2.2. PCR amplification of 18S rRNA g

2.2. PCR amplification of 18S rRNA gene and sequencing
Identification of B. gibsoni at molecular level was done by PCR
amplification of 18S rRNA gene from the genomic DNA of 164 blood
samples including 13 microscopic positive B. gibsoni samples. A set of
forward and reverse primers (5′-TGGTTGATCCTGCCAGTA-3′ and 5′-
CTTCTCCTTCCTTTAAGTGA-3′) was used to amplify a gene fragment of
1665 bp and subsequently nested-PCR was performed on this primary
PCR product with internal primers 5′-ATAACCGTGCTAATTGTAGG-3′
and 5′-TGTTATTTCTTGTCACTACC-3′ (specific for B. gibsoni) to amplify
aproductof308bp(Jefferies et al., 2007). As template DNA, 1.0–2.0 μl
of the eluted DNA for primary PCR and 1.0–2.0 μl of 1:10 diluted primary
PCR products were used for nested-PCR, respectively. The primary PCR
reaction was carried out in 25 μl volume with initial denaturation at
94 °C for 5 min, followed by 35 cycles of denaturation at 94 °C for
45 s, annealing at 52 °C for 45 s and extension at 72 °C for 2 min with
20 pMof each primer and a final extension at 72 °C for 7min in thermal
cycler (PTC-200,MJ Research,USA). B. gibsoni genomic DNA and noDNA
template in the reaction vials were used as positive and negative
controls, respectively for each PCR. The above reaction conditions
were maintained for the nested-PCR except for the primer extension of
1 min. The PCR products were electrophoresed in 0.5% Tris-borate-EDTA
agarose gels, stained with ethidium bromide and visualized under UV
light. The 18S rDNA gene fragments of 17 isolates were cloned in pTZ57R/
T
cloning vector (InsTA Clone PCR cloning Kit, Thermo Fisher Scientific,
USA) and custom sequenced at University of Delhi, South campus, New Delhi, India. Restriction enzyme analysis with HinfIwascarriedoutwith
18S rRNA gene fragments of the remaining 30 samples.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.2. PCR amplification 18 ปี rRNA ยีนและลำดับทำ gibsoni Identification B. ระดับโมเลกุล โดย PCRamplification 18 ปี rRNA ยีนจากดีเอ็นเอในจีโนมของ 164 เลือดตัวอย่างรวมทั้งตัวอย่าง gibsoni B. บวกด้วยกล้องจุลทรรศน์ 13 ชุดของไพรเมอร์ที่ไปข้างหน้า และย้อนกลับ (5′-TGGTTGATCCTGCCAGTA-3′ และ 5′-CTTCTCCTTCCTTTAAGTGA-3′) ใช้เพื่อขยายส่วนยีนของค.ศ. 1665 bp และ PCR ซ้อนทำตามหลักนี้ผลิตภัณฑ์ PCR กับไพรเมอร์ภายใน 5′-ATAACCGTGCTAATTGTAGG-3′และ 5′-TGTTATTTCTTGTCACTACC-3′ (specific สำหรับ B. gibsoni) เพื่อขยายaproductof308bp (Jefferies et al. 2007) เป็นแม่แบบดีเอ็นเอ 1.0 – 2.0 μlของดีเอ็นเอ eluted สำหรับหลัก PCR และ μl 1.0 – 2.0 1:10 ผสมหลักผลิตภัณฑ์ PCR ใช้สำหรับซ้อน PCR ตามลำดับ PCR หลักปฏิกิริยาดำเนินการ 25 μl เสียงกับ denaturation เริ่มต้นที่94 ° C 5 นาที ตาม ด้วยรอบ 35 ของ denaturation ที่ 94 ° C สำหรับ45 s หลอม 52 ° c สำหรับ s และนามสกุลที่ 72 ° C เป็นเวลา 2 นาทีกับ 45สีรองพื้น 20 pMof และนามสกุลพิจารณาที่ 72 ° C เป็นเวลา 7 นาทีในความร้อนcycler (PTC 200, MJ วิจัย สหรัฐอเมริกา) ดีเอ็นเอของจีโนมของ B. gibsoni และ noDNAใช้ต้นแบบในหลอดปฏิกิริยาเป็นบวก และลบควบคุม ตามลำดับสำหรับ PCR แต่ละ เงื่อนไขปฏิกิริยาข้างต้นยังคงไว้สำหรับการซ้อน PCR ยกเว้นนามสกุลรองพื้นของ1 นาที ผลิตภัณฑ์ PCR ถูก electrophoresed 0.5% ทริ-borate-EDTAagarose เจล เลอะโบรไมด์ ethidium ดู และภายใต้ UVแสง ถูกโคลนบางส่วนของยีน rDNA 18 ปีของแยก 17 ใน pTZ57R /Tเวกเตอร์ (InsTA โคลน PCR โคลนชุด เทอร์โม Fisher Scientific โคลนประเทศสหรัฐอเมริกา และที่มหาวิทยาลัยเดลี วิทยาเขตใต้ นิวเดลี อินเดียที่เรียงลำดับแบบกำหนดเอง การวิเคราะห์เอนไซม์จำกัด ด้วย HinfIwascarriedoutwith18 ปีชิ้นส่วนยีน rRNA ของเหลือ 30 ตัวอย่าง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.2 PCR ampli ไอออนบวก Fi ของยีน 18S rRNA ลำดับและ
ไอออนบวก Fi ระบุของ B. gibsoni ในระดับโมเลกุลทำโดยวิธี PCR
ไอออนบวก ampli Fi ของ 18S rRNA ยีนจากดีเอ็นเอของเลือด 164
ตัวอย่างรวม 13 ตัวอย่างกล้องจุลทรรศน์บวกบี gibsoni ชุด
ไปข้างหน้าและย้อนกลับไพรเมอร์ (5'-TGGTTGATCCTGCCAGTA-3 'และ 5'-
CTTCTCCTTCCTTTAAGTGA-3') ถูกนำมาใช้เพื่อขยายส่วนของยีน
1665 BP และต่อมาซ้อนกัน-PCR ที่ได้ดำเนินการในหลักนี้
ผลิตภัณฑ์ PCR กับไพรเมอร์ภายใน 5 '-ATAACCGTGCTAATTGTAGG-3'
และ 5'-TGTTATTTCTTGTCACTACC-3 '(FI C speci สำหรับบี gibsoni) เพื่อขยาย
aproductof308bp (Jefferies et al., 2007) ในฐานะที่เป็นดีเอ็นเอแม่แบบ 1.0-2.0 ไมโครลิตร
ของดีเอ็นเอชะประถม PCR และ 1.0-2.0 ไมโครลิตร 1:10 เจือจางหลัก
ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ถูกนำมาใช้สำหรับการซ้อนกัน-PCR ตามลำดับ PCR หลัก
ปฏิกิริยาได้ดำเนินการในปริมาณไมโครลิตร 25 denaturation เริ่มต้นที่
94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีตามด้วย 35 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา
45 วินาที, การอบที่ 52 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 45 วินาทีและนามสกุลที่ 72 ° C 2 นาทีกับ
20 pMof แต่ละไพรเมอร์และขยาย Fi NAL ที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 7 นาทีในการระบายความร้อน
Cycler (PTC-200, MJ วิจัย, สหรัฐอเมริกา) บี gibsoni ดีเอ็นเอและ noDNA
แม่แบบในขวดปฏิกิริยาที่ถูกนำมาใช้เป็นบวกและลบ
ควบคุมตามลำดับสำหรับแต่ละ PCR เงื่อนไขการเกิดปฏิกิริยาดังกล่าวข้างต้น
ได้รับการดูแลสำหรับที่ซ้อนกัน-PCR ยกเว้นสำหรับส่วนขยายของไพรเมอร์
1 นาที ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์มี electrophoresed 0.5% Tris-borate-EDTA
เจล agarose, ย้อมด้วย ethidium bromide และมองเห็นภายใต้แสงยูวี
แสง 18S rDNA ยีนชิ้นส่วนของ 17 ไอโซเลทถูกโคลนใน pTZ57R /
T
โคลนเวกเตอร์ (Insta โคลน PCR Kit โคลนเทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์ Fi C,
USA) และกำหนดเองติดใจที่มหาวิทยาลัยเดลีวิทยาเขตภาคใต้, นิวเดลีประเทศอินเดีย วิเคราะห์เอนไซม์ จำกัด กับ HinfIwascarriedoutwith
18S rRNA ชิ้นส่วนของยีนที่เหลืออีก 30 ตัวอย่าง