2.6. Real-time PCRThe sequences of

2.6. Real-time PCR
The sequences of forward and reverse primers were designed using
Primer3 software (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_
www.cgi) and analysis of folding was performed to minimize risk of
mismatches. Primers used for PCNA gene expression were (F)
5′-GCTGCTCGATTTAGACTGTGA-3′ and (R) 5′-CTTGACTCCTTCCTTTG
TACA-3′ (Franco et al., 2010). Primers used for CIR gene expression
were (F) 5′-AACCCTGCCTGACAAAAATG-3′ and (R) 5′-TACACGATCA
CCTCCCCTG-3′ (Jouaux et al., 2012). Quantitative RT-PCR analysis was
performed on a MiQ Cycler (BioRad, France) using the Absolute Blue
QPCR SYBR Green fluorescein Mix (ThermoFisher). Five nanogram
cDNA of each sample was used and PCR conditions consisted of one
cycle of 1 min 30 s at 95 °C and 45 cycles consisting of 15 s at 95 °C
and a final 45 s at 60 °C. Accurate amplification of the target sequence
was assessed by constructing melting curves (80 cycles of 10 s, increasing
the temperature by 0.5 °C step from 55 °C to 95 °C). The reference
gene used in this study was EF1α (C. gigas EF1: locus BAD15289.1 GI:
46359620, accession number AB122066.1) amplified with the primers
(F) 5′-ACCACCCTGGTGAGATCAAG-3′ and (R) 5′-ACGACGATCGCATTTC
TCTT-3′ (Jouaux et al., 2012).
2.7. Quantitative measurement of reproductive effort: gonadal tubule
index (GTi)
Histological slides of stained transversal sections (30 for each set
and sampling date) were scanned (SupercoolScan 9000, Nikon) and
measurements of reproductive effort was performed on Vision Assistant
software. The gonadal area (GA) located around the digestive
gland contains gonadal tubules (GT) and storage tissue in varying
proportions. The GTi (Gonadal Tubule index) was defined as the percentage
of gonadal tubule occupation in relation to gonadal area
(Jouaux et al., 2010). The GTi was expressed as means±standard deviation
and were compared using a student test. Values were significantly
different for pb0.05.
2.8. Statistical analysis
The GTiwas expressed as the mean±standard deviation and groups

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.6 real-time PCR
ลำดับของไปข้างหน้าและย้อนกลับไพรเมอร์ได้รับการออกแบบโดยใช้
ซอฟแวร์ Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_
www.cgi) และการวิเคราะห์ของการพับได้ดำเนินการเพื่อลดความเสี่ยงของ
ไม่ตรงกัน ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับการแสดงออกของยีน PCNA ได้ (F)
5'-GCTGCTCGATTTAGACTGTGA-3 'และ (R) 5'-CTTGACTCCTTCCTTTG
TACA-3 '(ฝรั่งเศส et al., 2010) ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับ CIR ที่การแสดงออกของยีน
ได้ (F) 5'-AACCCTGCCTGACAAAAATG-3 'และ (R) 5'-TACACGATCA
CCTCCCCTG-3 '(Jouaux et al., 2012) ปริมาณการวิเคราะห์ RT-PCR ได้รับการ
ดำเนินการเกี่ยวกับ Miq Cycler (BioRad, ฝรั่งเศส) โดยใช้แอ็บโซลูสีฟ้า
สีเขียว SYBR qPCR fluorescein ผสม (ThermoFisher) ห้านาโนกรัม
cDNA ของแต่ละตัวอย่างถูกนำมาใช้และเงื่อนไข PCR ประกอบด้วยหนึ่ง
วงจรของ 1 นาที 30 วินาทีที่ 95 องศาเซลเซียสและ 45 รอบซึ่งประกอบด้วย 15 วินาทีที่ 95 ° C
และสุดท้าย 45 S ที่ 60 ° C เครื่องขยายเสียงที่ถูกต้องของเป้าหมายลำดับ
ได้รับการประเมินโดยการสร้างเส้นโค้งละลาย (80 รอบใน 10 วินาที, การเพิ่ม
อุณหภูมิ 0.5 ° C จากขั้นตอนที่ 55 ° C ถึง 95 ° C) อ้างอิง
ยีนที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้มีEF1α (ค gigas EF1: สถานที BAD15289.1 GI:
46359620 จำนวนภาคยานุวัติ AB122066.1) ขยายกับไพร
(F) 5'-ACCACCCTGGTGAGATCAAG-3 'และ (R) 5'- ACGACGATCGCATTTC
TCTT-3 '(Jouaux et al., 2012).
2.7 การวัดเชิงปริมาณของความพยายามในการสืบพันธุ์: ท่ออวัยวะสืบพันธุ์
ดัชนี (GTi)
สไลด์เนื้อเยื่อส่วนที่ตัดขวางเปื้อน (30 สำหรับแต่ละชุด
และวันที่สุ่มตัวอย่าง) ถูกสแกน (SUPERCOOLSCAN 9000, Nikon) และ
การวัดของความพยายามในการสืบพันธุ์ที่ได้ดำเนินการในวิสัยทัศน์ผู้ช่วย
ซอฟแวร์ บริเวณอวัยวะสืบพันธุ์ (GA) ตั้งอยู่รอบ ๆ ทางเดินอาหาร
ต่อมมีท่ออวัยวะสืบพันธุ์ (GT) และเนื้อเยื่อการจัดเก็บข้อมูลที่แตกต่างกันใน
สัดส่วน GTi (Gonadal ดัชนีท่อเล็ก) ถูกกำหนดเป็นอัตราร้อยละ
ของการยึดครองท่ออวัยวะสืบพันธุ์ในความสัมพันธ์กับพื้นที่อวัยวะสืบพันธุ์
(Jouaux et al., 2010) GTi ถูกแสดงเป็นหมายถึง±ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน
และถูกนำมาเปรียบเทียบโดยใช้การทดสอบนักเรียน ค่าอย่างมีนัยสำคัญ
ที่แตกต่างกันสำหรับ pb0.05.
2.8 การวิเคราะห์ทางสถิติ
GTiwas แสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานและกลุ่ม

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.6 เวลาจริงเพื่อไปข้างหน้าและย้อนกลับลำดับ

โดยออกแบบการใช้ซอฟต์แวร์ primer3 ( http : / / โฟรโด้ วี ของ MIT . edu / cgi bin / primer3 / primer3_
www.cgi ) และการวิเคราะห์ของการพับได้ลดความเสี่ยงของ
ความไม่ . ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับการแสดงออกของยีน PCNA ได้ ( F )
5 ’ - ’ gctgctcgatttagactgtga-3 ( R ) 5 ’ - ’ cttgactccttcctttg
taca-3 ( Franco et al . , 2010 )ไพรเมอร์ใช้ cir ยีน
( F ) 5 ’ - ’ aaccctgcctgacaaaaatg-3 ( R ) 5 ’ - ’ tacacgatca
cctcccctg-3 ( jouaux et al . , 2012 ) การวิเคราะห์เชิงปริมาณนี้เป็น
แสดงบน friends รอบ ( biorad , ฝรั่งเศส ) ใช้บลู
qpcr SYBR กรีนแบบี่ผสม ( thermofisher ) 5 นาโนกรัม
cDNA ของแต่ละตัวอย่างถูกใช้และเงื่อนไขซึ่งประกอบด้วยหนึ่ง
รอบ 1 นาที 30 วินาทีที่ 95 องศา C และ 45 รอบประกอบด้วย 15 s ที่ 95 องศา C
และสุดท้าย 45 S ที่ 60 องศา ที่ถูกต้องเพิ่มปริมาณเป้าหมายลำดับ
ถูกประเมินโดยการสร้างเส้นโค้งการละลาย ( 80 รอบ 10 เพิ่มอุณหภูมิ 0.5 ° C
55 ° C ขั้นตอนจาก ถึง 95 องศา C ) อ้างอิง
ยีนที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ คือ ef1 α ( C . ศึกษา ef1 : ความเชื่อ bad15289.1 กี :
46359620 ความสนใจจำนวน ab122066 .1 ) ขยายด้วยไพรเมอร์
( F ) 5 ’ - ’ accaccctggtgagatcaag-3 ( R ) 5 ’ - ’ acgacgatcgcatttc
tctt-3 ( jouaux et al . , 2012 ) .
2.7 . การวัดความพยายามเชิงปริมาณ : ดัชนีการสืบพันธุ์ ( GTI )

ส่วนของภาพนิ่งที่พบในส่วนที่เปื้อน ( 30 ชุดละ
และวันที่คน ) สแกน ( supercoolscan 9000 , Nikon ) และ
การวัดความพยายามการสืบพันธุ์คือใช้ซอฟต์แวร์ผู้ช่วย
วิสัยทัศน์ พื้นที่ของ ( GA ) ตั้งอยู่บริเวณต่อมมีท่อทางเดินอาหาร
เซลล์ต้นกำเนิด ( GT ) และกระเป๋าเนื้อเยื่อที่
สัดส่วน ส่วนจีทีไอ ( ดัชนีของท่อ ) หมายถึง ร้อยละของไขมันในท่อทางอาชีพ


( พื้นที่ของ jouaux et al . , 2010 )โดย GTI ซึ่งหมายถึงค่าส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน และเปรียบเทียบ±
ใช้การทดสอบนักเรียน ค่าแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ pb0.05
.
2.8 . การวิเคราะห์ทางสถิติ
gtiwas แสดงเป็นค่าเฉลี่ยส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานและกลุ่ม±