2. Material and methods2.1. Bacteri

2. Material and methods
2.1. Bacterial strain, culture media and growth conditions
The Xcc strain X2002-0014 used in this study was isolated in
2002 from sweet orange in Dade County, FL and was routinely
grown on Luria Bertani broth (LB) (10 g tryptone, 5 g yeast extract
and 5 g sodium chloride per liter) or on LB plates (1.5% bacteriological
agar) at 27
C for 48 h.
2.2. Bacterial growth assay
Growth of Xcc was measured in LB broth adjusted to pH 7 with
addition of MES buffer and amended with Hx (SigmaeAldrich, St.
Louis, MO ref.153745) at 0, 0.06, 0.6, 1.5, 3, 6, 10, and 20 mM. Xcc
was grown in LB broth overnight and the bacterial suspension was
centrifuged, washed and resuspended in 10 mM MgSO4. The
growth assay was carried out in a total volume of 300 mL in microtiter
wells using an initial bacterial density of 1.5  103 colonyforming
units (cfu) mL1 adjusted with a spectrophotometer set at
A600nm. Bacteria were incubated on a rotary shaker for 96 h at 26
̊
C
and optical density of the suspension was measured every 10 min
using a Bioscreen C Reader (Labsystems Oy, Helsinki, Finland) set at
A600nm. After the growth assay, a LIVE/DEAD® (Life Technologies
Corp, Carlsbad, CA, USA) test was performed to assess cell mortality
caused by Hx acid.
2.3. Inoculum preparation, plant treatment and inoculation
procedures
Xcc inoculumwas prepared in nutrient broth and grown at 28
C
for 24 h to log phase. Bacterial suspension was centrifuged at
10,000 g for 20 min, re-suspended in phosphate buffer saline (PBS;
40 mM Na2HPO4 þ 25 mM KH2PO4), and adjusted to 104 cfu mL1
for attached leaf inoculations and 105 cfu mL1 for detached leaf
inoculations as previously described (Francis et al., 2010).
Nine-month-old ‘Pineapple’ sweet orange plants growing in 2.5-
L containers of a general purpose peat-based soil (Pro-Mix BX;
Premier Horticulture, Red Hill, PA) were maintained in a greenhouse
located at the Citrus Research and Education Center in Lake
Alfred, FL. Four weeks prior to the treatments, seedlings were cut
back to approximately 40 cm, and only one shoot per plant was
allowed to grow to approximately 20e30 cm in order to obtain 4e5
immature leaves (75% expanded) suitable for treatment and/or
inoculation.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุและวิธีการ2.1 ต้องใช้แบคทีเรีย สื่อวัฒนธรรม และสภาพการเจริญเติบโตพันธุ์ Xcc 0014 X 2002 ใช้ในการศึกษานี้แยกต่างหากใน2002 จากส้มหวานในเขต Dade, FL และเป็นประจำปลูกในซุป Luria Bertani (ปอนด์) (tryptone 10 กรัม สารสกัดจากยีสต์ 5 กรัมและคลอไรด์โซเดียม 5 กรัมต่อลิตร) หรือแผ่นปอนด์ (1.5% bacteriologicalagar) ที่ 27 C สำหรับ 48 h2.2. แบคทีเรียเจริญเติบโตวิเคราะห์เจริญเติบโตของ Xcc ถูกวัดในซุปปอนด์ปรับ pH 7 กับเพิ่มบัฟเฟอร์ MES แก้ไขกับ Hx (SigmaeAldrich เซนต์Louis, MO ref.153745) ที่ 0, 0.06, 0.6, 1.5, 3, 6, 10 และ 20 มม. Xccมีปลูกในซุปปอนด์ แอร์พอร์ตโอเวอร์ไนท์และระงับเชื้อแบคทีเรียได้centrifuged หิน และ resuspended ใน 10 มม. MgSO4 ที่วิเคราะห์การเจริญเติบโตที่ดำเนินในปริมาณรวมของ 300 มล.ใน microtiterบ่อที่ใช้มีความหนาแน่นเชื้อแบคทีเรียเริ่มต้น 1.5 103 colonyformingหน่วย (cfu) mL 1 ปรับปรุง ด้วยการตั้งค่าที่เครื่องทดสอบกรดด่างA600nm แบคทีเรียถูก incubated ในเชคเกอร์โรตารี่สำหรับ h 96 ที่ 26̊Cและความหนาแน่นออปติคัลของระบบกันสะเทือนถูกวัดทุก 10 นาทีใช้เครื่องอ่าน C Bioscreen (Labsystems Oy เฮลซิงกิ ฟินแลนด์) ตั้งA600nm หลังจากทดสอบการเจริญเติบโต, ® LIVE/ตาย (ชีวิตเทคโนโลยีคอร์ป คาร์ลส CA, USA) ทำการทดสอบเพื่อประเมินการตายของเซลล์เกิดจากกรด Hx2.3 เตรียม inoculum รักษาพืช และ inoculationขั้นตอนการInoculumwas Xcc เตรียมในซุปธาตุอาหาร และเติบโตที่ 28 Cสำหรับ h 24 เพื่อขั้นตอนการบันทึก มี centrifuged ระงับเชื้อแบคทีเรียที่10,000 g for 20 min, re-suspended in phosphate buffer saline (PBS;40 mM Na2HPO4 þ 25 mM KH2PO4), and adjusted to 104 cfu mL1for attached leaf inoculations and 105 cfu mL1 for detached leafinoculations as previously described (Francis et al., 2010).Nine-month-old ‘Pineapple’ sweet orange plants growing in 2.5-L containers of a general purpose peat-based soil (Pro-Mix BX;Premier Horticulture, Red Hill, PA) were maintained in a greenhouselocated at the Citrus Research and Education Center in LakeAlfred, FL. Four weeks prior to the treatments, seedlings were cutback to approximately 40 cm, and only one shoot per plant wasallowed to grow to approximately 20e30 cm in order to obtain 4e5immature leaves (75% expanded) suitable for treatment and/orinoculation.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 สายพันธุ์แบคทีเรียสื่อวัฒนธรรมและสภาวะการเจริญเติบโต
X2002-0014 Xcc
สายพันธุ์ที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ที่แยกได้ในปี2002 จากส้มหวานในเดดเคาน์ตี้,
ฟลอริด้าและเป็นประจำที่ปลูกในน้ำซุปLuria Bertani (LB) (10 กรัม tryptone, 5 กรัมสารสกัดจากยีสต์
5 กรัมและโซเดียมคลอไรด์ต่อลิตร) หรือบนแผ่นปอนด์ (1.5%
แบคทีเรียวุ้น) ที่ 27 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 48 ชม.
2.2 ทดสอบการเจริญเติบโตของแบคทีเรียเจริญเติบโตของ Xcc วัดในน้ำซุป LB ปรับค่าพีเอช 7 กับการเพิ่มขึ้นของบัฟเฟอร์mes และแก้ไขเพิ่มเติมกับ Hx (SigmaeAldrich เซนต์หลุยส์, มิสซูรี่ ref.153745) ที่ 0, 0.06, 0.6, 1.5, 3, 6, 10 และ 20 มิลลิเมตร Xcc ถูกปลูกในน้ำซุป LB ในชั่วข้ามคืนและระงับเชื้อแบคทีเรียที่ถูกปั่นล้างและresuspended 10 มิลลิ MgSO4 ทดสอบการเจริญเติบโตได้ดำเนินการในปริมาณรวม 300 มิลลิลิตรในไมโครหลุมโดยใช้ความหนาแน่นเริ่มต้นของแบคทีเรีย1.5? colonyforming 103 หน่วย (cfu) มิลลิลิตร 1 ปรับได้ด้วยสเปกที่ตั้งA600nm แบคทีเรียที่ถูกบ่มในเครื่องปั่นหมุน 96 ชั่วโมงที่ 26 ̊ C และความหนาแน่นของแสงของการระงับวัดทุก 10 นาทีใช้Bioscreen C อ่าน (Labsystems Oy, เฮลซิงกิ, ฟินแลนด์) ตั้งอยู่ที่A600nm หลังจากการทดสอบการเจริญเติบโตที่สด / DEAD® (ไลฟ์เทคโนโลยีส์คอร์ป, คาร์ลส, CA, USA) ได้ดำเนินการทดสอบเพื่อประเมินอัตราการตายของเซลล์ที่เกิดจากกรดHx. 2.3 การเตรียมหัวเชื้อรักษาอาคารและการฉีดวัคซีนขั้นตอนXcc inoculumwas เตรียมน้ำซุปในสารอาหารและเติบโตที่ 28 องศาเซลเซียสเป็นเวลา24 ชั่วโมงเพื่อเข้าสู่ระบบเฟส ระงับแบคทีเรียถูกหมุนเหวี่ยงที่10,000 กรัมเป็นเวลา 20 นาทีอีกครั้งที่ลอยอยู่ในน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (พีบีเอส; 40 มิลลิ Na2HPO4 þ 25 มิลลิ KH2PO4) และปรับถึง 104 cfu มิลลิลิตร 1 สำหรับการฉีดวัคซีนใบแนบและ cfu มิลลิลิตร 105 1 สำหรับเดี่ยว? ใบฉีดวัคซีนตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้(ฟรานซิส et al, 2010).. เก้าเดือนเก่า 'สับปะรด' พืชส้มหวานที่กำลังเติบโตใน 2.5- ภาชนะลิตรวัตถุประสงค์ดินพรุที่ใช้ทั่วไป (Pro-Mix BX; พรีเมียร์พืชสวนเนินเขาสีแดง , PA) ได้รับการดูแลในเรือนกระจกอยู่ที่การวิจัยส้มและศูนย์การศึกษาในทะเลสาบอัลเฟรดฟลอริด้า สี่สัปดาห์ก่อนที่จะรักษาต้นกล้าถูกตัดกลับไปประมาณ 40 ซม. และมีเพียงหนึ่งยิงต่อต้นได้รับการอนุญาตให้ปลูกประมาณ20e30 ซม. เพื่อให้ได้ 4e5 ใบที่ยังไม่บรรลุนิติภาวะ (75% ขยาย) เหมาะสำหรับการรักษาและ / หรือการฉีดวัคซีน

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . แบคทีเรีย , สื่อวัฒนธรรมและเงื่อนไขการเจริญเติบโต
x2002-0014 xcc สายพันธุ์ที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้เป็นสายพันธุ์
2002 จากส้มหวานใน Dade County , ฟลอริด้าและตรวจ
ปลูกในลุเรียแบร์ตานิ broth ( ปอนด์ ) ( 10 กรัม ทริพโทน 5 กรัมยีสต์สกัด
และ 5 กรัมโซเดียมคลอไรด์ต่อลิตร ) หรือปอนด์แผ่น ( 1.5% แบคทีเรีย
วุ้น ) ที่ 27
องศาเซลเซียสเป็นเวลา 48 ชั่วโมง
2.2 . การใช้แบคทีเรีย
การเจริญเติบโตของ xcc วัดน้ำปอนด์ค่า pH 7
2 เดือนบัฟเฟอร์และที่แก้ไขเพิ่มเติมกับ HX ( sigmaealdrich St .
หลุยส์ โม ref.153745 ) ที่ 0 , 0.1 , 0.6 , 1.5 , 3 , 6 , 10 และ 20 มม. xcc
ปลูกใน LB broth ค้างคืนและระงับแบคทีเรียคือ
ไฟฟ้า , ล้างและ resuspended ใน MgSO4 ใ 10 มิลลิเมตร
วิเคราะห์การเจริญเติบโตถูกหามออกในปริมาณ 300 มล. ในไมโคร
บ่อที่ใช้เริ่มต้นจากความหนาแน่น 1.5  103 colonyforming
หน่วย ( CFU ) มล.  1 ปรับกับความตั้ง
a600nm . แบคทีเรียถูกบ่มในเครื่องปั่น Rotary สำหรับ 96 H ที่ 26

C
̊และความหนาแน่นของแสงที่ถูกระงับวัดทุก 10 นาที
ใช้ bioscreen C อ่าน ( labsystems โอย เฮลซิงกิ ประเทศฟินแลนด์ ) ชุดละ
a600nm . หลังจากการทดสอบการถ่ายทอดสด / ตาย® ( เทคโนโลยีกับชีวิต
คอร์ป ,คาร์ลสแบด , แคลิฟอร์เนีย , สหรัฐอเมริกา ) ทดสอบทำการประเมินเซลล์ตายที่เกิดจากกรด HX
.
2.3 การเตรียมเชื้อ , การรักษาและวิธีการปลูกเชื้อ

xcc inoculumwas เตรียมน้ำสารอาหารและโตที่ 28
C
24 h เพื่อเข้าสู่ขั้นตอน bacterial suspension คือระดับที่
10000 G 20 นาทีจะแขวนลอยในฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือ ( PBS ;
na2hpo4 þ 40 มม. 25 มม. kh2po4 )และปรับให้เซลล์  104 มล. 1
ให้แนบใบ Inoculations CFU 105 ml และ  1 สำหรับ detached leaf
Inoculations ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( ฟรานซิส et al . , 2010 ) .
9 เดือนเก่า ' ' หวาน สับปะรด ส้ม พืชที่เติบโตใน 2.5 -
L คอนเทนเนอร์ของวัตถุประสงค์ทั่วไปที่ใช้ดินพรุ ( Pro ผสมส่วนประกอบ ;
พรีเมียร์ พืชสวน สีแดงฮิลล์ , PA ) ถูกเก็บรักษาไว้ในเรือนกระจก
ตั้งอยู่ที่ศูนย์การศึกษาและวิจัยส้มในทะเลสาบ
อัลเฟรด ชั้นสี่สัปดาห์ก่อนที่จะรักษาต้นกล้าที่ถูกตัด
กลับไปประมาณ 40 ซม. และเพียงหนึ่งยิงต่อพืช
อนุญาตที่จะเติบโตประมาณ 20e30 ซม. เพื่อรับ 4e5
อ่อนใบ ( 75% ขยาย ) เหมาะสำหรับการรักษาและ หรือ
การฉีดวัคซีน