Construction of HBV P protein YMDD

Construction of HBV P protein YMDD motif mutants
The full-length monomeric HBV genome was PCR-amplified and subcloned into the Sac I/Sap I sites in pBluescript SK (Promega) to generate pBluescript-HBV WT. The YMDD (203tyrosine-methionine-aspartate-aspartate206) RT active site mutants M204A, M204I, M204K, M204L, M204R, M204T, and M204V, were then constructed by PCR-derived mutagenesis. To generate replication competent HBV WT and mutants, the EcoR I-Sac II fragment from pBluescript-HBV WT and the various YMDD mutants were inserted into pPB, a partially redundant WT HBV subtype adw R9 plasmid [43]. To generate the YSDD variants, Met 204 (ATG) was changed to Ser (TCG) using a fusion PCR technique. PCR-derived DNA fragments were generated using the mutagenic primer pairs, 5′-TTT CAG TTA TTC GGA TGA TGT GGT ATT G- 3′ and 3′- CA AAC CGA AAG TCA ATA AGC CTA CTA CAC- 5′ (mutated sequences in bold and underlined), digested with Xcm I-Sac II, and inserted into the HBV WT construct to yield the YSDD mutant. All constructs containing PCR-derived DNA fragments were then sequenced to confirm the presence of specific mutations and the absence of extraneous mutations introduced during the PCR reaction.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ตับอักเสบบี P โปรตีน YMDD motif กลายพันธุ์ก่อสร้างความยาวเต็ม monomeric ตับอักเสบบีจีโนมที่ถูกขยาย PCR และ subcloned เป็นช่วงที่ฉัน / Sap ผมเว็บไซต์ใน pBluescript SK (Promega) เพื่อสร้าง WT pBluescript-ตับอักเสบบี YMDD (203tyrosine-เมไทโอนีนอัลคาไลน์-aspartate206) RT ไซต์ใช้งานสายพันธุ์ M204A, M204I, M204K, M204L, M204R, M204T และ M204V ถูกสร้างขึ้น โดย mutagenesis PCR มาแล้ว เพื่อสร้างการจำลองแบบที่มีอำนาจ WT ตับอักเสบบีและการกลายพันธุ์ EcoR ฉัน Sac II fragment WT pBluescript-ตับอักเสบบีและการกลายพันธุ์ YMDD ต่าง ๆ ถูกแทรกไว้ใน pPB มีบางส่วนซ้ำซ้อน WT ตับอักเสบบีชนิดย่อย adw R9 plasmid [43] การสร้างตัวแปร YSDD พบ 204 (ATG) มีการเปลี่ยนแปลงกับ Ser (TCG) โดยใช้เทคนิค PCR ฟิวชั่น สร้างชิ้นส่วน DNA PCR มาใช้คู่ไพรเมอร์ mutagenic, 3′ CA AAC CGA เอเอจี TCA ATA AGC CTA CTA CAC-5 ′ (กลายพันธุ์ลำดับตัวหนา และขีดเส้นใต้), ย่อยกับ Xcm ผม-Sac II และแทรกลงใน WT ตับอักเสบบีและ 5 ′-TTT CAG TTA TTC GGA TGA TGT GGT ATT G - 3′ สร้างให้ผลกลายพันธุ์ YSDD โครงสร้างทั้งหมดที่ประกอบด้วยชิ้นส่วน DNA PCR มาที่เรียงลำดับถูกแล้วเพื่อยืนยันการปรากฏตัวของเฉพาะและการกลายพันธุ์ไม่เกี่ยวข้องที่นำมาใช้ในปฏิกิริยา PCR

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การก่อสร้างของไวรัสตับอักเสบบี P โปรตีน YMDD กลายพันธุ์แม่ลาย
เต็มความยาว monomeric จีโนมของไวรัสตับอักเสบบีเป็น PCR-amplified และ subcloned เข้าไปในเว็บไซต์ Sac I / ซับผม pBluescript SK (Promega) เพื่อสร้าง pBluescript-WT ไวรัสตับอักเสบบี YMDD (203tyrosine-methionine-aspartate-aspartate206) RT กลายพันธุ์ใช้งานเว็บไซต์ M204A, M204I, M204K, M204L, M204R, M204T และ M204V ถูกสร้างขึ้นแล้วโดยฉับ PCR-มา เพื่อสร้างการจำลองแบบของไวรัสตับอักเสบบีมีอำนาจ WT และกลายพันธุ์ส่วน EcoR I-Sac II จาก pBluescript-WT ไวรัสตับอักเสบบีและกลายพันธุ์ YMDD ต่าง ๆ ใส่เข้าไปใน ppb, ซ้ำซ้อนบางส่วน WT ไวรัสตับอักเสบบีชนิดย่อย ADW R9 พลาสมิด [43] ในการสร้างสายพันธุ์ YSDD ที่ Met 204 (ATG) ก็เปลี่ยนไป Ser (TCG) โดยใช้วิธี PCR ฟิวชั่น PCR ที่ได้มาจากชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ถูกสร้างขึ้นโดยใช้คู่ไพรเมอร์กลายพันธุ์, 5'-TTT CAG TTA TTC GGA TGA TGT GGT ATT G- 3 'และ 3'- CA AAC CGA AAG TCA ATA AGC CTA CTA CAC- 5' (ลำดับกลายพันธุ์ใน ตัวหนาและขีดเส้นใต้) ย่อยด้วย XCM I-Sac ครั้งที่สองและแทรกเข้าไปในไวรัสตับอักเสบบี WT สร้างให้ผลผลิตกลายพันธุ์ YSDD โครงสร้างทั้งหมดที่มี PCR ที่ได้มาจากชิ้นส่วนดีเอ็นเอมีลำดับขั้นตอนแล้วเพื่อยืนยันการปรากฏตัวของการกลายพันธุ์ที่เฉพาะเจาะจงและการขาดของการกลายพันธุ์ภายนอกที่นำมาใช้ในช่วงปฏิกิริยาวิธี PCR

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สร้างโปรตีนกลายพันธุ์ ymdd แม่ลาย HBV pการเกิดเป็นเชื้อ HBV เต็มตัวจีโนมของของในถุง ฉัน / ผม เว็บไซต์ใน SK ( SAP ) promega ) เพื่อสร้างการ ymdd ( HBV ) โดย 203tyrosine-methionine-aspartate-aspartate206 ) RT ที่ใช้งานเว็บไซต์ m204a m204i กลายพันธุ์ , m204k m204l m204r , , , , m204t และ m204v ถูกสร้างแล้วโดยวิธี PCR และการ . เพื่อสร้างการเชี่ยวชาญ HBV WT และกลายพันธุ์ , ecor i-sac 2 ชิ้นจาก ) HBV WT และสายพันธุ์ต่าง ๆ ymdd แทรกเข้าไปใน ppb , ซ้ำซ้อนบางส่วนพบพลาสมิดซึ่งน้ำหนัก adw R9 [ 43 ] เพื่อสร้าง ysdd สายพันธุ์พบ 204 ( ATG ) เปลี่ยนเป็น เซอร์ ( TCG ) ใช้ฟิวชั่น PCR เทคนิค ได้ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ชิ้นส่วน DNA PCR ไพรเมอร์คู่อาหาร 5 ’ - ทีทีทีและบริษัททีทีซีก๊ะ TGA TGT GGT ATT g - 3 ได้รับ 3 ’ - CA AAC CGA AAG TCA ATA อาซาฮี CTA CAC - 5 นั้น ( กลายพันธุ์ ) ในตัวหนาและขีดเส้นใต้ ) ตัดด้วย xcm i-sac II และแทรกเข้าไปในการศึกษาเพื่อสร้างผลผลิตน้ำหนัก ysdd กลายพันธุ์ โครงสร้างดีเอ็นเอดีเอ็นเอทั้งหมดที่มี ) แล้วทำการยืนยันการปรากฏตัวของการกลายพันธุ์ที่เฉพาะเจาะจงและการขาดการแนะนำในการกลายพันธุ์โดยปฏิกิริยา