prior to separate statistical analy

prior to separate statistical analyses. For each
20 parameter, a mixed model analysis of variance CAnova) was performed on transformed data,
ที่รวมถึง terms for Run (random block effect) and Antibody.
From the Anova, geometric means were predicted for each antibody, along with statistically
plausible ranges (95% confidence intervals) for each mean. Planned comparisons of antibodies were
performed within the Anova. Comparisons are presented as ratios of the two antibodies compared, 25 again with 95% confidence intervals and p values. The ratios may also be interpreted as a fold
change, e.g. a ratio of 0.1 corresponds to a 90% decrease.
Geometric means were derived for each of the ฮิวเมไนซ์ antibodies and the chimeric control IMP731 for the binding แอฟฟินิตี้ (KD), shown in Table 4. The mean KD for H5L7 was
0.2075nM, a significant decrease of 92% (i.e. 10 fold decrease) with p

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ก่อนที่จะแยกวิเคราะห์ทางสถิติ สำหรับแต่ละทำตามข้อมูลแปรรูป 20 พารามิเตอร์ การผสมแบบจำลองวิเคราะห์ของต่างคาโนวา)เงื่อนไขที่รวมถึงรัน (บล็อกสุ่มผล) และแอนติบอดีจากการวิเคราะห์ความแปรปรวน หมายถึงเรขาคณิตคาดการณ์สำหรับแต่ละแอนติบอดี พร้อมทางสถิติ ช่วงเป็นไปได้ (ช่วงความเชื่อมั่น 95%) สำหรับค่าเฉลี่ยแต่ละ เปรียบเทียบแผนของแอนตี้ได้ ดำเนินการภายในการวิเคราะห์ความแปรปรวน มีแสดงเปรียบเทียบเป็นอัตราส่วนของแอนตี้สองเปรียบเทียบ 25 อีก ด้วยช่วงความเชื่อมั่น 95% และค่า p อัตรานอกจากนี้ยังอาจจะตีความเป็นกลีบ เปลี่ยน อัตราส่วน 0.1 สอดคล้องลดลง 90% เช่นหมายถึงเรขาคณิตได้รับสำหรับแต่ละแอนตี้ฮิวเมไนซ์และ chimeric ควบคุม IMP731 สำหรับแอฟฟินิตี้ผูก (KD), แสดงในตาราง 4 มีค่าเฉลี่ย KD สำหรับ H5L70.2075nM ลดลงอย่างมีนัยสำคัญของ 92% (เช่นพับ 10 ลดลง) กับ p < มาก 0.0001 เมื่อเปรียบเทียบกับ 30 IMP731 IMP731 จัดแสดงค่าเฉลี่ย KD ของ 2.76nM Afucosylated H5L7BW จัดแสดงรวมเทียบเท่า เป็น fucosylated H5L7 กับ KD เรขาคณิตของ 0.2179nM มีไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (p = 0.1790)ปรับปรุงในสังเกตสำหรับ H5L7 โดย IMP731 แอฟฟินิตี้เป็นส่วนใหญ่ ขับเคลื่อน โดยความแตกต่างในการปิดราคาของแอนตี้ที่สำหรับความล่าช้า-3-เบาะแส-His6 แสดงในตาราง 5 มี จะมีประมาณ 85% ลดลง (เช่นเกือบ 10 เท่าลดลง) ใน kd สำหรับ H5L7 35 IMP731 ซึ่งมีความสำคัญสูงทางสถิติการเปรียบเทียบ ไม่แตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่าง afucosylated H5L7BW และ H5L7 (p = 0.4408) ตาราง 4: สถิติการประเมินสำหรับ KD fucosylated และ afucosylated แอนติ-ความล่าช้า-3 รูปแปรผันs ผูกกับรีคอมบิแนนต์ฮิวเมนความล่าช้า-3-พระหมายถึงเรขาคณิตสำหรับ KD (nM)หมายถึงไม่มีชุดทรงเรขาคณิตแอนติบอดีต่ำกว่า 95% CI บน 95% CIH5L7 GRITS42382 2.08E-10 1.89E-10 2.28E-10H5L7BW GRITS42760 2.18E-10 1.98E-10 2.40E-10IMP731 020909 2.76E-09 2.51E-09 3.04E-09เปรียบเทียบของ KDKD เปรียบเทียบอัตราส่วนต่ำกว่า 95% CI บน 95% CI P ค่าH5L7BW-H5L7 1.0502 0.97268 1.13389 0.179H5L7-1MP731 0.07736 0.0715 0.0837 < .00015ตาราง 5: สถิติการประเมินสำหรับ kd fucosylated และ afucosylated แอนติ-ความล่าช้า-3 รูปแปรผันs ผูกกับรีคอมบิแนนต์ฮิวเมนความล่าช้า-3-พระหมายถึงเรขาคณิตสำหรับ kd (1/s)หมายถึงไม่มีชุดทรงเรขาคณิตแอนติบอดีต่ำกว่า 95% CI บน 95% CIH5L7 GRITS42382 3.95E-03 3.16E-03 4.94E-03H5L7BW GRITS42760 4.41E-03 3.53E-03 5.51E-03IMP731 020909 2.75E-02 2.20E-02 3.44E-02เปรียบเทียบของ kdKD เปรียบเทียบอัตราส่วนต่ำกว่า 95% CI บน 95% CI P ค่าH5L7BW-H5L7 1.11715 0.81531 1.53073 0.4408H5L7-1MP731 0.15478 0.11157 0.21471 < .000110ตัวอย่างที่ 3: การประเมินเอพิโทปรวมความล่าช้า-3-พระของ รูปแปรผันs ฮิวเมไนซ์ 3 แอนติ-ความล่าช้าเมื่อเปรียบเทียบกับ chimeric แอนติบอดี IMP731 ใช้ ProteOnTM การทำการทดลองผูกเอพิโทปกับ H5L7 เพื่อประเมินว่าเอพิโทป 15 3 ความล่าช้าที่ binds IMP731 ที่อยู่ตาม humanisation นอกจากนี้ การรวม เอพิโทป รูปแปรผันs ฮิวเมไนซ์ fucosylated และ afucosylated นอกจากนี้ยังมีการเปรียบเทียบเอพิโทปผูกถูกประเมินโดยใช้ ProteOnTM XPR36 (BioRadTM) biosensor โดยเครื่อง ประเมินว่าแอนตี้แอนติ-ความล่าช้า-3 ไม่สามารถผูกเข้ากันกับความล่าช้า-3-พระในคอมเพล็กซ์ มีแอนติบอดีที่จับบนผิวชิ ProteOnTM IMP731 และไม่ใช่การแข่งขัน murine แอนติบอดี 20 17B4 ถูกใช้เป็นตัวควบคุมในการทดสอบนี้แอนตี้จะทดสอบได้โดยใช้ชุด biotinylation Ez-ลิงค์-sulfo-NHS biotinylated แต่ละ biotinylated แอนติบอดีถูกจับบนเซลล์ขั้นตอนแยกต่างหากบนชิปที่ NLC neutravidin ใช้ในแนวตั้ง ฉีด หลังจากที่จับแอนติบอดี ผิวถูกบล็อก ด้วย biocytin ที่ 2.5 mg / ml ใช้ co -ฉีดโดยธรรมชาติการ ProteOn การเรียกใช้ซอฟต์แวร์สิ่งอำนวยความสะดวก ความล่าช้า 3 เบาะแส-His6 ถูกฉีดผ่านแอนตี้ coupled ที่ 100nM ตามแอนตี้ biotinylated สหประชาชาติที่ 100nM กับฉีดทั้งถูกแนวนอนเพื่อให้ความล่าช้า-3-ของเขาและแอนตี้การข้ามทั้งหมด 6 neutravidin จับแอนตี้ วิเคราะห์ 5 ถูกเรียกใช้ ที่ 25° c และ ใน HBS EP ระบบ ProteOn XPR36 โปรตีนโต้เรย์ วิเคราะห์ข้อมูลที่ดำเนินการโดยใช้รายงานจุดที่ถ่ายหลังจากฉีดความล่าช้า-3-พระ และรายงานสถานที่ถ่ายหลังจากฉีด analyte แอนติบอดี biotinylated สหประชาชาติ การตอบสนองโดยรวมมี คำนวณ โดยลบคำตอบเห็น ด้วยผูกแอนติบอดีจากการตอบสนองที่เห็นด้วย ความล่าช้า 3 เบาะแส His6 ผูก การสั่นพ้องบวกค่าหน่วย (RU) หมายความ ว่า แอนติบอดี analyte ฉีด 10 มาผูกกับความล่าช้า 3 เบาะแส-His6 complexed กับแอนติบอดี biotinylated บนจับ neutravidin พื้นผิว ส่อผูกที่ เอพิโทปs ไม่ใช่การแข่งขัน ไม่ตอบสนองหรือการตอบสนองเป็นค่าลบ หมายความ ว่า ฉีด analyte แอนติบอดีมาผูกกับความล่าช้า 3 เบาะแส-His6 complexed กับการ แอนติบอดีใน biotinylated บนผิวจับ neutravidin แอนตี้บ่งบอกผูกที่แข่งขัน เอพิโทปs15 รูปแปรผันs ฮิวเมไนซ์แอนติ-ความล่าช้า-3 (fucosylated และ afucosylated) ไม่สามารถผูกกับมนุษย์ความล่าช้า 3 เบาะแส-His6 ในคอมเพล็กซ์กับ IMP731 ตัวชี้ให้เห็นว่า เอพิโทปสำหรับความล่าช้า 3 เบาะแส-His6 ใช้ร่วมกัน และจึง อยู่ 17B4 murine แอนติบอดีไม่สามารถผูกเข้ากับมนุษย์ความล่าช้า 3 เบาะแส-His6 ในคอมเพล็กซ์กับ IMP731 substantiating ว่าแอนติบอดีนี้ไม่ใช่การแข่งขันสำหรับความล่าช้า 3 เบาะแส His6 ผูกกับ IMP731 ในทางกลับกัน แอนตี้ฮิวเมไนซ์จะผูกกับมนุษย์ความล่าช้า 3 เบาะแส-His6 ใน20 กับ 17B4ผลยืนยันว่า มีการไม่แก้ไขในเอพิโทป chimeric IMP731 และรูปแปรผันฮิวเมไนซ์ของ IMP731 ผ่านทดสอบในการทดลองนี้ การทดลองแสดงว่า มีไม่มีความแตกต่างระหว่าง fucosylated และ afucosylated แอนตี้สำหรับผูกตัวอย่าง 25 4: ผูกของแอนตี้แอนติ-ความล่าช้า-3 ฮิวเมไนซ์ recombinant cynomolgusสกุลลิงกังและลิงบาบูนเบาะแสความล่าช้า 3-ใช้ Biacore "T100 His6การรวมระหว่างเกิดปฏิกิริยาของแอนตี้แอนติ-ความล่าช้า-3 ฮิวเมไนซ์สำหรับ cynomolgus ทั้งสอง สกุลลิงกัง (cyno) และลิงบาบูนวททชเบาะแสความล่าช้า 3-His6 (ลำดับรหัสชุดหมายเลข 52 และ 53 ตามลำดับ) 30 ถูกประเมินโดยใช้ BiacoreTM T100 (GE HealthcareTM)โปรตีน A ถูก immobilised ในชิ CM5 โดย amine หลักคลัป แล้วใช้พื้นที่นี้เพื่อจับแอนตี้ฮิวเมไนซ์ Cynomolgus recombinant สร้างในบ้านสกุลลิงกังและลิงบาบูนเบาะแสความล่าช้า 3-His6 มีแล้วส่งผ่านแอนตี้จับ และถูกฟื้นฟูดำเนินการโดยใช้ 50mM NaOH ความล่าช้า 3 เบาะแส-His6 ถูกส่งผ่านที่ 16, 4, 1, 0.25 และ 0.0625nM 35 รวมเส้นโค้งถูกคู่กับบัฟเฟอร์ฉีด (เช่น OnM) การอ้างอิง และข้อมูลถูกติดตั้งซอฟต์แวร์วิเคราะห์ T100 ที่ใช้แบบ 1:1 การรันถูกดำเนินที่ 37° c ใช้ HBS EP เป็นบัฟเฟอร์ที่ใช้ H5L7, H5L7BW และ IMP731 ผูกกับแอฟฟินิตี้เทียบกับ macaque ตัวทั้ง cynomolgus และ ลิงบาบูนวททชเบาะแสความล่าช้า 3-His6 ข้อมูลถูกสร้างจากการทดลองแยก อย่างไรก็ตาม แอนติบอดี chimeric IMP731 ถูกใช้เป็นตัวควบคุมระหว่างการทดลอง ข้อมูลนี้บ่งชี้ว่า ทั้งสองไม่ใช่มนุษย์ถือ recombinant ความล่าช้า 3 orthologues ผูกกับ 5 H5L7 แอนตี้ได้รับมา ด้วย 10 พับปรับปรุงในแอฟฟินิตี้เมื่อเปรียบเทียบกับมนุษย์ความล่าช้า 3 recombinant เบาะแส-His6 (ลำดับ ID ไม่: 51) (H5L7: มนุษย์ความล่าช้า-3 0.208nM, cyno ความล่าช้า-3 0.017nM และลิงบาบูนความล่าช้า-3 0.022nM H5L7BW มนุษย์ความล่าช้า-3 0.218nM, cyno ความล่าช้า-3 0.021nM และลิงบาบูน LAG-3 0.024nM) ในขณะที่ทั้งสองไม่ใช่มนุษย์ถือ recombinant ความล่าช้า 3 orthologues ผูกกับ IMP731 มาแอนตี้กับการปรับปรุงในแอฟฟินิตี้ประมาณ 100 เท่าเมื่อเปรียบเทียบกับวททชมนุษย์ 10 เบาะแสความล่าช้า 3-His6 (ลำดับ ID ไม่: 51) (IMP731: มนุษย์ความล่าช้า-3 2.76nM, cyno 3 ความล่าช้า0.021nM กลิงบาบูนความล่าช้า-3 0.019nM)ตัวอย่างที่ 5: ผูกของ H5L7BW, H5L7 และ IMP731 การความล่าช้า 3 แสดง EL4 เซลล์มนุษย์ เซลล์ CD3 + T การเปิดใช้งานหลักที่มนุษย์15ความล่าช้า 3 แสดง EL4 เซลล์มนุษย์ได้ incubated กับ IMP731, H5L7 หรือ H5L7BW Alexa647 คอนจูเกตed แอนตี้ที่ความเข้มข้นแตกต่างกันของถึง 50pg/m1 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง เซลล์ถูกล้าง ด้วย FACS บัฟเฟอร์ (บีเอสเอ PBS+0.5%) เอาแอนติบอดีผูกเซลล์ CD3 + T ถูกเตรียมจาก PBMCs ตามลบสิ่งที่เลือกใช้ลูกปัด Dynal เซลล์ขาวละเอียดมนุษย์ T 20 เซลล์ CD3 + T ถูกเรียกใช้ โดยคณะทันตแพทยศาสตร์ immobilised แอนติ-CD3 และแอนติ- CD28 และละลาย recombinant มนุษย์ IL-12 วัน 3 ที่ 37 องศาเซลเซียส เปิดเซลล์ได้ incubated ด้วย แอนตี้ 647 คอนจูเกตed Alexa ของแตกต่างความเข้มข้นถึง 3pg/ml 30 นาทีที่ห้อง อุณหภูมิ เซลล์ถูกล้าง ด้วย FACS บัฟเฟอร์ (บีเอสเอ PBS+0.5%)EL4 เซลล์และเซลล์ CD3 + T ถูก analysed โดยใช้กระแส Beckman Coulter FC 500 FACS25 cytometer ข้อมูลดิบ FACS ได้ analysed ใช้ซอฟต์แวร์วิเคราะห์ CXP (Beckman Coulter) ข้อมูลถูกลงจุดบนกระจายไปกับพล็อตด้านกระจายและประชากรของเซลล์เริ่มต้นดอกเบี้ยถูก gated นี้ gated ประชากรถูกพล็อตเป็นฮิสโตแกรมแสดงความเข้ม fluorescence และ fluorescence หมายถึงความเข้ม (MFI) คำนวณแล้ว ค่า MFI ได้พล็อตแล้วในซอฟต์แวร์ GraphPad ปริซึม 5 เพื่อสร้างเส้นโค้งตอบสนองยา30 รวมโพรไฟล์ของ H5L7BW, H5L7 และ IMP731 การความล่าช้า 3 แสดง EL4 เซลล์มนุษย์ และเซลล์ CD3 + T การเปิดใช้งานหลักที่มนุษย์จะแสดงใน Fig. 1 แอนตี้ที่สามจัดแสดงลักษณะผูกคล้ายกับมนุษย์ความล่าช้า-3 แสดงเซลล์ EL4 (Fig. 1A) และเรียกเซลล์ CD3 + T มนุษย์ (Fig. 1B)ตัวอย่างที่ 35 6: การประเมินผลของกิจกรรมการพึ่ง H5L7BW และ H5L7 โดยแอนติบอดีขึ้นเซลลูลาร์ cytotoxicity (ADCC) ในเซลล์ T มนุษย์หลัก

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ก่อนที่จะแยกการวิเคราะห์ทางสถิติ สำหรับแต่ละ
20 พารามิเตอร์การวิเคราะห์รูปแบบการผสมความแปรปรวน Canova)
ได้ดำเนินการเกี่ยวกับข้อมูลการเปลี่ยนที่รวมถึงข้อตกลงRun (ผลบล็อกสุ่ม) และแอนติบอดี.
จาก Anova
หมายถึงรูปทรงเรขาคณิตที่ถูกคาดการณ์ไว้สำหรับแต่ละแอนติบอดีพร้อมกับสถิติช่วงที่น่าเชื่อถือ(95% ช่วงความเชื่อมั่น) สำหรับแต่ละเฉลี่ย การเปรียบเทียบการวางแผนของแอนติบอดีถูกดำเนินการภายใน Anova
เปรียบเทียบแสดงเป็นอัตราส่วนของทั้งสองแอนติบอดีเมื่อเทียบกับ 25 อีกครั้งกับช่วงความเชื่อมั่น 95% และค่าพี อัตราส่วนอาจจะถูกตีความว่าเป็นเท่าการเปลี่ยนแปลงเช่นอัตราส่วน 0.1 สอดคล้องกับการลดลง 90%. วิธีการทางเรขาคณิตที่ได้รับสำหรับแต่ละฮิวเมไนซ์แอนติบอดี้และ IMP731 ควบคุมลูกผสมสำหรับการรวมแอฟฟินิตี้ (KD) แสดงในตารางที่ 4 ค่าเฉลี่ย KD สำหรับ H5L7 เป็น0.2075nM ลดลงอย่างมีนัยสำคัญจาก 92% (คือ 10 เท่าลดลง) กับ p <0.0001 เมื่อเทียบกับ 30 IMP731 IMP731 แสดงค่าเฉลี่ยของ KD 2.76nM Afucosylated H5L7BW เทียบเท่าการจัดแสดงนิทรรศการผลผูกพันเป็นfucosylated H5L7 กับ KD เรขาคณิตของ 0.2179nM มีไม่แตกต่างกัน (p = 0.1790). การปรับปรุงในแอฟฟินิตี้สังเกต H5L7 ในการเปรียบเทียบกับ IMP731 เป็นส่วนใหญ่ได้แรงหนุนจากความแตกต่างในออกราคาห้องพักของแอนติบอดีสำหรับ LAG-3-ECD-His6 แสดงในตารางที่ 5 มีประมาณ85% ลดลง (คือเกือบ 10 เท่าลดลง) KD สำหรับ H5L7 ในการเปรียบเทียบ IMP731 35 ซึ่งสูงเป็นนัยสำคัญทางสถิติ ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่าง afucosylated เป็นH5L7BW และ H5L7 (p = 0.4408). ตารางที่ 4: การประเมินผลทางสถิติสำหรับ KD ของ fucosylated และ afucosylated แอนติ -LAG-3 รูปแปรผัน s ผูกพันที่จะรีคอมบิแนนต์ฮิวเมน LAG -3-ของเขาหมายถึงเรขาคณิตสำหรับKD (นาโนเมตร) แอนติบอดีรุ่นที่ไม่มีทางเรขาคณิตหมายถึงการลดลง 95% CI บน 95% CI H5L7 GRITS42382 2.08E-10 1.89E-10 2.28E-10 H5L7BW GRITS42760 2.18E-10 1.98E-10 2.40E -10 IMP731 020,909 2.76E-09 2.51E-09 3.04E-09 เปรียบเทียบ KD KD เปรียบเทียบอัตราส่วนที่ต่ำกว่า 95% CI บน 95% CI P คุ้มค่าH5L7BW-H5L7 1.0502 0.97268 1.13389 0.179 H5L7-1MP731 0.07736 0.0715 0.0837 <0.0001 5 ตาราง ที่ 5: การประเมินผลทางสถิติสำหรับ KD ของ fucosylated และ afucosylated แอนติ -LAG-3 รูปแปรผันผูกพันที่จะรีคอมบิแนนต์ฮิวเมน LAG-3-ของเขาหมายถึงเรขาคณิตสำหรับKD (1 / s) แอนติบอดีรุ่นที่ไม่มีทางเรขาคณิต หมายถึงการลดลง 95% CI บน 95% CI H5L7 GRITS42382 3.95E-03 3.16E-03 4.94E-03 H5L7BW GRITS42760 4.41E-03 3.53E-03 5.51E-03 IMP731 020,909 2.75E-02 2.20E-02 3.44E- 02 การเปรียบเทียบ KD KD เปรียบเทียบอัตราส่วนที่ต่ำกว่า 95% CI บน 95% CI P คุ้มค่าH5L7BW-H5L7 1.11715 0.81531 1.53073 0.4408 H5L7-1MP731 0.15478 0.11157 0.21471 <0.0001 10 ตัวอย่างที่ 3: การประเมิน LAG-3-ของเขามีผลผูกพันเอพิโทป ของแอนติ -LAG-3 ฮิวเมไนซ์รูปแปรผันในการเปรียบเทียบกับแอนติบอดีลูกผสม IMP731 ใช้ ProteOnTM เอพิโทปทดลองมีผลผูกพันได้ดำเนินการกับ H5L7 การประเมินว่า LAG-3 15 เอพิโทปภายในที่ IMP731 ผูกได้รับการอนุรักษ์เมื่อ humanisation นอกจากนี้มีผลผูกพันเอพิโทปของ fucosylated และ afucosylated ฮิวเมไนซ์รูปแปรผันยังถูกเมื่อเทียบ. เอพิโทปผูกพันถูกประเมินโดยใช้ ProteOnTM XPR36 (BioRadTM) เครื่องไบโอเซนเซอร์โดยประเมินว่าแอนติ-LAG- 3 แอนติบอดี้ก็สามารถที่จะไปพร้อม ๆ กันผูกกับ LAG-3-ของเขาในการที่ซับซ้อนกับแอนติบอดีจับบนพื้นผิวชิปProteOnTM IMP731 และแอนติบอดีหมาที่ไม่ใช่การแข่งขัน 20 17B4 ถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมในการทดสอบนี้. แอนติบอดีที่จะทดสอบการใช้ไบโอตินถูก Ez-Link-sulfo-พลุกพล่านชุด biotinylation แต่ละแอนติบอดี biotinylated ถูกจับในเซลล์ไหลแยกจากกันบนชิป neutravidin NLC โดยใช้แนวการฉีด หลังจากที่จับแอนติบอดีพื้นผิวที่ถูกปิดกั้นด้วย biocytin ที่ 2.5mg / ml ใช้ร่วมสถานที่ฉีดโดยธรรมชาติซอฟต์แวร์ระยะ ProteOn, LAG-3-ECD His6 ถูกฉีดมากกว่าแอนติบอดีคู่ที่ 100nm ตามด้วยแอนติบอดี้ยกเลิก biotinylated ที่ 100nm ด้วยการฉีดทั้งคู่เป็นแนวนอนเพื่อให้LAG-3-ของเขา และแอนติบอดีข้ามทั้ง 6 neutravidin จับแอนติบอดี 5 ทดสอบวิ่งที่ 25 ° C และ HBS-EP ใน ProteOn XPR36 โปรตีนระบบอาร์เรย์ปฏิสัมพันธ์. วิเคราะห์ข้อมูลดำเนินการโดยใช้จุดรายงานการดำเนินการหลังจากที่ LAG-3-เขาฉีดและจุดรายงานหลังจากแอนติบอดียกเลิกbiotinylated ฉีดวิเคราะห์ การตอบสนองโดยรวมได้รับการคำนวณโดยการลบการตอบสนองมองเห็นได้ด้วยแอนติบอดีที่มีผลผูกพันจากการตอบสนองที่เห็นด้วยLAG-3-ECD His6 ผูกพัน หน่วยเสียงสะท้อนในเชิงบวก (RU) มูลค่านั่นหมายความว่าการฉีดวิเคราะห์แอนติบอดี 10 ได้ถูกผูกไว้กับ LAG-3-ECD His6 complexed กับแอนติบอดี biotinylated ในการจับภาพ neutravidin ผิวบ่งบอกถึงความผูกพันที่เอที่ไม่ใช่การแข่งขันพิโทป s ไม่มีการตอบสนองหรือตอบสนองเชิงลบหมายความว่าการฉีดวิเคราะห์แอนติบอดีไม่ได้ผูกไว้กับ LAG-3-ECD His6 complexed กับแอนติบอดีbiotinylated บนพื้นผิวจับ neutravidin แสดงให้เห็นผูกแอนติบอดีในการแข่งขันเอพิโทปเอส. 15 แอนติ -LAG- 3 ฮิวเมไนซ์รูปแปรผัน s (fucosylated และ afucosylated) ไม่สามารถที่จะผูกกับมนุษย์LAG-3 ECD-His6 ในที่ซับซ้อนที่มี IMP731 บ่งบอกว่าเอพิโทปสำหรับ LAG-3 ECD-His6 ที่ใช้ร่วมกันและการอนุรักษ์จึง . 17B4 หมาแอนติบอดีสามารถที่จะผูกกับมนุษย์ LAG-3-ECD His6 ในที่ซับซ้อนที่มี IMP731 substantiating แอนติบอดีที่นี้ไม่ใช่การแข่งขันสำหรับ LAG-3-ECD His6 ผูกพันกับ IMP731 ตรงกันข้ามฮิวเมไนซ์แอนติบอดีสามารถที่จะผูกกับมนุษย์ LAG-3 ECD-His6 ใน20 ที่ซับซ้อนที่มี 17B4. ผลการยืนยันว่าได้มีการเปลี่ยนแปลงในเอพิโทประหว่าง IMP731 ลูกผสมและฮิวเมไม่มี ไนซ์รูปแปรผันของ IMP731 การทดสอบในการทดลองนี้ การทดลองยังแสดงให้เห็นว่ามีความแตกต่างระหว่างแอนติบอดี fucosylated และ afucosylated ผูกพัน no. 25 ตัวอย่างที่ 4: การวิเคราะห์ผูกพันของแอนติ -LAG-3 ฮิวเมไนซ์แอนติบอดีเพื่อ cynomolgus recombinant ลิงและลิงบาบูน LAG-3-ECD His6 ใช้ Biacore "T100 ผูกพันข้ามปฏิกิริยาของแอนติ -LAG-3 ฮิวเมไนซ์แอนติบอดี้ทั้ง cynomolgus ลิง (Cyno) และลิงบาบูน recombinant LAG-3-ECD His6 (ID SEQ เลขที่ 52 และ 53 ตามลำดับ) เป็นวันที่ 30 ประเมินโดยใช้ BiacoreTM T100 (GE HealthcareTM) โปรตีนที่ถูกตรึงบนชิป CM5 โดยการมีเพศสัมพันธ์ amine หลัก. พื้นผิวนี้ถูกนำมาใช้ในการจับภาพฮิวเมไนซ์แอนติบอดี. ในบ้านที่สร้างลิง cynomolgus recombinant และลิงบาบูน LAG-3 ECD -His6 ถูกผ่านไปแล้วกว่าจับแอนติบอดีและการฟื้นฟูได้รับการดำเนินการโดยใช้NaOH 50 มม. LAG-3-ECD His6 ถูกส่งผ่านไปที่ 16, 4, 1, 0.25 และ 0.0625nM. 35 โค้งที่มีผลผูกพันที่ถูกอ้างถึงสองครั้งด้วยการฉีดบัฟเฟอร์ ( เช่น OnM) และข้อมูลที่ได้รับการติดตั้งซอฟต์แวร์การวิเคราะห์T100 ใช้ 1: 1 รุ่น วิ่งได้ดำเนินการที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสโดยใช้ HBS-EP เป็นบัฟเฟอร์ทำงาน. H5L7, H5L7BW และผูก IMP731 เทียบเคียงกับแอฟฟินิตี้ทั้งลิง cynomolgus และลิงบาบูนrecombinant LAG-3-ECD His6 ข้อมูลที่ถูกสร้างขึ้นจากการทดลองแยกต่างหาก แต่IMP731 แอนติบอดีลูกผสมถูกใช้เป็นตัวควบคุมระหว่างการทดลอง. ข้อมูลนี้แสดงให้เห็นว่าทั้งสองไม่ใช่มนุษย์เจ้าคณะ recombinant LAG-3 orthologues ผูกกับ 5 H5L7 มาแอนติบอดีที่มี 10 ปรับปรุงเท่าในแอฟฟินิ ตี้ในการเปรียบเทียบกับมนุษย์recombinant LAG-3-ECD His6 (SEQ ID NO: 51) (H5L7: มนุษย์ LAG-3 0.208nM, Cyno LAG-3 0.017nM และลิงบาบูน LAG-3 0.022nM; H5L7BW มนุษย์ LAG-3 0.218nM , Cyno LAG-3 0.021nM และลิงบาบูนLAG-3 0.024nM) ขณะที่ทั้งสองไม่ใช่มนุษย์เจ้าคณะ recombinant LAG-3 orthologues ผูกกับ IMP731 แอนติบอดีที่ได้มาด้วยการปรับปรุงในแอฟฟินิตี้ประมาณ 100 เท่าเมื่อเทียบกับ 10 recombinant มนุษย์ LAG-3 ECD-His6 (SEQ ID NO: 51) (IMP731 : มนุษย์ LAG-3 2.76nM, Cyno LAG-3 0.021nM และลิงบาบูน LAG-3 0.019nM). ตัวอย่างที่ 5: โปรไฟล์ผูกพันของ H5L7BW, H5L7 และ IMP731 เพื่อ LAG-3 มนุษย์แสดงเซลล์ EL4 และเปิดใช้งานหลักของมนุษย์ CD3 + T เซลล์15 มนุษย์ LAG-3 แสดงเซลล์ EL4 ถูกบ่มกับทั้ง IMP731, H5L7 หรือ H5L7BW Alexa647- คอนจูเกตเอ็ดแอนติบอดีที่ความเข้มข้นที่แตกต่างกันได้ถึง 50pg / m1 เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง เซลล์ที่ถูกล้างด้วยบัฟเฟอร์มาซึ่ง (พีบีเอส + 0.5% บีเอสเอ) เพื่อเอาแอนติบอดีหลุด. CD3 + T เซลล์ที่เตรียมจาก PBMCs โดยการเลือกใช้เชิงลบของมนุษย์แตะต้อง T 20 เซลล์เม็ด Dynal CD3 + T เซลล์ถูกเปิดใช้งานโดยการบ่มด้วยตรึงแอนติ -CD3 และแอนติ - CD28 และละลายน้ำได้ recombinant มนุษย์ IL-12 เป็นเวลา 3 วันที่ 37 ° C เปิดใช้งานเซลล์ถูกบ่มกับAlexa 647- คอนจูเกตเอ็ดแอนติบอดีของความเข้มข้นที่แตกต่างกันขึ้นอยู่กับ 3PG / ml เป็นเวลา 30 นาทีในห้องอุณหภูมิ เซลล์ที่ถูกล้างด้วยบัฟเฟอร์มาซึ่ง (พีบีเอส + 0.5% BSA). เซลล์ EL4 และ CD3 + T เซลล์วิเคราะห์มาซึ่งใช้ Beckman Coulter เอฟซีไหล 500 25 cytometer ข้อมูลดิบมาซึ่งวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์การวิเคราะห์ CXP (Beckman Coulter) ข้อมูลที่ได้รับครั้งแรกในพล็อตไปข้างหน้าเมื่อเทียบกับพล็อตที่กระจายด้านประชากรและการกระจายของเซลล์ของดอกเบี้ยรั้วรอบขอบชิด ประชากรรั้วรอบขอบชิดนี้ถูกพล็อตนั้นเป็นกราฟแสดงความเข้มของแสงและค่าเฉลี่ยความเข้มแสง (MFI) คำนวณ ค่า MFI ถูกพล็อตแล้วในปริซึม GraphPad 5 ซอฟแวร์ในการสร้างเส้นโค้งการตอบสนองต่อยา. 30 โปรไฟล์ผูกพันของ H5L7BW, H5L7 และ IMP731 มนุษย์ LAG-3 แสดงเซลล์ EL4 และเปิดใช้งานหลักของมนุษย์CD3 + T เซลล์จะแสดงในรูป 1. สามแอนติบอดีแสดงลักษณะที่มีผลผูกพันคล้ายกับ LAG 3 มนุษย์แสดงเซลล์ EL4 (. รูปที่ 1A) และเปิดใช้งานของมนุษย์ CD3 + T เซลล์ (รูปที่ 1B.). 35 ตัวอย่างที่ 6: การประเมินของกิจกรรมพึ่งพาของ H5L7BW และ H5L7 โดยแอนติบอดีขึ้นโทรศัพท์มือถือที่เป็นพิษ (ADCC) ในมนุษย์หลัก T เซลล์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ก่อนที่จะแยกวิเคราะห์ทางสถิติ สำหรับแต่ละ
20 พารามิเตอร์ รูปแบบผสม การวิเคราะห์ความแปรปรวน คาโนวา ) คือการเปลี่ยนข้อมูล
ที่รวมถึงข้อตกลงสำหรับวิ่ง ( สุ่ม Block Effect ) และแอนติบอดี .
จาก ANOVA , เรขาคณิตหมายถึงคาดการณ์สำหรับแต่ละแอนติบอดีพร้อมกับสถิติ
สัมพันธ์ช่วง ( ช่วงความเชื่อมั่น 95% ) สำหรับแต่ละหมายวางแผนและดำเนินการเปรียบเทียบได้
ภายในโดย การเปรียบเทียบจะแสดงอัตราส่วนของทั้งสองชนิดเมื่อเทียบกับ 25 อีก 95% ช่วงความเชื่อมั่นและค่า อัตราส่วนอาจจะตีความเป็นเปลี่ยนพับ
เช่นอัตราส่วน 0.1% สอดคล้องกับ 90%
ลดลงเรขาคณิต หมายถึง ได้ทั้งฮิวเมไนซ์แอนติบอดี และควบคุมที่ imp731 สำหรับแอฟฟินิตี้ผูกพัน ( KD ) แสดงดังตารางที่ 4 โดย KD หมายถึง h5l7 ถูก
0.2075nm ลดลงอย่างมีนัยสำคัญจาก 92% ( เช่น 10 เท่า ลดลง ( p < 0.0001 ) เมื่อเทียบกับ 30 imp731 . imp731 แสดงหมายถึงชนิดของ 2.76nm . afucosylated h5l7bw จัดแสดงเทียบเท่าผูกพัน
เป็น fucosylated h5l7 กับ KD ทางเรขาคณิตของ 0.2179nm ไม่มีความแตกต่างกันทางสถิติ ( P = 0.1790 ) .
การปรับปรุงในแอฟฟินิตี้ ) h5l7 เปรียบเทียบกับ imp731 เด่น
ขับเคลื่อนโดยความแตกต่างในจากราคาของแอนติบอดีสำหรับ lag-3-ecd-his6 แสดงใน ตารางที่ 5 มี
เป็นประมาณ 85% ลดลง ( เช่นเกือบ 10 เท่าลดลง ) และสำหรับ h5l7 เปรียบเทียบ imp731 35 ซึ่งมีนัยสำคัญทางสถิติ ไม่พบความแตกต่างระหว่าง afucosylated
h5l7bw และ h5l7 ( P = 0.4408 )


ตารางที่ 4 : การประเมินทางสถิติสำหรับชนิดของ fucosylated afucosylated และแอนติ - lag-3 รูปแปรผัน S ผูกรีคอมบิแนนต์ฮิวเมน lag-3-his



ค่าเฉลี่ยเรขาคณิตสำหรับ KD ( nm )
2 ชุดไม่เรขาคณิตหมายถึงต่ำกว่า 95% CI Upper 95% CI
h5l7 grits42382 2.08e-10 1.89e-10 2.28e-10
h5l7bw grits42760 2.18e-10 1.98e-10 2.40e-10
imp731 020909 2.76e-09 2.51e-09 3.04e-09




ขนาดเปรียบเทียบและเปรียบเทียบอัตราส่วนลด 95% CI Upper 95% CI ค่า P
h5l7bw-h5l7 1.0502 0.97268 1.13389 0.179
h5l7-1mp731 0.07736 0.0715 0.0837 < . 0001 โต๊ะ 5

5 :สถิติการประเมินสำหรับชนิดของ fucosylated afucosylated และแอนติ - lag-3 รูปแปรผัน S ผูกรีคอมบิแนนต์ฮิวเมน lag-3-his



ทางเรขาคณิตหมายความว่า KD ( 1 / s )
2 ชุดไม่เรขาคณิตหมายถึงต่ำกว่า 95% CI Upper 95% CI
h5l7 grits42382 3.95e-03 3.16e-03 4.94e-03
h5l7bw grits42760 4.41e-03 3.53e-03 5.51e-03
imp731 020909 2.75e-02 2.20e-02 3.44e-02



การเปรียบเทียบของ KD
KD เปรียบเทียบสัดส่วนลดลง 95% CI Upper 95% CI ค่า P
h5l7bw-h5l7 1.11715 0.81531 1.53073 0.4408
h5l7-1mp731 0.15478 0.11157 0.21471 < . 0001 10

ตัวอย่างที่ 3 : การประเมิน lag-3-his ผูกเอพิโทปของแอนติ - lag-3 ฮิวเมไนซ์รูปแปรผัน S ในการเปรียบเทียบกับ imp731 แอนติบอดีที่ใช้ proteontm

การเอพิโทปผูกทดสอบกับ h5l7 ที่จะประเมินว่า lag-3 15 เอพิโทปภายในซึ่ง imp731 ผูกเป็นป่าสงวนเมื่อ humanisation . นอกจากนี้ ปก
เอพิโทปของ fucosylated afucosylated ฮิวเมไนซ์รูปแปรผันและถูกเปรียบเทียบ .
เอพิโทปผูกถูกประเมินโดยใช้ proteontm xpr36 ( bioradtm ) ไบโอเซนเซอร์โดย
เครื่องจักรประเมินว่าแอนติ - lag-3 แอนติบอดีสามารถพร้อมกันผูก lag-3-his ในซับซ้อน
กับแอนติบอดีจับกับ proteontm ชิปพื้นผิว imp731 และไม่แข่งขัน ( ~ 20 17b4 ถูกใช้เป็นตัวควบคุมในการทดสอบนี้ จึงถูกทดสอบ
ถูกไลใช้อีซี่ลิงค์ sulfo NHS biotinylation kitแต่ละไลแอนติบอดีที่จับบนแยกเซลล์ไหลใน neutravidin NLC ชิปใช้แนวตั้ง


ฉีด หลังจากแอนติบอดีจับพื้นผิวที่ถูกบล็อกในน้ำที่ 2.5mg/ml ใช้ Co -
ฉีดสถานที่ที่แท้จริงกับ proteon รันซอฟต์แวร์ lag-3 ecd-his6 ถูกฉีดไปที่ 100nm คู่ ) ,ตามด้วยแอนติบอดีที่ 100nm อุนไลทั้งฉีดถูก
แนวนอนเพื่อให้ lag-3-his และแอนติบอดีข้ามทั้งหมด 6 neutravidin จับแอนติบอดี 5 ) ใช้ 25 ° C และใน hbs-ep บน proteon xpr36 โปรตีนปฏิสัมพันธ์เรย์ระบบ
วิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้คะแนนรายงานที่ถ่ายหลังจากฉีดและ
lag-3-hisรายงานจุดที่ถ่ายหลังจากสหประชาชาติ ( ครูไลฉีด การตอบสนองโดยรวมคำนวณด้วยการลบ
เห็นกับการตอบสนองแอนติบอดีจากการเห็นด้วย
lag-3 ecd-his6 เข้าเล่มหน่วยเสียงบวก ( ru ) มูลค่าหมายถึง แอนติบอดี ครูต้อง lag-3 ฉีด 10 มี ecd-his6 complexed กับไลแอนติบอดีใน neutravidin จับ
พื้นผิว ซึ่งมีผลผูกพันที่ไม่แข่งขันเอพิโทปเอสไม่ตอบสนองหรือตอบสนองเชิงลบหมายถึง แอนติบอดี
ครูฉีดไม่ต้อง lag-3 ecd-his6 complexed กับ
แอนติบอดีใน neutravidin ไลจับพื้นผิว ซึ่งแอนติบอดีที่ผูกไว้ที่แข่งขันเอพิโทป S .

15 แอนติ - lag-3 ฮิวเมไนซ์รูปแปรผัน S ( fucosylated และ afucosylated ) ไม่สามารถที่จะผูกกับ ecd-his6 lag-3 มนุษย์
ในซับซ้อนกับ imp731 บ่งบอกว่าเอพิโทป , สำหรับ lag-3 ecd-his6 ร่วมกัน จึงควรอนุรักษ์ .~ 17b4 แอนติบอดีที่สามารถผูกกับ ecd-his6 lag-3 มนุษย์ในซับซ้อนกับ imp731 substantiating ที่แอนติบอดีนี้ไม่ใช่การแข่งขันเพื่อ lag-3 ecd-his6 ผูกพัน กับ imp731 . ในทางกลับกัน ฮิวเมไนซ์แอนติบอดีสามารถผูกกับ ecd-his6 lag-3 มนุษย์ซับซ้อนกับ 17b4

20 .พบว่าไม่มีการเปลี่ยนแปลงในเอพิโทประหว่าง imp731 ~ i และรูปแปรผันฮิวเมไนซ์ของ imp731 ทดสอบในการทดสอบนี้ การทดลองพบว่าไม่มีความแตกต่างระหว่างแอนติบอดีและ fucosylated afucosylated ผูกพัน


4 : 25 ตัวอย่างผูกพันการวิเคราะห์แอนติ - แอนติบอดีฮิวเมไนซ์ lag-3 cynomolgus ลิงบาบูนในรีคอมบิแนนท์
และ lag-3 ecd-his6 ใช้ biacore " T100

ผูกพันข้ามการแอนติ - แอนติบอดีฮิวเมไนซ์ lag-3 ทั้ง cynomolgus ลิงบาบูน (
cyno ) และใช้ lag-3 ecd-his6 ( seq id หมายเลข 52 และ 53 ,ตามลำดับ ) 30 และใช้ biacoretm T100 ( GE healthcaretm )
โปรตีนถูกตรึงบนชิปชนิดโดย primary amine coupling . พื้นผิวนี้ถูกใช้ในการจับฮิวเมไนซ์แอนติบอดี บ้านสร้างรีคอมบิแนนท์ cynomolgus ลิงบาบูนและ lag-3 ecd-his6 แล้วข้ามจับแอนติบอดีและการฟื้นฟูเป็น 50mm
โดยใช้ NaOHlag-3 ecd-his6 ผ่านอยู่ที่ 16 , 4 , 1 , 0.25 และ 0.0625nm . 35 โค้งผูกเป็นคู่อิง กับฉีดบัฟเฟอร์ ( เช่น onm ) และทำการติดตั้ง
กับ T100 การวิเคราะห์ซอฟต์แวร์ที่ใช้ 1 : 1 รุ่น วิ่งขึ้นที่ 37 องศา C โดยใช้ hbs-ep เป็นวิ่งบัฟเฟอร์


h5l7 h5l7bw imp731 , และผูกกับเปรียบแอฟฟินิตี้ทั้งลิง cynomolgus และ
ลิงบาบูน recombinant lag-3 ecd-his6 . ข้อมูลที่ถูกสร้างขึ้น จากการทดลองแยกต่างหาก แต่ที่เคยใช้ imp731
แอนติบอดีเป็นตัวควบคุมระหว่างการทดลอง
ข้อมูลนี้บ่งชี้ว่าทั้งมนุษย์ลิงคอม lag-3 orthologues ผูกกับ 5 h5l7 ได้มาแอนติบอดีที่มีการปรับปรุงในแอฟฟินิตี้ 10 เท่าเมื่อเปรียบเทียบกับมนุษย์
recombinant lag-3 ecd-his6 ( seq id ไม่ :51 ) ( h5l7 : มนุษย์ lag-3 0.208nm cyno lag-3 , 0.017nm
และ Baboon lag-3 0.022nm ; h5l7bw มนุษย์ lag-3 0.218nm cyno , และ lag-3 0.021nm บาบูน
lag-3 0.024nm ) ขณะที่ทั้งมนุษย์ลิงคอม lag-3 orthologues ผูก imp731
ได้มาแอนติบอดีที่มีการปรับปรุงในแอฟฟินิตี้ประมาณ 100 เท่า เทียบกับ 10 มนุษย์ recombinant lag-3 ecd-his6 ( seq id ไม่ :51 ) ( imp731 : มนุษย์ lag-3 2.76nm cyno lag-3
0.021nm บาบูน , และ lag-3 0.019nm ) .
เช่น 5 : ผูกโปรไฟล์ของ h5l7bw h5l7 imp731 , และมนุษย์ lag-3 แสดง el4 เซลล์มนุษย์และเซลล์ T หลักทำงานทันที

lag-3 15 มนุษย์แสดง el4 cells imp731 บ่มด้วย ,h5l7 หรือ h5l7bw alexa647 - คอนจูเกตเอ็ดแอนติบอดีที่ความเข้มข้นแตกต่างกันถึง 50pg / M1 เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง เซลล์มีการล้างด้วย facs บัฟเฟอร์ ( PBS 0.5% BSA ) ลบจับกับแอนติบอดี
ทันที T cells ที่เตรียมจาก PBMCs โดยเลือกลบโดยใช้แตะต้องมนุษย์ T 20 เซลล์ dynal ลูกปัดทันทีทีเซลล์ถูกกระตุ้นโดยการบ่มด้วยตรึงและแอนติ - ทันทีแอนติ -
cd28 และละลายของบี - เซลล์รีคอมบิแนนท์ เป็นเวลา 3 วัน ที่อุณหภูมิ 37 องศา เปิดใช้งานเซลล์ถูกบ่มกับ
Alexa 647 - คอนจูเกตเอ็ดแอนติบอดีความเข้มข้นแตกต่างกันไป 3pg เป็นเวลา 30 นาที ที่ห้อง
อุณหภูมิ เซลล์มีการล้างด้วย facs บัฟเฟอร์ ( PBS 0.5 %
6 )el4 ทันที T เซลล์และเซลล์ วิเคราะห์ข้อมูลโดย facs โดยใช้เบคแมน คูลเตอร์ ซี 500 ไหล
25 ใช้โมโน . facs ข้อมูลดิบมาวิเคราะห์โดยใช้โปรแกรมวิเคราะห์ cxp ( Beckman Coulter ) ข้อมูล
ตอนแรกพล็อตเรื่องกระจายไปข้างหน้าและข้างกระจายแปลงและจำนวนเซลล์ของ
ดอกเบี้ยถูก gated .นี้ผม ประชากรแล้วพล็อตเป็นกราฟแสดงความเข้มและความเข้มของการเรืองแสงเฉลี่ย ( MFI ) การคำนวณ ค่า MFI แล้ววางแผนในซอฟต์แวร์ปริซึม graphpad 5 เพื่อสร้างเส้นโค้งการตอบสนองยา
30 โปรไฟล์ผูกพันของ h5l7bw h5l7 imp731 , และมนุษย์ lag-3 แสดง el4 เซลล์ และการเปิดใช้งานทันที T
มนุษย์เซลล์จะแสดงในรูปที่ 13 ) มีลักษณะคล้ายกับมนุษย์ผูกพัน lag-3 แสดง el4 เซลล์ ( รูปที่ 1A ) และเปิดใช้งานของมนุษย์ทันที T เซลล์ ( รูปที่ 1A )


35 ตัวอย่าง 6 : การประเมิน depleting และกิจกรรมของ h5l7bw h5l7 โดยแอนติบอดีต่อเซลล์ (
( adcc ) ในหลักของมนุษย์เซลล์ T