Reverse transcriptionIn a 200 µl ca

Reverse transcription
In a 200 µl capacity PCR tube, 12 µl of
extract, 1.5 µl of 5X reverse transcriptase reaction
buffer (enzyme component), 0.5 µl (1
unit) of cloned DNase I (TaKaRa, Otsu, Japan),
and 1 µl of AMW were combined. It was then
incubated at 37ºC for 30 minutes, followed by
5 minutes incubation at 75ºC, using a thermal
cycler (GeneAmp 9700, ABI, California, USA)
and kept in an ice bath. The high sensitivity
reverse transcription (RT) was performed by
adding 7.5 µl of RNA (10 nM), 0.75 µl of dNTPs
(10 mM each), 0.75 µl of random 6mers primer
(100 µM), 0.75 µl of DTT (100 mM), 15 U of
RNase inhibitor (TaKaRa, Otsu, Japan), 2.25
µl of 5X RT reaction buffer, 150 U of Super
Script II Reverse Transcriptase (Invitrogen,
California, USA) and up to 15 µl of AMW into
a 0.2 ml capacity PCR tube. This mixture was
then incubated for 10 minutes at 25ºC, 2 hours
at 42ºC, and 5 minutes at 99ºC. The cDNA
thereby obtained was stored at 4ºC until
tested.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

กลับ transcriptionในหลอด 200 µl ผลิต PCR, µl 12 ของแยก µl 1.5 ของปฏิกิริยาย้อนกลับ transcriptase X 5บัฟเฟอร์ (ส่วนประกอบเอนไซม์) 0.5 µl (1หน่วย) ของ DNase โคลนผม (TaKaRa โอสึ ญี่ปุ่น),และมีรวม 1 µl ของ AMW ถูกแล้วincubated ที่ 37ºC 30 นาที ตามด้วยนาทีที่ 5 คณะทันตแพทยศาสตร์ที่ 75ºC ใช้ความร้อนcycler (GeneAmp 9700, ABI แคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา)และเก็บไว้ในห้องน้ำเป็นน้ำแข็ง ความไวสูงย้อน transcription (RT) ที่ดำเนินการโดยเพิ่ม µl 7.5 ของอาร์เอ็นเอ (10 nM), 0.75 µl ของ dNTPs(10 mM แต่ละ), µl 0.75 พื้นสุ่ม 6mers(100 µM), µl 0.75 ของ DTT (100 mM), 15 U ของสารยับยั้ง RNase (TaKaRa โอสึ ญี่ปุ่น), 2.25µl บัฟเฟอร์ปฏิกิริยา X RT 5, 150 U ของซูเปอร์สคริปต์ II กลับ Transcriptase (Invitrogenรัฐแคลิฟอร์เนีย สหรัฐอเมริกา) ถึง 15 µl ของ AMW เป็นหลอด PCR 0.2 ml กำลังการผลิต ส่วนผสมนี้ได้incubated 10 นาทีที่ 25ºC ชั่วโมงที่ 2 แล้ว42ºC และ 5 นาทีที่ 99ºC CDNAจึงได้ถูกเก็บไว้ที่ 4ºC จนถึงทดสอบ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ย้อนกลับถอดความหลอดใน PCR ความจุ 200 ไมโครลิตร 12 ไมโครลิตรของสารสกัดจาก1.5 ไมโครลิตรของ 5X กลับปฏิกิริยา transcriptase บัฟเฟอร์ (ส่วนประกอบของเอนไซม์), 0.5 ไมโครลิตร (1 หน่วย) ของ DNase โคลนฉัน (Takara, Otsu, ญี่ปุ่น) และ 1 ไมโครลิตรของ AMW มารวมกัน มันถูกแล้วบ่มที่37ºCเป็นเวลา 30 นาทีตามด้วยการบ่ม5 นาทีที่75ºCโดยใช้ความร้อนCycler (GeneAmp 9700, ABI, California, USA) และเก็บไว้ในห้องอาบน้ำน้ำแข็ง ความไวสูงถอดความย้อนกลับ (RT) ได้ดำเนินการโดยการเพิ่ม7.5 ไมโครลิตรของอาร์เอ็นเอ (10 นาโนเมตร) 0.75 ไมโครลิตรของ dNTPs (10 มิลลิแต่ละ) 0.75 ไมโครลิตรของไพรเมอร์ 6mers สุ่ม(100 ไมครอน) 0.75 ไมโครลิตรของ DTT (100 มิลลิเมตร) 15 ยูยับยั้งRNase (Takara, Otsu, ญี่ปุ่น) 2.25 ไมโครลิตรของ buffer ปฏิกิริยา 5X RT 150 U ของซูเปอร์สคริปที่สองกลับTranscriptase (Invitrogen, California, USA) และถึง 15 ไมโครลิตรของ AMW เข้า0.2 มล. PCR กำลังการผลิต หลอด ส่วนผสมนี้ถูกบ่มแล้วเป็นเวลา 10 นาทีที่ 25 องศาเซลเซียส 2 ชั่วโมงที่42ºCและเพียง5 นาทีที่99ºC ยีนที่ได้รับจึงถูกเก็บไว้ที่4ºCจนกว่าการทดสอบ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ย้อนกลับถอดความ
ใน 200 µ L ความจุ PCR หลอด 12 µ l
สกัด 1.5 ลิตรµ 5x reverse transcriptase ปฏิกิริยา
บัฟเฟอร์ ( ส่วนเอนไซม์ ) , 0.5 ลิตร ( 1 µ
หน่วย ) ของตัวตรวจหา ADNase ( ทาคาระ โอทสุ ญี่ปุ่น ) ,
1 l µ AMW ได้รวมกัน มันเป็นแล้ว
ºบ่มที่ 37 องศาเซลเซียส 30 นาที ตามด้วยนาทีที่ 75 º 4
5 C โดยใช้วงจรความร้อน
( geneamp 9700 , ABI , California , USA )
และเก็บไว้ในน้ำแข็ง อาบ ความไวสูง
ย้อนกลับถอดความ ( RT ) แสดงโดย
เพิ่ม 7.5 µ L ของอาร์เอ็นเอ ( 10 nm ) 0.75 ลิตรµ dntps
( 10 มม. แต่ละ ) , 0.75 µผมสุ่ม 6mers รองพื้น
( 100 µ M ) 0.75 ลิตรµ DTT ( 100 mM ) , 15 ของ
U เลส inhibitor ( ทาคาระ โอทสุ ญี่ปุ่น ) , 2.25
µ l 5x RT ปฏิกิริยาบัฟเฟอร์ , 150 U สคริปต์ซุปเปอร์
2
( Invitrogen reverse transcriptase , แคลิฟอร์เนียสหรัฐอเมริกา ) และ 15 µ l AMW เป็น 0.2 มล.
ความจุ PCR หลอด ส่วนผสมนี้
จากนั้นบ่มเป็นเวลา 10 นาทีที่ 25 º C
2 ชั่วโมง 42 º C , และ 5 นาทีที่ 99 º C cDNA
จึงได้มาเก็บไว้ที่ 4 องศาเซลเซียส จนº
ทดสอบ