For insoluble protein extraction an

For insoluble protein extraction and analysis, Acetone/TCA precipi- tation protocol was used (Fic et al., 2010). Briefly, insoluble proteins were homogenizing with 70% formic acid (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL), followed by centrifugation at 100,000 ×g for 1 h. Super- natant was collected and the formic acid of the supernatant was neu- tralized using the following ration (1 volumen of sample, 1 volumen of neutralization buffer and 1.8 volumenes 10 N of NaOH). Then, each volumen of sample was mixed with 10 volumenes of cold 10% TCA (Trichloroacetic acid; Thermo Fisher Scientific) in Acetone (Thermo Fisher Scientific) at −20 °C overnight. Next, samples were centrifugated at 15,000 ×g for 10 min and the supernatant was removed. Then, cold acetone was added and incubated at −20 °C for 10 min. After that, samples were centrifugated at 15,000 ×g for 15 min. Supernatant was removed and the pellet was air-dried. The pellet was re-solubilized in T-per (Thermo Fisher Scientific) extraction buffer (150 mg/ml), com- plemented with a protease inhibitor (Complete Mini Protease InhibitorTablets, Roche Diagnostics GmbH) and phosphatase inhibitor (5 mmol/l, Sigma-Aldrich).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สำหรับการสกัดโปรตีนที่ไม่ละลายน้ำและการวิเคราะห์อะซิโตน / TCA โปรโตคอล precipi-ช่อถูกนำมาใช้ (ทวีตอัล. 2010) สั้นโปรตีนที่ไม่ละลายน้ำถูกเชื่อมการผสมยาง 70% กรดฟอร์มิ (เทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์, อิลลินอยส์) ตามด้วยการหมุนเหวี่ยงที่ 100,000 ×กรัมเป็นเวลา 1 ชั่วโมงซุปเปอร์ Natant ถูกเก็บรวบรวมและกรดฟอร์มิของสารละลายเป็น Neu-tralized ใช้ปันส่วนดังต่อไปนี้ (1 Volumen ของตัวอย่าง 1 Volumen ของบัฟเฟอร์การวางตัวเป็นกลางและ 1.8 volumenes 10 n ของ NaOH) แล้ว Volumen ของกลุ่มตัวอย่างแต่ละคนถูกผสมกับ 10 volumenes เย็น TCA 10% (กรดไตรคลอโร; เทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์) ในอะซิโตน (เทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์) ที่ -20 ° C ในชั่วข้ามคืน ถัดไปตัวอย่างที่ถูก centrifugated 15,000 ×กรัมเป็นเวลา 10 นาทีและใสจะถูกลบออก แล้วอะซิโตนเย็นถูกบันทึกและบ่มที่อุณหภูมิ -20 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที หลังจากนั้นกลุ่มตัวอย่างถูก centrifugated ที่ 15,000 ×กรัมเป็นเวลา 15 นาที ใสจะถูกลบออกและเม็ดที่อากาศแห้ง เม็ดเป็นอีกครั้งที่ละลายในเสื้อต่อ (เทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์) กันชนสกัด (150 mg / ml)com-plemented ด้วยสารยับยั้งโปรติเอส (protease สมบูรณ์ inhibitortablets มินิวินิจฉัยโรช GmbH) และฟอสฟายับยั้ง (5 มิลลิโมล / ลิตร, Sigma-Aldrich)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ละลายโปรตีนสกัดและวิเคราะห์ อะซิ โตน/TCA precipi-tation โพรโทคอลที่ถูกใช้ (Fic et al., 2010) สั้น ๆ โปรตีนไม่ละลายน้ำถูก homogenizing ด้วย 70% กรด (เทอร์โม Fisher วิทยาศาสตร์ ร็อคฟอร์ด IL), ตาม ด้วย centrifugation ที่ 100000 × g สำหรับ 1 h ซุปเปอร์-natant ถูกรวบรวม และกรดของ supernatant ไม่ใช้อาหารต่อไปนี้ (volumen 1 ของตัวอย่าง) volumen 1 บัฟเฟอร์ปฏิกิริยาสะเทินและ 1.8 volumenes 10 N ของ NaOH tralized neu แล้ว แต่ละ volumen อย่างถูกผสมกับ volumenes 10 เย็น 10% TCA (Trichloroacetic กรด เทอร์โม Fisher วิทยาศาสตร์) ในอะซีโตน (เทอร์โม Fisher วิทยาศาสตร์) ที่ −20 ° C นอน ถัดไป ตัวอย่าง centrifugated ที่ 15000 × g 10 นาทีและ supernatant ถูกเอาออก แล้ว อะซิโตนเย็นถูกเพิ่ม และ incubated ที่ −20 ° C สำหรับ 10 นาที หลังจากนั้น ตัวอย่างดี centrifugated ที่ 15000 × g สำหรับ 15 นาที Supernatant ถูกเอาออก และเม็ดถูก air-dried เม็ดถูกใหม่ solubilized ใน T-ต่อ (เทอร์โม Fisher วิทยาศาสตร์) แยกบัฟเฟอร์ (150 mg/ml), com-plemented รติเอสเตอร์ (InhibitorTablets รติเอสมินิสมบูรณ์ Roche วินิจฉัย GmbH) และสารยับยั้งฟอสฟาเตส (5 mmol/l ซิก Aldrich)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สำหรับการวิเคราะห์และการขุดโปรตีนละลายน้ำโปรโตคอล precipi - tation tca อะซีโตน/ใช้( FIC et al . 2010 ) เพียงชั่วครู่โปรตีนละลายน้ำไม่มีการผสมให้เข้ากันด้วย 70% แอซ - อิดกรด(แบบร้อนชาวประมงทางวิทยาศาสตร์, Rockford IL )ตามด้วยผลิตที่ G 100 , 000 x สำหรับ 1 ชั่วโมงSuper - natant ถูกเก็บรวบรวมและที่แอซ - อิดกรดของ supernatant ก็ถูกตระเตรียมขึ้นมาโดยใช้ tralized ปันส่วนต่อไปนี้:( 1 volumen ของตัวอย่าง, 1 volumen ของกระบวนการทำให้บัฟเฟอร์และ 1.8 volumenes 10 N ของโซดาไฟ) จากนั้นแต่ละ volumen ของตัวอย่างเป็นแบบผสมที่มี 10 volumenes ของเย็น 10% tca (กรด trichloroacetic แบบร้อนชาวประมงทางวิทยาศาสตร์)ในอะซีโตน(แบบร้อนชาวประมงทางวิทยาศาสตร์) c - 20 °พักค้างคืน ถัดไปตัวอย่างเป็น centrifugated ที่ G 15 , 000 x 10 นาทีและ supernatant ได้ถูกลบออกแล้ว จากนั้นอะซีโทนเย็นจะถูกเพิ่มและ incubated c - 20 °สำหรับ 10 นาทีหลังจากนั้นตัวอย่างเป็น centrifugated ที่ G 15 , 000 x 15 supernatant นาทีถูกลบออกและเม็ดที่เป็นแบบแห้ง เม็ดครั้ง solubilized ในบัฟเฟอร์ T - ต่อ(แบบร้อนชาวประมงทางวิทยาศาสตร์)การขุด( 150 มล.มก./)COM - plemented พร้อมด้วย protease ยาป้องกัน(มินิ protease inhibitortablets Roche การวินิจฉัยเสร็จสมบูรณ์ GmbH )และยาป้องกัน phosphatase ( sigma-aldrich 5 มิลลิโมล/ L )