3.6. Application of quantitative re

3.6. Application of quantitative real-time PCR for meat adulteration
Conventional PCR techniques are typically used to obtain qualitative
results for the identified species, although real-time PCR has
been demonstrated as a useful tool for the determination of different
species, even in adulterated foodstuffs (Fajardo, González,
Rojas, García, & Martín, 2010; Fajardo et al., 2008). Because this
method is easily and reliably applied to survey food products,
real-time PCR is now generally utilized worldwide. In the present
study, the specificity of real-time PCR was first evaluated using
SYBR Green I dye and the TnI, MRP and Tmod gene sequences from
pork, chicken, ostrich, goat and beef (Supplemental Table 2). The linearity and standard curve for real-time PCR were determined
using cDNA from each target species. The cDNA templates were
diluted to 2000, 200, 20, 2 and 0.2 ng. The amplification curves
were stably obtained when the cDNA template was lowered to
0.2 ng. The calculated R2 values of the standard curves were
0.992, 0.992, 0.994, 0.995 and 0.990 for pork, chicken, ostrich, goat
and beef cDNA, respectively, at a range of 0.2–2000 ng (data not
shown). Additionally, the slopes for each species were 3.14,
3.33, 3.14, 3.07 and 3.37, consistent with the theoretical
value (3.32), achieved with a PCR efficiency of 100% (data not
shown). The Ct values, presented as the means and standard deviation,
obtained using the cDNA templates for the five meat species
for real-time PCR are shown in Supplemental Table 4.
To assess the accuracy of this system for meat adulteration
using real-time PCR, we used the Ct values to calculate the true
and experiment values at different ratios of meat cDNA templates
from pork (P), chicken (C), ostrich (O), goat (G) and beef (B), mixed
together to generate six combinations (Table 1). The abbreviations
of the six mixtures were MSC, MSO, MSG, MSB, MSP and MSA for real-time PCR using SYBR Green I. The values for the coefficient of
variation (CV) for the six mixtures ranged from 0.42% to 4.82% for
MSC, 0.7% to 2.05% for MSO, 0.28% to 2.98% for MSG, 0.87% to 3.08%
for MSB, 0.69 to 2.33% for MSP and 0.69% to 3.11% for MSA, respectively.
The error rate was 0.41–12.01% for MSC, 0.74–2.05% for
MSO, 0.28–6.98% for MSG, 0.87–3.08% for MSB, 0.69–2.33% for
MSP and 0.69–3.11% for MSA. Altogether, these results showed
that the CV and error rate were within the acceptable range under
10% and 20% and demonstrated that this method is reliable for the
analysis of meat adulteration (Karlen, McNair, Perseguers, Mazza,
& Mermod, 2007).

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3.6 การประยุกต์ใช้เทคนิค PCR แบบ real-time
เชิงปริมาณเนื้อสัตว์เจือปนเทคนิคPCR
ทั่วไปมักจะใช้เพื่อให้ได้คุณภาพผลชนิดระบุแม้ว่าPCR แบบ real-time
ได้รับการพิสูจน์ว่าเป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์สำหรับการวัดที่แตกต่างกันชนิดที่แม้จะอยู่ในอาหารปลอมปน
(ฟาจาร์โด , González,
Rojas, การ์เซียและมาร์ติน 2010. Fajardo et al, 2008)
เพราะวิธีการได้อย่างง่ายดายและนำไปใช้อย่างน่าเชื่อถือเพื่อสำรวจผลิตภัณฑ์อาหาร,
PCR เวลาจริงคือตอนนี้ใช้โดยทั่วไปทั่วโลก ในปัจจุบันการศึกษาความจำเพาะของ PCR แบบ real-time ได้รับการประเมินครั้งแรกที่ใช้สีเขียวSYBR ผมย้อมและ TNI ที่ MRP และ TMOD ลำดับยีนจากเนื้อหมู, ไก่, นกกระจอกเทศ, แพะและเนื้อวัว (เพิ่มเติมตารางที่ 2) เส้นตรงและเส้นโค้งมาตรฐาน PCR แบบ real-time ได้รับการพิจารณาโดยใช้ยีนจากแต่ละสายพันธุ์เป้าหมาย cDNA แม่ถูกลดลงเหลือ2000 200, 20, 2 และ 0.2 นาโนกรัม เส้นโค้งขยายได้รับเสถียรเมื่อแม่แบบยีนถูกลดลงไป0.2 นาโนกรัม คำนวณค่า R2 โค้งมาตรฐานเป็น0.992, 0.992, 0.994, 0.995 และ 0.990 เนื้อหมู, ไก่, นกกระจอกเทศแพะและเนื้อยีนตามลำดับในช่วงของ.2-2000 งะ (ที่ข้อมูลไม่แสดง) นอกจากนี้ลาดสำหรับแต่ละชนิดมี? 3.14? 3.33? 3.14? 3.07 และ? 3.37 สอดคล้องกับทฤษฎีมูลค่า(3.32) ประสบความสำเร็จกับประสิทธิภาพ PCR 100% (ข้อมูลไม่แสดง) ค่า Ct นำเสนอเป็นวิธีและส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานได้ใช้ยีนแม่แบบสำหรับห้าชนิดเนื้อสำหรับPCR แบบ real-time แสดงในตารางที่ 4 เสริมเพื่อประเมินความถูกต้องของระบบนี้สำหรับเนื้อปลอมปนโดยใช้วิธีPCR แบบ real-time เราใช้ค่ากะรัตในการคำนวณจริงค่าและการทดสอบในอัตราส่วนที่แตกต่างกันของแม่แบบยีนเนื้อจากหมู(P) ไก่ (C), นกกระจอกเทศ (O) แพะ (G) และเนื้อวัว (B) ผสมเข้าด้วยกันเพื่อสร้างหกรวมกัน (ตารางที่ 1) ย่อหกผสมเป็น MSC, MSO ผงชูรส MSB, MSP และ MSA สำหรับ PCR แบบ real-time โดยใช้สีเขียว SYBR I. ค่าสำหรับค่าสัมประสิทธิ์ของความแปรปรวน(CV) สำหรับงวดหกผสมตั้งแต่ 0.42% ถึง 4.82% สำหรับMSC 0.7% มาอยู่ที่ 2.05% สำหรับ MSO 0.28% เป็น 2.98% สำหรับผงชูรส 0.87% เป็น 3.08% สำหรับ MSB, 0.69-2.33% สำหรับ MSP และ 0.69% เป็น 3.11% สำหรับ MSA ตามลำดับ. อัตราความผิดพลาดเป็น 0.41-12.01 % สำหรับ MSC, 0.74-2.05% สำหรับMSO, 0.28-6.98% สำหรับผงชูรส 0.87-3.08% สำหรับ MSB, 0.69-2.33% สำหรับMSP และ 0.69-3.11% สำหรับ MSA พรึบผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่า CV และอัตราความผิดพลาดก็อยู่ในช่วงที่ยอมรับได้ภายใต้ 10% และ 20% และแสดงให้เห็นว่าวิธีนี้เป็นที่เชื่อถือได้สำหรับการวิเคราะห์การปลอมปนเนื้อสัตว์(Karlen, แม็กแน Perseguers, Mazza, และ Mermod 2007)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

3.6 การใช้ PCR แบบเรียลไทม์ ปริมาณเนื้อเจือปน
ปกติ PCR เทคนิคมักจะใช้เพื่อให้ได้ผลลัพธ์เชิงคุณภาพ
สำหรับระบุชนิด ถึงแม้ว่า PCR แบบเรียลไทม์ได้
ถูกแสดงเป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์สำหรับการหาสปีชีส์ที่แตกต่างกัน
แม้ปลอมปนในอาหาร ( ฟาจาร์โด้ โรฮาส , . kgm gonz lez ,
, กาโอ การ์ซีอา&มาร์ท , เมือง , 2010 ; ฟาจาร์โด้ et al . , 2008 ) เพราะนี้
เป็นวิธีที่ง่ายดายและเชื่อถือได้ใช้เพื่อสำรวจผลิตภัณฑ์อาหาร
PCR แบบเรียลไทม์ คือตอนนี้โดยทั่วไปที่ใช้ทั่วโลก ในการศึกษา
, ความจำเพาะของวิธี PCR แบบเรียลไทม์ครั้งแรกถูกประเมินโดยใช้
SYBR สีเขียวสีและ TNI , MRP tmod ยีนและลำดับจาก
หมู , ไก่ , เนื้อนกกระจอกเทศแพะและวัว ( โต๊ะเสริม 2 ถึงโค้งมาตรฐาน PCR แบบเรียลไทม์วิเคราะห์
การใช้ยีนจากเป้าหมายแต่ละชนิด วิธีแม่แบบถูก
ประมาณ 2000 , 200 , 20 , 2 และ 0.2 ng โดยการเพิ่มเส้นโค้ง
มีเสถียรได้รับเมื่อดีเอ็นเอแม่แบบลดลง

0.2 ng ค่า R2 ค่าของเส้นโค้งมาตรฐาน
0.992 0.992 0.994 , , 0.995 และ 0.990 ที่ หมู ไก่ และนกกระจอกเทศแพะ
ยีน เนื้อ ตามลำดับ ที่ช่วง 0.2 – 2000 ng ( ข้อมูลไม่
แสดง )นอกจากนี้ ลาดสำหรับแต่ละชนิด  3.14 ,
 3.33 ,  3.14 3.37 3.07 , และ   สอดคล้องกับมูลค่าทางทฤษฎี
(  3.32 ) ได้ด้วยวิธี PCR มีประสิทธิภาพ 100% ( ข้อมูลไม่
แสดง ) CT ค่าแสดงเป็นค่าเฉลี่ยและส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน ได้ใช้ดีเอ็นเอแม่แบบสำหรับ

เนื้อสำหรับ PCR แบบเรียลไทม์เป็นห้าชนิดที่แสดงในตารางเสริม 4 .
เพื่อประเมินความถูกต้องของระบบนี้สำหรับการใช้ PCR แบบเรียลไทม์
เนื้อเราใช้ CT ค่าคำนวณจริงและทดลองที่อัตราส่วนต่าง ๆค่า

จากหมูเนื้อดีเอ็นเอแม่แบบ ( P ) , ไก่ ( C ) , นกกระจอกเทศ ( O ) , แพะ ( กรัม ) และเนื้อ ( B ,
) ผสม ร่วมกันเพื่อสร้าง 6 ชุด ( ตารางที่ 1 ) คําย่อ
ของหกผสมเป็น MSC MSB MSO , ผงชูรส , , ,