diazotrophicus พัล 5 กรัมในเรือนกระจก
.
เครื่องมือกำจัดเพื่อย้าย . กลุ่มการทดลอง
มะเขือเทศเมล็ดผิวฆ่าเชื้อด้วยแอลกอฮอล์ 70 %
5 นาที ตามด้วยหนึ่งล้างกับหมันน้ำและแช่ใน
2% โซเดียม ไฮโปคลอไรท์ 10 นาทีตามด้วยสามตัวกับ
น้ำหมัน เมล็ดงอก 4 วันที่ 28 ◦องศาเซลเซียสในที่มืด
บนกึ่งแข็งปานกลาง ( 0.5% วุ้น ) ต้นกล้าถูกแช่อยู่ในปริมาณที่เหมาะสมของเชื้อแบคทีเรีย
( G diazotrophicus พัล
5 หรือ uap เอเซีย / prgs561 ) คงสั่น 10 นาทีลบ
การควบคุมถูกแช่อยู่ในปริมาณที่เหมาะสมของ pH เป็นหมัน
60 PBS ต้นพืชถูกวางลงในขวดบรรจุ 100 มิลลิลิตร fahr
กึ่งแข็งและ EUS ขนาดกลาง ( 0.5% วุ้น ) พืชที่ปลูกในการควบคุมการเจริญเติบโต
ห้องภายใต้วัฏจักรมืดแสง /
16 และ 8 H ) ณ 28 ◦ เป็นเวลา 25 วัน 3 การทดลองอิสระ
กับการรักษาสามแต่ละ ( ไม่ใส่เชื้อในการควบคุม ,
5 กรัม diazotrophicus พาลใส่ Gdiazotrophicus
uap เอเซีย / prgs561 ) , และ 50 ต้น / รักษา คือ การปลูกเก็บเกี่ยว
.
2 วัน หลังจากต้นกล้า (
( เมื่อมันเป็นไปได้ที่จะแยกรากและลำต้น ) แล้วที่ 2 – 3
วันๆ รากและลำต้น จึงแยกออกจากกัน สำหรับแต่ละเนื้อเยื่อ
3 จำนวนรวมและ 3 ซ้ำตัวอย่างเนื้อเยื่อ
เก็บ ( 9 พืชแต่ละครั้ง ) เพื่อหาค่าเฉลี่ย
การล่าอาณานิคมและน้ำหนักสด ( FW ) การกำหนดประชากรรา
, เนื้อเยื่อพืชถูกล้างด้วยน้ำกลั่นฆ่าเชื้อและฆ่าเชื้อ
2 % โซเดียมไฮโปคลอไรต์ 3 นาที
ด้วยการกวนคงที่สำหรับ 2 นาที สำหรับรากและลำต้น ตัวอย่าง
แล้วล้าง 4 ครั้งกับฆ่าเชื้อน้ำและตนเอง
บดใช้ครกและสาก การ homogenates ถูก
resuspended ใน 1 มิลลิลิตร และภาพ vortexed . ช่วงล่างนี้ 10 -
พับเป็นเจือจาง และชุบ lgi วุ้นในจานที่มีเนล x-gluc ( 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-d-glucuronide
SM และ cyclohexylammonium เกลือ 40 กรัมต่อ − 1 ) gusa เครื่องหมายพัลความเครียดความเครียดหรือ
ร 5 . หน่วยสร้างอาณานิคมถูกนับหลังจากบ่ม
ที่ 28 ◦ C เป็นเวลา 3 วัน ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้าโดยลูน่า et al .
( 2010 ) สามขั้นตอนการควบคุมการเพื่อให้แน่ใจว่าประสิทธิภาพ
ของพื้นผิวฆ่าเชื้อโรควิธี : ( 1 ) ฆ่าเชื้อเนื้อเยื่อพืช
ตัวอย่าง 96 H เริ่ม ( PI ) ( กับ gusamarked
เมื่อย ) สังเกตได้จากกล้องจุลทรรศน์แสงหลังจากการย้อมสี
( 2 ) ฆ่าเชื้อเนื้อเยื่ออยู่ 1 นาทีที่มี
ใส่จาน lgi , ลบออกและแผ่นอุณหภูมิ 28 ◦ C ( 3 ) ล้าง
โซลูชั่นจากน้ำล้างสุดท้ายถูกเพาะเลี้ยงในจาน lgi .
เพื่อกำหนดขอบเขตของการรวม ( ประชากรไรโซแพลนและ
รา ) ของต้นพืชอีกชุด
ต้นเป็นลบออกจากวุ้น รากถูกล้างด้วยน้ำกลั่น
ปลอดเชื้อและประมวลผลตามข้างต้น โดยไม่มีการฆ่าเชื้อที่พื้นผิว ประชากรไรโซแพลนถูกกำหนดโดยลบ
ภายในประชากรจากจุลินทรีย์ทั้งหมดมุ่งมั่น
โดยไม่ต้องฆ่าเชื้อพื้นผิว ( gyaneshwar et al . , 2001 ) .
พืชใส่สายพันธุ์ uap เอเซีย / prgs561 เก็บ
แยกออกเป็นรากและลำต้น กิจกรรมกัสถูกทดสอบ
ทุกวันในช่วงสัปดาห์แรกหลังจากการฉีดวัคซีน และในช่วงเวลาสามวัน
หลังจากนั้น พืชที่ถูกลบออกอย่างระมัดระวังจากการเจริญเติบโต
รากปานกลางและค่อยๆ ล้างด้วยน้ำปลอดเชื้อเพื่อ
ล้างวุ้นที่เหลือออกไป ขั้นตอนการย้อม
ออกไปตามที่อธิบายไว้โดย Jefferson et al . ( 1987 ) ไม่ปลูกพืช
วิเคราะห์เป็นระยะเวลาเดียวกัน จำนวน
สังเกตหลังจากการย้อมสีและถ่ายภาพโดยใช้ Carl Zeiss photomicroscope .
หลายตัวอย่างทั้งโดยตรง หรือ
3 ?โดยใช้มือตัดเนื้อเยื่อพืชแช่ในส่วนของโรส
บล็อก
G diazotrophicus พัล 5 ( ATCC 49037 ) ( cavalcante และ
D ö bereiner , 1988 ) และ ที่มีอวัยวะเครื่องหมายกรัม diazotrophicus
เมื่อย uap5541 / prgs561 ( Fuentes Ram í rez et al . , 1999 )
4 C ไว้ที่◦มันฝรั่งขนาดกลาง ( สตีเฟ่น et al . , 1991 ) กับ
สะพานกรุงธน ( นานาชาติ ) ( 15 กรัมต่อมิลลิลิตรและ− 1 ) นัล และ streptomycin ( SM )
( 45 กรัมต่อมิลลิลิตร− 1 ) ตามลำดับ .
2.2 . สภาพการเลี้ยง
แบคทีเรียสายพันธุ์ปลูกในขวด ( 1 ลิตร ) ประกอบด้วย
lgi ขนาดกลาง 250 ml ( สตีเฟ่น et al . , 1991 ) กับกลีเซอรอล ( 10 g L − 1 ) และสารสกัดจากยีสต์
( 1 G L − 1 ) ที่ pH 6.0 ในเครื่องปั่นซึ่งทำให้หมุนรอบที่ 200 รอบต่อนาทีและ 30 ◦ C
เป็นเวลา 48 ชั่วโมง
2.3 การเตรียมเชื้อ
ศึกษาการรูปแบบของแบคทีเรีย , วัฒนธรรม
G . diazotrophicus พัล 5 หรือ uap เอเซีย / prgs561 ไฟฟ้า
คือและ resuspended ในปริมาณเดียวกันของเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์พีเอช 6.0
( PBS ) และใช้เป็น inocula ( ลูน่า et al . , 2010 ) สำหรับเรือนกระจก
ทดลองวัฒนธรรมแบคทีเรีย ( ประมาณ 1.109 CFU ml − 1 ) ถูกใช้เป็น inocula
.
2.4 . การทดลองปลูก
สองประเภททดลองณ
( lycopersicum มะเขือเทศพืชมะเขือเทศพันธุ์ " ซุปเปอร์แมน " เซมินิสหนึ่ง
)ประเมินการล่าอาณานิคมแบบกรัม diazotrophicus พัล 5 หรือ uap
เอเซีย / prgs561 ภายใต้เงื่อนไข gnotobiotic ; และอีกหนึ่ง
ทดสอบผลผลิต โดยการ diazotrophicus พัล 5 กรัมในเรือนกระจก
.
เครื่องมือกำจัดเพื่อย้าย . กลุ่มการทดลอง
มะเขือเทศเมล็ดผิวฆ่าเชื้อด้วยแอลกอฮอล์ 70 %
5 นาที ตามด้วยหนึ่งล้างกับหมันน้ำและแช่ใน
2% โซเดียม ไฮโปคลอไรท์ 10 นาทีตามด้วยสามตัวกับ
น้ำหมัน เมล็ดงอก 4 วันที่ 28 ◦องศาเซลเซียสในที่มืด
บนกึ่งแข็งปานกลาง ( 0.5% วุ้น ) ต้นกล้าถูกแช่อยู่ในปริมาณที่เหมาะสมของเชื้อแบคทีเรีย
( G diazotrophicus พัล
5 หรือ uap เอเซีย / prgs561 ) คงสั่น 10 นาทีลบ
การควบคุมถูกแช่อยู่ในปริมาณที่เหมาะสมของ pH เป็นหมัน
60 PBS ต้นพืชถูกวางลงในขวดบรรจุ 100 มิลลิลิตร fahr
กึ่งแข็งและ EUS ขนาดกลาง ( 0.5% วุ้น ) พืชที่ปลูกในการควบคุมการเจริญเติบโต
ห้องภายใต้วัฏจักรมืดแสง /
16 และ 8 H ) ณ 28 ◦ เป็นเวลา 25 วัน 3 การทดลองอิสระ
กับการรักษาสามแต่ละ ( ไม่ใส่เชื้อในการควบคุม ,
5 กรัม diazotrophicus พาลใส่ Gdiazotrophicus
uap เอเซีย / prgs561 ) , และ 50 ต้น / รักษา คือ การปลูกเก็บเกี่ยว
.
2 วัน หลังจากต้นกล้า (
( เมื่อมันเป็นไปได้ที่จะแยกรากและลำต้น ) แล้วที่ 2 – 3
วันๆ รากและลำต้น จึงแยกออกจากกัน สำหรับแต่ละเนื้อเยื่อ
3 จำนวนรวมและ 3 ซ้ำตัวอย่างเนื้อเยื่อ
เก็บ ( 9 พืชแต่ละครั้ง ) เพื่อหาค่าเฉลี่ย
การล่าอาณานิคมและน้ำหนักสด ( FW ) การกำหนดประชากรรา
, เนื้อเยื่อพืชถูกล้างด้วยน้ำกลั่นฆ่าเชื้อและฆ่าเชื้อ
2 % โซเดียมไฮโปคลอไรต์ 3 นาที
ด้วยการกวนคงที่สำหรับ 2 นาที สำหรับรากและลำต้น ตัวอย่าง
แล้วล้าง 4 ครั้งกับฆ่าเชื้อน้ำและตนเอง
บดใช้ครกและสาก การ homogenates ถูก
resuspended ใน 1 มิลลิลิตร และภาพ vortexed . ช่วงล่างนี้ 10 -
พับเป็นเจือจาง และชุบ lgi วุ้นในจานที่มีเนล x-gluc ( 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-d-glucuronide
SM และ cyclohexylammonium เกลือ 40 กรัมต่อ − 1 ) gusa เครื่องหมายพัลความเครียดความเครียดหรือ
ร 5 . หน่วยสร้างอาณานิคมถูกนับหลังจากบ่ม
ที่ 28 ◦ C เป็นเวลา 3 วัน ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้าโดยลูน่า et al .
( 2010 ) สามขั้นตอนการควบคุมการเพื่อให้แน่ใจว่าประสิทธิภาพ
ของพื้นผิวฆ่าเชื้อโรควิธี : ( 1 ) ฆ่าเชื้อเนื้อเยื่อพืช
ตัวอย่าง 96 H เริ่ม ( PI ) ( กับ gusamarked
เมื่อย ) สังเกตได้จากกล้องจุลทรรศน์แสงหลังจากการย้อมสี
( 2 ) ฆ่าเชื้อเนื้อเยื่ออยู่ 1 นาทีที่มี
ใส่จาน lgi , ลบออกและแผ่นอุณหภูมิ 28 ◦ C ( 3 ) ล้าง
โซลูชั่นจากน้ำล้างสุดท้ายถูกเพาะเลี้ยงในจาน lgi .
เพื่อกำหนดขอบเขตของการรวม ( ประชากรไรโซแพลนและ
รา ) ของต้นพืชอีกชุด
ต้นเป็นลบออกจากวุ้น รากถูกล้างด้วยน้ำกลั่น
ปลอดเชื้อและประมวลผลตามข้างต้น โดยไม่มีการฆ่าเชื้อที่พื้นผิว ประชากรไรโซแพลนถูกกำหนดโดยลบ
ภายในประชากรจากจุลินทรีย์ทั้งหมดมุ่งมั่น
โดยไม่ต้องฆ่าเชื้อพื้นผิว ( gyaneshwar et al . , 2001 ) .
พืชใส่สายพันธุ์ uap เอเซีย / prgs561 เก็บ
แยกออกเป็นรากและลำต้น กิจกรรมกัสถูกทดสอบ
ทุกวันในช่วงสัปดาห์แรกหลังจากการฉีดวัคซีน และในช่วงเวลาสามวัน
หลังจากนั้น พืชที่ถูกลบออกอย่างระมัดระวังจากการเจริญเติบโต
รากปานกลางและค่อยๆ ล้างด้วยน้ำปลอดเชื้อเพื่อ
ล้างวุ้นที่เหลือออกไป ขั้นตอนการย้อม
ออกไปตามที่อธิบายไว้โดย Jefferson et al . ( 1987 ) ไม่ปลูกพืช
วิเคราะห์เป็นระยะเวลาเดียวกัน จำนวน
สังเกตหลังจากการย้อมสีและถ่ายภาพโดยใช้ Carl Zeiss photomicroscope .
หลายตัวอย่างทั้งโดยตรง หรือ
3 ?โดยใช้มือตัดเนื้อเยื่อพืชแช่ในส่วนของโรส
บล็อก
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- แปล
- คุณเคยมาเที่ยวประเทศไทยไหม
- คุณหมายความว่าอย่างไร
- They have a mission to look for three fo
- โอกาส
- You will remain anonymous.
- คุณไม่จำเป็นต้องทำเหมือนคุณไม่แคร์ฉันก็ไ
- Through Guernsey by
- อยู่บริเวณจังหวัดสุโขทัยปัจจุบัน
- Including
- 수업이 시작습니까
- แหล่งที่อยู่
- ถ้าคุณจะเกลียดฉัน
- การโจมตีของฉลามอาจทำให้เกิดการสูญเสียชีว
- รบกวน
- ที่มหาวิทยาลัย
- ฉันปวดหัวไมเกรนมาก
- low-density
- โรงพยาบาลส่งเสริมสุขภาพ 12 แห่ง
- สอบปลายภาค
- Wait
- ฉันเคยตกหลุมรักเขาแค่ 20 วัน
- Economic and political forces have signi
- blame
