2.14. Real time-reverse transcripti

2.14. Real time-reverse transcription PCR (qRT-PCR)
Real time reverse transcription-PCR (qRT-PCR) was performed to determine
mRNA levels of a number of cell cycle and apoptosis-related genes on the A431
and SK-MEL-28 cells subjected to the indicated treatments. Total cellular RNA
was isolated using TRIzol solution (Invitrogen, Australia) according to the manufacturer’s instructions. The quality of RNA was determined using 1.2% formaldehyde–
agarose gel. The DNA contamination from RNA preparation was removed by using
Ambion TURBO DNA-free DNase treatment reagent (Applied Biosystems, Australia).
Reverse transcription was carried out with 1lg of total RNA in a reaction volume of
20ll using a High Capacity cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems,
Australia) following the manufacturer’s instructions. Real time PCR was carried
out in 20ll of PCR mixture consisting of 10llof2GoTaq

qPCR Master Mix
(Promega Corporation, Australia) and 10ll of primers and 2ll cDNA sample on a
Rotorgene 3000 Thermocycler (Corbett Life Science, Sydney, NSW, Australia). Each
sample was amplified in triplicate. The mRNA level of the beta-actin house keeping
gene was also determined by qRT-PCR in each cDNA sample to normalize the
expression of genes of interest (GOI). The primers used are listed inTable 1. The
PCR condition for each particular amplicon was optimized to establish a linear
relationship between threshold cycle (Ct) values and the input amount of cDNA
(a correlation coefficient >95%) and to achieve PCR efficiency around 100%
(± 10%). Cycling was followed by Melt Curve analysis to confirm the specificity ofhe PCR product. Quantitative analysis was performed using Q-Gene software (Simon, 2003). The expression of levels of GOI was normalized to the expression levels
of beta-actin, which exhibited comparable expression across different groups (data
not shown). The ratio of GOI/beta-actin was compared among samples, and the fold
change of GOI expression was obtained by setting the values from the untreated
cells to one

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.14 กลับเวลาจริง transcription PCR (qRT-PCR)เวลาจริงกลับ transcription-PCR (qRT-PCR) ดำเนินการตรวจสอบระดับ mRNA ของวงจรเซลล์และยีนที่เกี่ยวข้องกับการ apoptosis ใน A431และการรักษาที่ระบุเซลล์ SK-เมล-28 รวมเซลล์อาร์เอ็นเอถูกแยกโดยใช้ TRIzol โซลูชั่น (Invitrogen ออสเตรเลีย) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต กำหนดคุณภาพของอาร์เอ็นเอโดยใช้ฟอร์มาลดีไฮด์ 1.2%-เจลอาบ agarose ปนดีเอ็นเออาร์เอ็นเอเตรียมถูกเอาออก โดยใช้เทอร์โบ Ambion ดีเอ็นเอฟรี DNase รักษารีเอเจนต์ (ใช้ Biosystems ออสเตรเลีย)Transcription กลับถูกดำเนินการ ด้วย 1lg ของอาร์เอ็นเอรวมปริมาณปฏิกิริยาของ20ll ใช้ cDNA จุสูงชุดกลับ Transcription (Biosystems ใช้ออสเตรเลีย) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ทำ real time PCRใน 20ll ส่วนผสม PCR ประกอบด้วย 10llof2 GoTaqqPCR ผสมหลัก(Promega Corporation ออสเตรเลีย) และ 10ll ของไพรเมอร์และตัวอย่างของ cDNA 2ll ในการRotorgene 3000 Thermocycler (คอร์เบตต์วิทยาศาสตร์ ซิดนีย์ นิวเซาธ์เวลส์ ออสเตรเลีย) แต่ละมีขยายตัวอย่างใน triplicate ระดับ mRNA ของแอกตินเบต้าสะอาดยังถูกกำหนด โดย qRT PCR ในแต่ละตัวอย่าง cDNA ยีนเพื่อลดขนาดการนิพจน์ของยีนที่น่าสนใจ (โกอี) ไพรเมอร์ที่ใช้จะแสดงรายการ inTable 1 ที่เงื่อนไขแต่ละ amplicon เฉพาะ PCR ถูกเหมาะสร้างแบบเชิงเส้นความสัมพันธ์ระหว่างขีดจำกัดรอบค่า (Ct) และยอดนำเข้าของ cDNA(สัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ > 95%) และ เพื่อให้บรรลุประสิทธิภาพ PCR ประมาณ 100%(± 10%) ขี่จักรยานได้ตาม ด้วยโค้งละลายวิเคราะห์เพื่อยืนยันผลิตภัณฑ์ PCR ofhe specificity การวิเคราะห์เชิงปริมาณที่ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ Q-ยีน (Simon, 2003) ค่าของระดับของโกอีได้ตามปกติระดับนิพจน์ของเบต้าแอกติน ซึ่งจัดแสดงนิพจน์สามารถเปรียบเทียบระหว่างกลุ่มต่าง ๆ (ข้อมูลไม่แสดง) อัตราส่วนของโกอี/เบต้าแอกตินถูกเปรียบเทียบระหว่างตัวอย่าง และพับเปลี่ยนนิพจน์โกอีได้รับ โดยการตั้งค่าจากการไม่ถูกรักษาเซลล์หนึ่ง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.14 ถอดความแบบ Real-time กลับ PCR (qRT-PCR)
เวลาจริงถอดความ-PCR ย้อนกลับ (qRT-PCR)
ได้ดำเนินการเพื่อตรวจสอบระดับmRNA ของจำนวนของวงจรของเซลล์และยีนการตายของเซลล์ที่เกี่ยวข้องใน A431
และ SK-MEL-28 เซลล์ภายใต้ เพื่อการรักษาที่ระบุ รวม RNA
โทรศัพท์มือถือที่แยกได้ใช้วิธีTrizol (Invitrogen, ออสเตรเลีย) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต คุณภาพของอาร์เอ็นเอที่ได้รับการพิจารณาโดยใช้ 1.2% formaldehyde-
เจล agarose การปนเปื้อนดีเอ็นเอจากการเตรียมอาร์เอ็นเอจะถูกลบออกโดยใช้
Ambion TURBO ดีเอ็นเอฟรีน้ำยารักษา DNase (Applied Biosystems, ออสเตรเลีย).
ย้อนกลับถอดความได้ดำเนินการกับ 1lg ของอาร์เอ็นเอรวมในปริมาณปฏิกิริยาของ
20ll ใช้ความจุสูงยีนย้อนกลับถอดความชุด ( Applied Biosystems,
ออสเตรเลีย) ทำตามคำแนะนำของผู้ผลิต PCR เวลาจริงได้ดำเนินการใน 20ll ผสม PCR ซึ่งประกอบด้วย 10llof2? GoTaq? qPCR โทผสม(Promega คอร์ปอเรชั่นออสเตรเลีย) และ 10ll ของไพรเมอร์และตัวอย่าง cDNA 2LL บนRotorgene 3000 Thermocycler (Corbett วิทยาศาสตร์ชีวภาพ, ซิดนีย์, NSW, ออสเตรเลีย) . แต่ละตัวอย่างถูกขยายในเพิ่มขึ้นสามเท่า ระดับ mRNA ของบ้านเบต้าโปรตีนรักษายีนยังถูกกำหนดโดยqRT-PCR ในแต่ละตัวอย่างยีนปกติที่จะแสดงออกของยีนที่น่าสนใจ(ก้อย) ไพรเมอร์ที่ใช้มีการระบุไว้ inTable 1. สภาพ PCR สำหรับแต่ละ amplicon โดยเฉพาะอย่างยิ่งได้รับการเพิ่มประสิทธิภาพในการสร้างการเชิงเส้นความสัมพันธ์ระหว่างวงจรเกณฑ์(CT) ค่านิยมและจำนวนเงินที่ใส่ของยีน(ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์> 95%) และเพื่อให้เกิดประสิทธิภาพ PCR ประมาณ 100 % (± 10%) ปั่นจักรยานตามมาด้วยการละลาย Curve วิเคราะห์เพื่อยืนยันความจำเพาะ ofhe ผลิตภัณฑ์ PCR การวิเคราะห์เชิงปริมาณได้รับการดำเนินการโดยใช้ซอฟแวร์ Q-ยีน (Simon, 2003) การแสดงออกของระดับของก้อยที่ได้รับปกติกับระดับการแสดงออกของโปรตีนเบต้าซึ่งจัดแสดงผลงานการแสดงออกเปรียบในกลุ่มที่แตกต่างกัน(ข้อมูลไม่แสดง) อัตราส่วนของก้อย / เบต้าโปรตีนที่ถูกเมื่อเทียบในกลุ่มตัวอย่างและพับการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของก้อยได้รับโดยการตั้งค่าจากได้รับการรักษาเซลล์ให้เป็นหนึ่ง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.14 . เวลาย้อนกลับ PCR ถอดความจริง ( ข้าพเจ้า PCR )
เวลาย้อนกลับ PCR ถอดความจริง ( ข้าพเจ้า PCR ) ได้ทำการศึกษาระดับ mRNA
ของวัฎจักรเซลล์เซลล์ที่เกี่ยวข้องและยีนในเซลล์และ a431
sk-mel-28 ต้องพบการรักษา
เซลล์อาร์เอ็นเอทั้งหมดได้ใช้ trizol โซลูชั่น ( Invitrogen , ออสเตรเลีย ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตคุณภาพของอาร์เอ็นเอ ตั้งใจใช้ 1.2% ฟอร์มาลดีไฮด์–
เจล . ดีเอ็นเออาร์เอ็นเอจะถูกลบออกโดยการปนเปื้อนจากการใช้เทอร์โบ
ambion ดีเอ็นเอรักษาตรวจหา ADNase ฟรี Reagent ( Applied Biosystems ออสเตรเลีย )
ย้อนกลับถอดความได้ดำเนินการกับ 1lg ของ RNA ทั้งหมดในปฏิกิริยาปริมาณ
20ll ใช้ความจุสูงชุดยีนถอดความย้อนกลับ ( Applied Biosystems
,ออสเตรเลีย ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต เวลาจริงสามารถดำเนินการใน 20ll
สามารถผสมประกอบด้วย 10llof2  gotaq

qpcr  Master Mix
( promega Corporation , ออสเตรเลีย ) และ 10ll ของไพรเมอร์ 2ll cDNA และตัวอย่างใน
rotorgene 3000 เทอร์มอไซเคล ์ ( Corbett ชีวิตวิทยาศาสตร์ , ซิดนีย์ , NSW , ออสเตรเลีย )
ตัวอย่างแต่ละของทั้งสามใบ ระดับ mRNA ของเบต้าแอคตินบ้านรักษา
ถูกกำหนดโดยยีนแต่ละยีนข้าพเจ้า PCR ในตัวอย่างปกติ
การแสดงออกของยีนที่น่าสนใจ ( โกย ) ไพรเมอร์ที่ใช้อยู่ intable 1
ภาพซึ่งแต่ละ และยังเหมาะที่จะสร้างความสัมพันธ์เชิงเส้นระหว่างวงจร
ธรณีประตู ( CT ) ค่านิยมและใส่ปริมาณ cDNA
( สัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ > 95% ) และเพื่อให้บรรลุประสิทธิภาพโดยรอบ 100 %
( ± 10% )จักรยานตามละลายการวิเคราะห์ทางโค้งยืนยันความจำเพาะ ofhe เทคนิคผลิตภัณฑ์ การวิเคราะห์เชิงปริมาณโดยใช้ซอฟต์แวร์ q-gene ( Simon , 2003 ) การแสดงออกของระดับของ กอยเป็นปกติต่อระดับการแสดงออกของเบต้าแอคติน
ซึ่งมีการแสดงออกที่แตกต่างกัน ( ข้อมูลเปรียบเทียบในกลุ่ม
ไม่แสดง ) อัตราส่วนของ กอย / เบต้าแอคติน เปรียบเทียบระหว่างกลุ่มตัวอย่าง และพับ
การเปลี่ยนแปลงการแสดงออกของ กอยได้โดยการตั้งค่าจากเซลล์ดิบหนึ่ง