Heterologous expression of laccase

Heterologous expression of laccase genes in Pichia pastoris. Data from the transcriptome analysis indicated that Lacc5 and Lacc12 were the main laccases active during fruiting body maturation and primordiation stages, respectively, whereas Lacc2, Lacc8, and Lacc11 were not expressed at any stage (Fig. 2C); in addition, Lacc2 and Lacc11 contained unusual active site arrangements (Fig.2A). Lacc6, which was ubiquitously expressed, is the most studied laccase in P. ostreatus [31]. Moreover, these laccases were scattered among the three phylogenetic groups: Lacc4, Lacc6, and Lacc11 in group I; Lacc12 in group II; and Lacc2 and Lacc5 in group III. Therefore, theses laccases were selected for further characterization. We constructed laccase expression vectors by cloning the six synthesized laccase genes adjacent to the AOX1 promoter in the Pichia expression vector pPICHOLI-2. Next, culture conditions for the production of laccase protein in P. pastoris GS115, using Lacc6 as a model gene, were investigated. In this system, methanol serves as the carbon source for yeast cell growth, as well as the inducer for gene expression. However, the methanol concentration needed to be optimized, as methanol exerts toxic effects on the cells on reaching a critical concentration in the culture medium.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ค่า heterologous ของ laccase ยีนใน Pichia pastoris ข้อมูลจากการวิเคราะห์ของ transcriptome ระบุว่า Lacc5 และ Lacc12 มี laccases หลักทำงานอยู่ระหว่าง fruiting ร่างกายพ่อแม่และระยะ primordiation ตามลำดับ ในขณะที่ Lacc2, Lacc8 และ Lacc11 ไม่แสดงในขั้นตอนใด ๆ (Fig. 2C); นอกจากนี้ Lacc2 และ Lacc11 ประกอบด้วยเว็บไซต์ใช้งานปกติจัด (Fig.2A) Lacc6 ซึ่งได้ ubiquitously แสดง เป็น laccase สุด studied ใน P. ostreatus [31] นอกจากนี้ laccases เหล่านี้กระจัดกระจายอยู่ทั่วในหมู่กลุ่ม phylogenetic สาม: Lacc4, Lacc6 และ Lacc11 ในกลุ่มฉัน Lacc12 ในกลุ่ม II และ Lacc2 และ Lacc5 ในกลุ่ม III ดังนั้น laccases ผลงานถูกเลือกสำหรับการจำแนกต่อไป เราสร้างเวกเตอร์นิพจน์ laccase โดยโคลน laccase สังเคราะห์ยีน 6 ติดกับโปรโมเตอร์ AOX1 ใน Pichia นิพจน์เวกเตอร์ pPICHOLI-2 วัฒนธรรมเงื่อนไขการผลิตโปรตีน laccase GS115, P. pastoris โดยใช้ Lacc6 เป็นการจำลองยีน ถูกสอบสวน ในระบบนี้ เมทานอลทำหน้าที่เป็นแหล่งคาร์บอนในการเจริญเติบโตของเซลล์ยีสต์ เป็น inducer สำหรับยีน อย่างไรก็ตาม เมทานอลความเข้มข้นตามต้องการเพื่อปรับให้เหมาะ เมทานอล exerts เซลล์บนถึงสมาธิสำคัญในสื่อวัฒนธรรมผลพิษ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การแสดงออกของยีน heterologous แลคเคสใน Pichia pastoris ข้อมูลจากการวิเคราะห์ยีนชี้ให้เห็นว่า Lacc5 และ Lacc12 เป็นเอนไซม์แลคเคสหลักที่ใช้งานในช่วงการเจริญเติบโตของร่างกายผลและขั้นตอน primordiation ตามลำดับในขณะที่ Lacc2, Lacc8 และ Lacc11 ไม่ได้แสดงในขั้นตอนใด (รูป 2C.); นอกจากนี้ Lacc2 และมีการเตรียมการ Lacc11 ใช้งานเว็บไซต์ที่ผิดปกติ (Fig.2A) Lacc6 ซึ่งได้รับการแสดงความ ubiquitously เป็นแลคเคสศึกษามากที่สุดในพีนางรม [31] นอกจากนี้เอนไซม์แลคเคสเหล่านี้กระจัดกระจายอยู่ในสามกลุ่ม phylogenetic: Lacc4, Lacc6 และ Lacc11 ในกลุ่มของฉัน; Lacc12 อยู่ในกลุ่มที่สอง; และ Lacc2 Lacc5 และกลุ่มที่สาม ดังนั้นวิทยานิพนธ์เอนไซม์แลคเคสถูกเลือกสำหรับตัวละครต่อไป เราสร้างเวกเตอร์แสดงออกแลคเคสจากโคลนหกสังเคราะห์ยีนแลคเคสที่อยู่ติดกับก่อการ AOX1 ในการแสดงออก Pichia เวกเตอร์ pPICHOLI-2 ถัดไปเงื่อนไขวัฒนธรรมสำหรับการผลิตโปรตีนแลคเคสในพี pastoris GS115 ใช้ Lacc6 เป็นยีนแบบถูกตรวจสอบ ในระบบนี้เมทานอลทำหน้าที่เป็นแหล่งคาร์บอนสำหรับการเจริญเติบโตของเซลล์ยีสต์เช่นเดียวกับการชักนำการแสดงออกของยีน แต่ความเข้มข้นของเมทานอลที่จำเป็นในการเพิ่มประสิทธิภาพเช่นเมทานอลออกแรงผลกระทบที่เป็นพิษต่อเซลล์ในการเข้าถึงความเข้มข้นที่สำคัญในสื่อวัฒนธรรม

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การแสดงออกของยีนชนิด - pichia pastoris . ข้อมูลที่ได้จากการวิเคราะห์ พบว่า lacc5 ทราน ริปโตม และ lacc12 เป็น laccases หลักที่ใช้ในร่างกาย การออกดอกและขั้นตอน , primordiation ตามลำดับ ในขณะที่ lacc2 lacc8 , และ lacc11 ไม่ได้แสดงในขั้นตอนใด ๆ ( รูปที่ 2 ) นอกจากนี้ lacc2 lacc11 ที่มีอยู่และการใช้งานเว็บไซต์ที่ผิดปกติ ( fig.2a ) lacc6 ,ซึ่งระหว่างที่แสดงออก คือ ส่วนใหญ่ศึกษาในหน้า - ปากมดลูก [ 31 ] นอกจากนี้ laccases เหล่านี้กระจายอยู่ใน 3 กลุ่ม ซึ่ง lacc4 lacc6 , และ lacc11 ในกลุ่มฉัน ; lacc12 ในกลุ่ม 2 และกลุ่ม และ lacc2 lacc5 III จึง laccases วิทยานิพนธ์เลือกสำหรับคุณสมบัติเพิ่มเติม- เราสร้างนิพจน์เวกเตอร์โดยการโคลนยีนสังเคราะห์ - 6 ติดกับโปรโมเตอร์ aox1 ในการแสดงออก pichia เวกเตอร์ ppicholi-2 . ต่อไปสภาพเพาะเลี้ยงเพื่อผลิตโปรตีนในหน้า - pastoris gs115 โดยใช้ lacc6 เป็นยีน รูปแบบ คือ ในระบบนี้ เมธาทำหน้าที่เป็นแหล่งคาร์บอนสำหรับการเจริญเติบโตของเซลล์ยีสต์เป็นเอนไซม์สำหรับการแสดงออกของยีน อย่างไรก็ตาม ความเข้มข้นของเมทานอลต้องถูกปรับเป็นเมทานอล exerts ผลกระทบที่เป็นพิษต่อเซลล์ ถึงความเข้มข้นที่สำคัญในวัฒนธรรมสื่อ