- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
Total amylase activity (TAA) was de
Total amylase activity (TAA) was determined according
to Murado et al. (1993) mixing 80 lL of paperfiltered
medium (suitably diluted) with 400 lL of
0.15 M citrate-phosphate buffer; pH 5.0 (1 volume)
and 4% soluble starch (1.5 volumes) previously maintained
at 40 C/15 min. The reaction mixture was incubated
at 40 C for 10 min. The reaction was stopped
94 M.S. Herna´ ndez et al./ Journal of Food Engineering 73 (2006) 93–100
by addition of 480 lL of dinitrosalicylic acid, and the released
glucose was determined by 3,5-dinitrosalicylic
acid reaction (Bernfeld, 1951). One unit of amylase
activity (enzymatic units (EU)/mL) was defined as the
amount of enzyme that releases 1 mg/mL of reducing
sugars (glucose equivalents) under the assay conditions.
Protease activity of cell-free medium was determined
by a modified Ansons method (Yang & Wang, 1999).
The reaction mixture with 1 mL of 1% (w/v) casein in
0.02 M NaOH and 2 mL of 0.4 M phosphate buffer
pH 6.0 and 1 mL of cell-free medium (suitably diluted)
were incubated at 30 C/10 min. The reaction was
stopped with 3 mL of 10% trichloroacetic acid, mixed
and after 5 min, centrifuged at 12,000· for 5 min, then
0.5 mL of the supernatants were incubated with
2.5 mL of 0.1 M NaOH in 2% (w/v) Na2CO3 for
10 min. Thereafter 0.25 mL of Folin phenolic reagent
(commercial solution diluted 1:1 in distilled water) were
added, mixed and stayed for 30 min at room temperature.
The absorbance measured at 750 nm was converted
to mg of tyrosine/L using a calibration curve (mg tyrosine/
L vs absorbance). The tyrosine solutions dissolved
in 0.01 M HCl, were treated in the same conditions as
the cell-free medium. One unit of protease (enzymatic
units (EU)/mL) was defined as the amount of enzyme
that produced an absorbance at 750 nm equivalent to
1 lmol of tyrosine in 1 min under the assay conditions.
2.4. Effect of temperature and pH on stability of
amylase and protease
A second-order factorial plan, using a rotatable design
(Box, Hunter, & Hunter, 1989) based on five levels
and two variables was used to study the combined influence
of pH and temperature on the stability of both
amylase and protease. The design consisted of 13 experiments
with four (22) factorial points, four axial points
to form a central composite design with a = 1.267 and
five center points for replication.
Samples of cell-free medium containing the enzymes
were buffered at different pH with the appropriate buffer
(0.1 Mpotassium hydrogen phthalate-HCl buffer for pH
2.3, 3.0 and 5.5; 0.1 M Tris–HCl buffer for pH 8.0 and
8.7). The buffering agents were prepared as concentrated
stock solutions. Then, appropriate volumes of them
were mixed with the supernatant samples to obtain a
final buffer concentration of 0.1 M. The samples were
incubated for 10 min (for protease) and 5 min (for amylase)
at the corresponding temperature according to the
experimental matrix defined by the design used (Table
2). The enzyme activities obtained were corrected with
the corresponding dilution factor.
Results were analyzed by Experimental Design
Module of the Statistica sofware package (Statistica
for Windows computer program manual; StatSoft Inc.
Tulsa, OK, USA). The response surfaces were plotted
using the DeltaGraph sofware, version 4.0 (SPSS, Inc.,
Chicago, IL, USA).
2.5. Effect of metal ions on amylase and protease activity
Samples of cell-free medium were incubated with
each compound (at 10 mM final concentration) for
30 min in the optimum conditions of temperature and
pH determined in the previous assay. After the incubation
the remaining activity was determined by the corresponding
enzyme assay. The residual enzyme activity
was expressed as a percentage of the activity in control
samples without reagent (Aquino, Jorge, Terenzi, &
Polizeli, 2003). Individual experiments were performed
in triplicate. Data sets were analyzed by analysis of
variance (ANOVA) on SPSS 8.0 for Windows.
3. Results and discussion
3.1. Amylases and proteases production in media prepared
with brewery and meat processing wastewaters
supplemented with starch
Amylase production by A.niger strain UO-1 was followed
in media prepared with brewery and meat processing
wastewaters supplemented with starch. The
time course of growth, pH, total sugars and enzymes
(amylases and proteases) production is shown in Fig. 1.
The levels of amylase and protease enzymes obtained
were markedly dependent on the concentration of initial
starch concentration in the culture media (Fig. 1).
Increased amylase and protease levels were obtained in
the media supplemented with starch when compared
to the control cultures (BW and MPW media without
starch).
The high initial concentration of substrate (40 g of
starch/L) in the media favored cell growth, as the production
of both enzymes. Although the maximum level
of amylase was reached in BW medium (70.29 EU/
mL), which was higher than in MPW medium
(60.12 EU/mL), the maximum protease levels (ffi6 EU/
mL) were similar in both media.
During fermentation, the pH initially dropped from
6.0 to 4.0 after 24 h followed by its increase to 7.4
approximately (48 h), and remained constant thereafter.
The concentration of total sugars, nitrogen and phosphorous
decreased during fermentation, coinciding with
an increase of biomass and enzyme production leading
to a final COD of 0.24 g/L (in the media supplemented
with 40 g of starch/L) or lower (in the media with lower
initial starch concentrations). This indicates that at least
92% and 93% of the initial COD were removed from the
brewery and meat processing wastes, respectively.
Although the culture media prepared with both
wastes were capable of supporting the growth and
M.
to Murado et al. (1993) mixing 80 lL of paperfiltered
medium (suitably diluted) with 400 lL of
0.15 M citrate-phosphate buffer; pH 5.0 (1 volume)
and 4% soluble starch (1.5 volumes) previously maintained
at 40 C/15 min. The reaction mixture was incubated
at 40 C for 10 min. The reaction was stopped
94 M.S. Herna´ ndez et al./ Journal of Food Engineering 73 (2006) 93–100
by addition of 480 lL of dinitrosalicylic acid, and the released
glucose was determined by 3,5-dinitrosalicylic
acid reaction (Bernfeld, 1951). One unit of amylase
activity (enzymatic units (EU)/mL) was defined as the
amount of enzyme that releases 1 mg/mL of reducing
sugars (glucose equivalents) under the assay conditions.
Protease activity of cell-free medium was determined
by a modified Ansons method (Yang & Wang, 1999).
The reaction mixture with 1 mL of 1% (w/v) casein in
0.02 M NaOH and 2 mL of 0.4 M phosphate buffer
pH 6.0 and 1 mL of cell-free medium (suitably diluted)
were incubated at 30 C/10 min. The reaction was
stopped with 3 mL of 10% trichloroacetic acid, mixed
and after 5 min, centrifuged at 12,000· for 5 min, then
0.5 mL of the supernatants were incubated with
2.5 mL of 0.1 M NaOH in 2% (w/v) Na2CO3 for
10 min. Thereafter 0.25 mL of Folin phenolic reagent
(commercial solution diluted 1:1 in distilled water) were
added, mixed and stayed for 30 min at room temperature.
The absorbance measured at 750 nm was converted
to mg of tyrosine/L using a calibration curve (mg tyrosine/
L vs absorbance). The tyrosine solutions dissolved
in 0.01 M HCl, were treated in the same conditions as
the cell-free medium. One unit of protease (enzymatic
units (EU)/mL) was defined as the amount of enzyme
that produced an absorbance at 750 nm equivalent to
1 lmol of tyrosine in 1 min under the assay conditions.
2.4. Effect of temperature and pH on stability of
amylase and protease
A second-order factorial plan, using a rotatable design
(Box, Hunter, & Hunter, 1989) based on five levels
and two variables was used to study the combined influence
of pH and temperature on the stability of both
amylase and protease. The design consisted of 13 experiments
with four (22) factorial points, four axial points
to form a central composite design with a = 1.267 and
five center points for replication.
Samples of cell-free medium containing the enzymes
were buffered at different pH with the appropriate buffer
(0.1 Mpotassium hydrogen phthalate-HCl buffer for pH
2.3, 3.0 and 5.5; 0.1 M Tris–HCl buffer for pH 8.0 and
8.7). The buffering agents were prepared as concentrated
stock solutions. Then, appropriate volumes of them
were mixed with the supernatant samples to obtain a
final buffer concentration of 0.1 M. The samples were
incubated for 10 min (for protease) and 5 min (for amylase)
at the corresponding temperature according to the
experimental matrix defined by the design used (Table
2). The enzyme activities obtained were corrected with
the corresponding dilution factor.
Results were analyzed by Experimental Design
Module of the Statistica sofware package (Statistica
for Windows computer program manual; StatSoft Inc.
Tulsa, OK, USA). The response surfaces were plotted
using the DeltaGraph sofware, version 4.0 (SPSS, Inc.,
Chicago, IL, USA).
2.5. Effect of metal ions on amylase and protease activity
Samples of cell-free medium were incubated with
each compound (at 10 mM final concentration) for
30 min in the optimum conditions of temperature and
pH determined in the previous assay. After the incubation
the remaining activity was determined by the corresponding
enzyme assay. The residual enzyme activity
was expressed as a percentage of the activity in control
samples without reagent (Aquino, Jorge, Terenzi, &
Polizeli, 2003). Individual experiments were performed
in triplicate. Data sets were analyzed by analysis of
variance (ANOVA) on SPSS 8.0 for Windows.
3. Results and discussion
3.1. Amylases and proteases production in media prepared
with brewery and meat processing wastewaters
supplemented with starch
Amylase production by A.niger strain UO-1 was followed
in media prepared with brewery and meat processing
wastewaters supplemented with starch. The
time course of growth, pH, total sugars and enzymes
(amylases and proteases) production is shown in Fig. 1.
The levels of amylase and protease enzymes obtained
were markedly dependent on the concentration of initial
starch concentration in the culture media (Fig. 1).
Increased amylase and protease levels were obtained in
the media supplemented with starch when compared
to the control cultures (BW and MPW media without
starch).
The high initial concentration of substrate (40 g of
starch/L) in the media favored cell growth, as the production
of both enzymes. Although the maximum level
of amylase was reached in BW medium (70.29 EU/
mL), which was higher than in MPW medium
(60.12 EU/mL), the maximum protease levels (ffi6 EU/
mL) were similar in both media.
During fermentation, the pH initially dropped from
6.0 to 4.0 after 24 h followed by its increase to 7.4
approximately (48 h), and remained constant thereafter.
The concentration of total sugars, nitrogen and phosphorous
decreased during fermentation, coinciding with
an increase of biomass and enzyme production leading
to a final COD of 0.24 g/L (in the media supplemented
with 40 g of starch/L) or lower (in the media with lower
initial starch concentrations). This indicates that at least
92% and 93% of the initial COD were removed from the
brewery and meat processing wastes, respectively.
Although the culture media prepared with both
wastes were capable of supporting the growth and
M.
0/5000
กิจกรรมรวม amylase (แหลมยายณี) กำหนดตามการ Murado et al. (1993) ผสม 80 จะ paperfilteredปานกลาง (เหมาะสมผสม) กับ 400 จะของ0.15 M ฟอสเฟตซิเตรตบัฟเฟอร์ pH 5.0 (1 เล่ม)และ 4% ละลายแป้ง (ปริมาณ 1.5) ก่อนหน้านี้ รักษาที่ 40 C/15 นาที ส่วนผสมปฏิกิริยาถูก incubatedที่ C 40 สำหรับ 10 นาที หยุดปฏิกิริยา94 Herna´ เด้นกวาน ndez et al. / สมุดรายวันของอาหารวิศวกรรม 73 (2006) 93 – 100โดยเพิ่ม 480 จะกรด dinitrosalicylic และที่นำออกใช้กลูโคสถูกกำหนด โดย 3,5-dinitrosalicylicกรดปฏิกิริยา (Bernfeld, 1951) หน่วยหนึ่งของ amylaseกิจกรรม (หน่วยเอนไซม์ในระบบ (EU) /mL) ถูกกำหนดเป็นการจำนวนเอนไซม์ที่นำออกใช้ 1 mg/mL ลดน้ำตาล (กลูโคสเทียบเท่า) ภายใต้เงื่อนไขการทดสอบกำหนดกิจกรรมรติเอสของกลางเซลล์ฟรีโดยปรับเปลี่ยน Anson s วิธี (ยางและวัง 1999)ส่วนผสม มี 1 mL ของเคซีน 1% (w/v) ในปฏิกิริยา0.02 M NaOH และ mL 2 บัฟเฟอร์ฟอสเฟต 0.4 MpH 6.0 และ 1 mL ของกลางเซลล์อิสระ (ทำให้เหมาะสม)มี incubated ที่ 30 C/10 นาที ปฏิกิริยาหยุดกับ mL 3 ของ 10% กรด trichloroacetic ผสมและหลังจาก 5 นาที centrifuged ที่ 12, 000· สำหรับ 5 นาที จากนั้น0.5 mL ของ supernatants จะมี incubated ด้วย2.5 mL ของ 0.1 M NaOH 2% (w/v) Na2CO3 สำหรับ10 นาที หลังจากนั้นของรีเอเจนต์ฟีนอ Folin 0.25 mLได้ (โซลูชันเชิงพาณิชย์ทำให้เจือจาง 1:1 ในน้ำกลั่น)เพิ่ม ผสม และใกล้ถนนคนเดิน 30 นาทีที่อุณหภูมิห้องวัด absorbance ที่ 750 nm แปลงการมิลลิกรัมของ tyrosine/L โดยใช้เส้นโค้งเทียบ (tyrosine มิลลิกรัม /L vs absorbance) โซลูชั่น tyrosine ส่วนยุบใน 0.01 M HCl ได้รับการรักษาในเงื่อนไขเดียวกันเป็นกลางเซลล์ฟรี รติเอส (เอนไซม์ในระบบหนึ่งหน่วยหน่วย (EU) /mL) ถูกกำหนดเป็นยอดของเอนไซม์ที่ผลิตที่ absorbance ที่ 750 nm เทียบเท่าlmol 1 ของ tyrosine ใน 1 นาทีภายใต้เงื่อนไขการทดสอบ2.4. ผลของอุณหภูมิและค่า pH ความมั่นคงของamylase และรติเอสสั่งสองแฟกแผน ใช้แบบ rotatable(กล่อง ฮันเตอร์ และฮันเตอร์ 1989) ตามระดับที่ห้าและสองตัวแปรที่ใช้ศึกษาอิทธิพลรวมของ pH และอุณหภูมิในความมั่นคงของทั้งสองamylase และรติเอส ประกอบด้วยการออกแบบการทดลองที่ 13กับสี่จุดแฟก (22) จุดสี่แกนเพื่อการออกแบบคอมโพสิตเซ็นทรัลกับ = 1.267 และห้าจุดศูนย์สำหรับการจำลองแบบตัวอย่างของสื่อฟรีเซลล์ประกอบด้วยเอนไซม์มีบัฟเฟอร์ใน pH ที่แตกต่างกันแต่ มีบัฟเฟอร์ที่เหมาะสม(0.1 Mpotassium ไฮโดรเจนพทาเลท HCl บัฟเฟอร์สำหรับ pH2.3, 3.0 และ 5.5 0.1 M ตรี – HCl บัฟเฟอร์สำหรับค่า pH 8.0 และ8.7) ถูกเตรียมตัวแทนบัฟเฟอร์เข้มข้นการแก้ไขปัญหาสินค้าคงคลัง ไดรฟ์ข้อมูลแล้ว ความเหมาะสมของพวกเขาได้ผสมกับตัวอย่าง supernatant เพื่อขอรับการบัฟเฟอร์สิ้นสุดที่ความเข้มข้น 0.1 M ตัวอย่างดีincubated (สำหรับรติเอส) 10 นาที และ 5 นาที (สำหรับ amylase)อุณหภูมิที่เกี่ยวข้องตาม(ตารางที่ใช้เมตริกซ์ทดลองที่กำหนด โดยการออกแบบ2) . กิจกรรมของเอนไซม์ที่ได้รับถูกแก้ไขด้วยสัดส่วนเจือจางที่สอดคล้องกันมีวิเคราะห์ผล โดยออกแบบการทดลองโมดูลแพคเกจซอฟต์แวร์ Statistica (Statisticaใน Windows คอมพิวเตอร์โปรแกรมด้วยตนเอง StatSoft incTulsa ตกลง สหรัฐอเมริกา) พื้นผิวตอบสนองถูกพล็อตโดยใช้ซอฟต์แวร์ DeltaGraph รุ่น 4.0 (โปรแกรม Inc.ชิคาโก IL สหรัฐอเมริกา)2.5. ผลของประจุโลหะ amylase และรติเอสตัวอย่างของเซลล์ฟรีกลางได้ incubated ด้วยแต่ละบริเวณที่เข้มข้นสุดท้าย 10 mM) สำหรับในเงื่อนไขของอุณหภูมิสูงสุด 30 นาที และpH ที่กำหนดในการทดสอบก่อนหน้านี้ หลังจากที่คณะทันตแพทยศาสตร์กำหนดกิจกรรมที่เหลือ โดยให้สอดคล้องกับวิเคราะห์เอนไซม์ เอนไซม์ที่เหลือที่แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของกิจกรรมในการควบคุมตัวอย่างโดยไม่ต้องรีเอเจนต์ (Aquino, Jorge, Terenzi, &Polizeli, 2003) ดำเนินการทดลองแต่ละใน triplicate ชุดข้อมูลที่ถูกวิเคราะห์ โดยวิเคราะห์ผลต่าง (การวิเคราะห์ความแปรปรวน) ใน 8.0 โปรแกรมสำหรับ Windows3. ผลลัพธ์ และสนทนา3.1 amylases และ proteases ผลิตสื่อที่เตรียมไว้มีโรงเบียร์และ wastewaters การแปรรูปเนื้อสัตว์เสริม ด้วยแป้งAmylase ผลิต โดยต้องใช้ A.niger อายุ 1 ได้ตามสื่อพร้อมเบียร์และแปรรูปเนื้อสัตว์wastewaters เสริม ด้วยแป้ง ที่หลักสูตรของเวลาของการเจริญเติบโต pH รวมน้ำตาล และเอนไซม์ผลิต (amylases และ proteases) จะปรากฏใน Fig. 1ระดับเอนไซม์ amylase และรติเอสได้ได้อย่างเด่นชัดขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของเริ่มต้นความเข้มข้นของแป้งที่สื่อวัฒนธรรม (Fig. 1)เพิ่มระดับ amylase และรติเอสได้รับในสื่อเสริม ด้วยแป้งเมื่อเทียบการควบคุมวัฒนธรรม (BW และ MPW สื่อโดยแป้ง)ความเข้มข้นเริ่มต้นสูงของพื้นผิว (40 กรัมของแป้ง/L) ในสื่อปลอดเซลล์การเจริญเติบโต เป็นการผลิตของเอนไซม์ทั้งนั้น แม้ว่าระดับสูงสุดของ amylase ครบใน BW (70.29 EU /มล.), ซึ่งมีสูงกว่าใน MPW(60.12 EU/มล.), ระดับรติเอสสูงสุด (ffi6 EU /mL) คล้ายกันในสื่อทั้งนั้นในระหว่างการหมัก pH เริ่มต้นลดลงจาก6.0-4.0 หลัง 24 h ตามเพิ่มขึ้นเป็น 7.4ประมาณ (48 h), และยังคงคงหลังจากนั้นความเข้มข้นของน้ำตาลรวม ไนโตรเจน และ phosphorousลดลงในระหว่างการหมัก เนื่องด้วยการเพิ่มขึ้นของการผลิตชีวมวลและเอนไซม์ที่นำการ COD สุดท้ายของ 0.24 g/L (ในสื่อเสริมมี 40 กรัมของ แป้ง/L) หรือต่ำกว่า (ในสื่อต่ำกว่าแป้งเริ่มต้นความเข้มข้น) นี้หมายถึงน้อยออก 92 และ 93% ของ COD เริ่มต้นจากการเบียร์และเนื้อเสีย การประมวลผลตามลำดับแม้ว่าสื่อวัฒนธรรมพร้อมทั้งเสียที่มีความสามารถในการสนับสนุนการเจริญเติบโต และม.
การแปล กรุณารอสักครู่..
กิจกรรมรวมอะไมเลส (TAA)
ถูกกำหนดขึ้นมาตามการMurado et al, (1993) จะผสม 80 ของ paperfiltered
กลาง (ปรับลดเหมาะสม) 400 LL ของ
0.15 M บัฟเฟอร์ซิเตรทฟอสเฟต; พีเอช 5.0 (1 ปริมาตร)
และ 4% แป้งที่ละลายน้ำได้ (1.5 เล่ม)
เก็บรักษาไว้ก่อนหน้านี้ที่40? C / 15 นาที ผสมปฏิกิริยาถูกบ่มที่ 40 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที
ปฏิกิริยาก็หยุด
94 MS Herna' ndez et al. / วารสารวิศวกรรมอาหาร 73 (2006) 93-100
โดยนอกเหนือจาก 480 LL ของกรด dinitrosalicylic
และปล่อยกลูโคสถูกกำหนดโดย3,5-dinitrosalicylic
ปฏิกิริยากรด (Bernfeld, 1951) หนึ่งหน่วยของอะไมเลสกิจกรรม (หน่วยเอนไซม์ (อียู) / มิลลิลิตร) ถูกกำหนดให้เป็นปริมาณของเอนไซม์ที่ออก1 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรของการลดน้ำตาล(เทียบเท่ากลูโคส) ภายใต้เงื่อนไขการทดสอบได้. กิจกรรมโปรติเอสของกลางมือถือฟรีถูกกำหนดโดยการปรับเปลี่ยนแอนสันหรือไม่วิธีการ (ยางและวัง, 1999). ผสมปฏิกิริยากับ 1 มิลลิลิตร 1% (w / v) เคซีนใน0.02 M NaOH และ 2 มิลลิลิตร 0.4 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์pH 6.0 และ 1 มิลลิลิตรของกลางมือถือฟรี (ปรับลดเหมาะสม) ถูกบ่ม ณ วันที่ 30? C / 10 นาที ปฏิกิริยาถูกหยุด 3 มิลลิลิตร 10% กรดไตรคลอโรผสมและหลังจาก5 นาที, หมุนเหวี่ยงที่ 12,000 · 5 นาทีแล้ว0.5 มิลลิลิตรของ supernatants ถูกบ่มกับ2.5 มิลลิลิตร 0.1 M NaOH 2% (w / v) Na2CO3 สำหรับ10 นาที หลังจากนั้นเป็นต้นมา 0.25 มิลลิลิตร Folin สารฟีนอล(วิธีการแก้ปัญหาในเชิงพาณิชย์เจือจาง 1: 1 ในน้ำกลั่น) ถูก. เพิ่มผสมและอยู่เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้องการดูดกลืนแสงวัดที่750 นาโนเมตรที่ได้รับการแปลงเพื่อmg ของซายน์ / L โดยใช้เส้นโค้งการสอบเทียบ ( มก. ซายน์ / L เทียบกับการดูดกลืนแสง) โซลูชั่นซายน์ที่ละลายใน 0.01 M HCl ได้รับการรักษาในสภาพเช่นเดียวกับสื่อมือถือฟรี หนึ่งหน่วยของโปรติเอส (เอนไซม์หน่วย(อียู) / มิลลิลิตร) ถูกกำหนดเป็นปริมาณของเอนไซม์ที่ผลิตการดูดกลืนแสงที่750 นาโนเมตรเท่ากับ1 lmol ของซายน์ใน 1 นาทีภายใต้เงื่อนไขการทดสอบได้. 2.4 ผลของอุณหภูมิและพีเอชต่อเสถียรภาพของอะไมเลสและโปรติเอสแผนปัจจัยที่สองที่สั่งซื้อโดยใช้การออกแบบที่หมุนได้(กล่อง, ฮันเตอร์และฮันเตอร์ 1989) ตามห้าระดับและสองตัวแปรที่ถูกใช้ในการศึกษาอิทธิพลรวมค่าpH และอุณหภูมิ กับความมั่นคงของทั้งสองอะไมเลสและโปรติเอส การออกแบบประกอบด้วย 13 การทดลองกับสี่(22) จุดปัจจัยสี่จุดแกนในรูปแบบการออกแบบคอมโพสิตกลางด้วย= 1.267 และห้าจุดศูนย์สำหรับการจำลองแบบ. ตัวอย่างของกลางมือถือฟรีที่มีเอนไซม์ที่ถูกบัฟเฟอร์ที่ pH ที่แตกต่างกันด้วย บัฟเฟอร์ที่เหมาะสม (0.1 Mpotassium ไฮโดรเจนบัฟเฟอร์ phthalate-HCl สำหรับค่า pH 2.3, 3.0 และ 5.5; 0.1 M บัฟเฟอร์ Tris-HCl สำหรับค่า pH 8.0 และ8.7) ตัวแทนบัฟเฟอร์ได้จัดทำขึ้นเป็นความเข้มข้นโซลูชั่นหุ้น จากนั้นปริมาณที่เหมาะสมของพวกเขาได้รับการผสมกับสารละลายตัวอย่างเพื่อให้ได้ความเข้มข้นของบัฟเฟอร์สุดท้ายของ0.1 เมตรกลุ่มตัวอย่างที่ได้รับการบ่มเป็นเวลา10 นาที (สำหรับโปรติเอส) และ 5 นาที (สำหรับอะไมเลส) ที่อุณหภูมิที่สอดคล้องกันตามเมทริกซ์การทดลองที่กำหนดไว้โดยการออกแบบที่ใช้ (ตารางที่2) เอนไซม์ที่ได้รับการแก้ไขด้วยปัจจัยที่ทำให้เจือจางที่สอดคล้องกัน. ผลการวิเคราะห์การทดลองออกแบบโมดูลของ Statistica แพคเกจซอฟต์แวร์ (Statistica คู่มือโปรแกรมคอมพิวเตอร์ที่ใช้ Windows; StatSoft อิงค์ทูลซา, สหรัฐอเมริกา) พื้นผิวการตอบสนองที่ถูกวางแผนโดยใช้ซอฟต์แวร์ DeltaGraph รุ่น 4.0 (SPSS, Inc, ชิคาโก, IL, USA). 2.5 ผลของโลหะไอออนในอะไมเลสและกิจกรรมโปรติเอสตัวอย่างของกลางมือถือฟรีถูกบ่มกับแต่ละสารประกอบ(10 มิลลิความเข้มข้นสุดท้าย) สำหรับ30 นาทีในสภาพที่เหมาะสมของอุณหภูมิและพีเอชที่กำหนดไว้ในการทดสอบก่อนหน้านี้ หลังจากบ่มกิจกรรมที่เหลือได้รับการกำหนดโดยที่สอดคล้องกันทดสอบการทำงานของเอนไซม์ กิจกรรมของเอนไซม์ที่เหลือได้รับการแสดงเป็นร้อยละของกิจกรรมในการควบคุมตัวอย่างโดยไม่ต้องรีเอเจนต์(กัวร์เฆ, Terenzi และPolizeli, 2003) การทดลองของแต่ละบุคคลได้ดำเนินการในเพิ่มขึ้นสามเท่า ชุดวิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวน (ANOVA) บน SPSS 8.0 สำหรับ Windows. 3 และการอภิปรายผล3.1 Amylases โปรตีเอสและการผลิตในสื่อที่เตรียมไว้กับโรงเบียร์และการแปรรูปเนื้อสัตว์น้ำเสียเสริมด้วยแป้งผลิตอะไมเลสจากความเครียดA.niger UO-1 ตามมาในสื่อจัดทำโรงเบียร์และการแปรรูปเนื้อสัตว์น้ำเสียเสริมด้วยแป้ง เวลาที่แน่นอนของการเจริญเติบโต pH น้ำตาลทั้งหมดและเอนไซม์(amylases และโปรตีเอส) ผลิตจะแสดงในรูป 1. ระดับของอะไมเลสและเอนไซม์โปรติเอสที่ได้รับเป็นอย่างเห็นได้ชัดขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของการเริ่มต้นความเข้มข้นของแป้งในอาหารเลี้ยงเชื้อ(รูปที่ 1).. อะไมเลสที่เพิ่มขึ้นและระดับโปรติเอสที่ได้รับในสื่อเสริมด้วยแป้งเมื่อเปรียบเทียบกับวัฒนธรรมควบคุม( BW และสื่อ MPW โดยไม่ต้องแป้ง). ความเข้มข้นเริ่มต้นสูงของพื้นผิว (40 กรัมแป้ง/ ลิตร) ในสื่อที่ได้รับการสนับสนุนการเติบโตของเซลล์ในขณะที่การผลิตของเอนไซม์ทั้งสอง แม้ว่าระดับสูงสุดของอะไมเลสก็มาถึงในสื่อ BW (70.29 EU / มิลลิลิตร) ซึ่งสูงกว่าในกลาง MPW (60.12 EU / มิลลิลิตร) ระดับโปรติเอสสูงสุด (ffi6 EU / มิลลิลิตร) มีความคล้ายคลึงกันในสื่อทั้งสอง. ในระหว่างการหมัก ค่า pH แรกลดลงจาก6.0 ไป 4.0 หลังจาก 24 ชั่วโมงตามมาจากการเพิ่มขึ้นของ 7.4 โดยประมาณ (48 ชั่วโมง) และยังคงอยู่อย่างต่อเนื่องหลังจากนั้น. ความเข้มข้นของน้ำตาลรวม, ไนโตรเจนและฟอสฟอรัสลดลงระหว่างการหมักประจวบกับการเพิ่มขึ้นของชีวมวลและเอนไซม์การผลิตชั้นนำไป COD สุดท้ายของ 0.24 กรัม / ลิตร (ในสื่อเสริมที่มี40 กรัมของแป้ง / L) หรือต่ำกว่า (ในสื่อที่มีต่ำกว่าความเข้มข้นของแป้งเริ่มต้น) นี้แสดงให้เห็นว่าอย่างน้อย92% และ 93% ของซีโอดีเริ่มต้นที่ถูกถอดออกจากโรงเบียร์และของเสียการแปรรูปเนื้อสัตว์ตามลำดับ. แม้ว่าสื่อวัฒนธรรมที่เตรียมไว้มีทั้งของเสียที่มีความสามารถในการสนับสนุนการเจริญเติบโตและเอ็ม
ถูกกำหนดขึ้นมาตามการMurado et al, (1993) จะผสม 80 ของ paperfiltered
กลาง (ปรับลดเหมาะสม) 400 LL ของ
0.15 M บัฟเฟอร์ซิเตรทฟอสเฟต; พีเอช 5.0 (1 ปริมาตร)
และ 4% แป้งที่ละลายน้ำได้ (1.5 เล่ม)
เก็บรักษาไว้ก่อนหน้านี้ที่40? C / 15 นาที ผสมปฏิกิริยาถูกบ่มที่ 40 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาที
ปฏิกิริยาก็หยุด
94 MS Herna' ndez et al. / วารสารวิศวกรรมอาหาร 73 (2006) 93-100
โดยนอกเหนือจาก 480 LL ของกรด dinitrosalicylic
และปล่อยกลูโคสถูกกำหนดโดย3,5-dinitrosalicylic
ปฏิกิริยากรด (Bernfeld, 1951) หนึ่งหน่วยของอะไมเลสกิจกรรม (หน่วยเอนไซม์ (อียู) / มิลลิลิตร) ถูกกำหนดให้เป็นปริมาณของเอนไซม์ที่ออก1 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรของการลดน้ำตาล(เทียบเท่ากลูโคส) ภายใต้เงื่อนไขการทดสอบได้. กิจกรรมโปรติเอสของกลางมือถือฟรีถูกกำหนดโดยการปรับเปลี่ยนแอนสันหรือไม่วิธีการ (ยางและวัง, 1999). ผสมปฏิกิริยากับ 1 มิลลิลิตร 1% (w / v) เคซีนใน0.02 M NaOH และ 2 มิลลิลิตร 0.4 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์pH 6.0 และ 1 มิลลิลิตรของกลางมือถือฟรี (ปรับลดเหมาะสม) ถูกบ่ม ณ วันที่ 30? C / 10 นาที ปฏิกิริยาถูกหยุด 3 มิลลิลิตร 10% กรดไตรคลอโรผสมและหลังจาก5 นาที, หมุนเหวี่ยงที่ 12,000 · 5 นาทีแล้ว0.5 มิลลิลิตรของ supernatants ถูกบ่มกับ2.5 มิลลิลิตร 0.1 M NaOH 2% (w / v) Na2CO3 สำหรับ10 นาที หลังจากนั้นเป็นต้นมา 0.25 มิลลิลิตร Folin สารฟีนอล(วิธีการแก้ปัญหาในเชิงพาณิชย์เจือจาง 1: 1 ในน้ำกลั่น) ถูก. เพิ่มผสมและอยู่เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้องการดูดกลืนแสงวัดที่750 นาโนเมตรที่ได้รับการแปลงเพื่อmg ของซายน์ / L โดยใช้เส้นโค้งการสอบเทียบ ( มก. ซายน์ / L เทียบกับการดูดกลืนแสง) โซลูชั่นซายน์ที่ละลายใน 0.01 M HCl ได้รับการรักษาในสภาพเช่นเดียวกับสื่อมือถือฟรี หนึ่งหน่วยของโปรติเอส (เอนไซม์หน่วย(อียู) / มิลลิลิตร) ถูกกำหนดเป็นปริมาณของเอนไซม์ที่ผลิตการดูดกลืนแสงที่750 นาโนเมตรเท่ากับ1 lmol ของซายน์ใน 1 นาทีภายใต้เงื่อนไขการทดสอบได้. 2.4 ผลของอุณหภูมิและพีเอชต่อเสถียรภาพของอะไมเลสและโปรติเอสแผนปัจจัยที่สองที่สั่งซื้อโดยใช้การออกแบบที่หมุนได้(กล่อง, ฮันเตอร์และฮันเตอร์ 1989) ตามห้าระดับและสองตัวแปรที่ถูกใช้ในการศึกษาอิทธิพลรวมค่าpH และอุณหภูมิ กับความมั่นคงของทั้งสองอะไมเลสและโปรติเอส การออกแบบประกอบด้วย 13 การทดลองกับสี่(22) จุดปัจจัยสี่จุดแกนในรูปแบบการออกแบบคอมโพสิตกลางด้วย= 1.267 และห้าจุดศูนย์สำหรับการจำลองแบบ. ตัวอย่างของกลางมือถือฟรีที่มีเอนไซม์ที่ถูกบัฟเฟอร์ที่ pH ที่แตกต่างกันด้วย บัฟเฟอร์ที่เหมาะสม (0.1 Mpotassium ไฮโดรเจนบัฟเฟอร์ phthalate-HCl สำหรับค่า pH 2.3, 3.0 และ 5.5; 0.1 M บัฟเฟอร์ Tris-HCl สำหรับค่า pH 8.0 และ8.7) ตัวแทนบัฟเฟอร์ได้จัดทำขึ้นเป็นความเข้มข้นโซลูชั่นหุ้น จากนั้นปริมาณที่เหมาะสมของพวกเขาได้รับการผสมกับสารละลายตัวอย่างเพื่อให้ได้ความเข้มข้นของบัฟเฟอร์สุดท้ายของ0.1 เมตรกลุ่มตัวอย่างที่ได้รับการบ่มเป็นเวลา10 นาที (สำหรับโปรติเอส) และ 5 นาที (สำหรับอะไมเลส) ที่อุณหภูมิที่สอดคล้องกันตามเมทริกซ์การทดลองที่กำหนดไว้โดยการออกแบบที่ใช้ (ตารางที่2) เอนไซม์ที่ได้รับการแก้ไขด้วยปัจจัยที่ทำให้เจือจางที่สอดคล้องกัน. ผลการวิเคราะห์การทดลองออกแบบโมดูลของ Statistica แพคเกจซอฟต์แวร์ (Statistica คู่มือโปรแกรมคอมพิวเตอร์ที่ใช้ Windows; StatSoft อิงค์ทูลซา, สหรัฐอเมริกา) พื้นผิวการตอบสนองที่ถูกวางแผนโดยใช้ซอฟต์แวร์ DeltaGraph รุ่น 4.0 (SPSS, Inc, ชิคาโก, IL, USA). 2.5 ผลของโลหะไอออนในอะไมเลสและกิจกรรมโปรติเอสตัวอย่างของกลางมือถือฟรีถูกบ่มกับแต่ละสารประกอบ(10 มิลลิความเข้มข้นสุดท้าย) สำหรับ30 นาทีในสภาพที่เหมาะสมของอุณหภูมิและพีเอชที่กำหนดไว้ในการทดสอบก่อนหน้านี้ หลังจากบ่มกิจกรรมที่เหลือได้รับการกำหนดโดยที่สอดคล้องกันทดสอบการทำงานของเอนไซม์ กิจกรรมของเอนไซม์ที่เหลือได้รับการแสดงเป็นร้อยละของกิจกรรมในการควบคุมตัวอย่างโดยไม่ต้องรีเอเจนต์(กัวร์เฆ, Terenzi และPolizeli, 2003) การทดลองของแต่ละบุคคลได้ดำเนินการในเพิ่มขึ้นสามเท่า ชุดวิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวน (ANOVA) บน SPSS 8.0 สำหรับ Windows. 3 และการอภิปรายผล3.1 Amylases โปรตีเอสและการผลิตในสื่อที่เตรียมไว้กับโรงเบียร์และการแปรรูปเนื้อสัตว์น้ำเสียเสริมด้วยแป้งผลิตอะไมเลสจากความเครียดA.niger UO-1 ตามมาในสื่อจัดทำโรงเบียร์และการแปรรูปเนื้อสัตว์น้ำเสียเสริมด้วยแป้ง เวลาที่แน่นอนของการเจริญเติบโต pH น้ำตาลทั้งหมดและเอนไซม์(amylases และโปรตีเอส) ผลิตจะแสดงในรูป 1. ระดับของอะไมเลสและเอนไซม์โปรติเอสที่ได้รับเป็นอย่างเห็นได้ชัดขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของการเริ่มต้นความเข้มข้นของแป้งในอาหารเลี้ยงเชื้อ(รูปที่ 1).. อะไมเลสที่เพิ่มขึ้นและระดับโปรติเอสที่ได้รับในสื่อเสริมด้วยแป้งเมื่อเปรียบเทียบกับวัฒนธรรมควบคุม( BW และสื่อ MPW โดยไม่ต้องแป้ง). ความเข้มข้นเริ่มต้นสูงของพื้นผิว (40 กรัมแป้ง/ ลิตร) ในสื่อที่ได้รับการสนับสนุนการเติบโตของเซลล์ในขณะที่การผลิตของเอนไซม์ทั้งสอง แม้ว่าระดับสูงสุดของอะไมเลสก็มาถึงในสื่อ BW (70.29 EU / มิลลิลิตร) ซึ่งสูงกว่าในกลาง MPW (60.12 EU / มิลลิลิตร) ระดับโปรติเอสสูงสุด (ffi6 EU / มิลลิลิตร) มีความคล้ายคลึงกันในสื่อทั้งสอง. ในระหว่างการหมัก ค่า pH แรกลดลงจาก6.0 ไป 4.0 หลังจาก 24 ชั่วโมงตามมาจากการเพิ่มขึ้นของ 7.4 โดยประมาณ (48 ชั่วโมง) และยังคงอยู่อย่างต่อเนื่องหลังจากนั้น. ความเข้มข้นของน้ำตาลรวม, ไนโตรเจนและฟอสฟอรัสลดลงระหว่างการหมักประจวบกับการเพิ่มขึ้นของชีวมวลและเอนไซม์การผลิตชั้นนำไป COD สุดท้ายของ 0.24 กรัม / ลิตร (ในสื่อเสริมที่มี40 กรัมของแป้ง / L) หรือต่ำกว่า (ในสื่อที่มีต่ำกว่าความเข้มข้นของแป้งเริ่มต้น) นี้แสดงให้เห็นว่าอย่างน้อย92% และ 93% ของซีโอดีเริ่มต้นที่ถูกถอดออกจากโรงเบียร์และของเสียการแปรรูปเนื้อสัตว์ตามลำดับ. แม้ว่าสื่อวัฒนธรรมที่เตรียมไว้มีทั้งของเสียที่มีความสามารถในการสนับสนุนการเจริญเติบโตและเอ็ม
การแปล กรุณารอสักครู่..
รวมกิจกรรมเอนไซม์อะไมเลส ( TAA ) คือกำหนดตาม
เพื่อ murado et al . ( 1993 ) ผสม 80 จะ paperfiltered
ปานกลาง ( สามารถเจือจาง ) กับ 400 จะ
0.15 เมตรซิเตรทฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ; pH 5.0 ( 1 เล่ม )
4 % soluble starch ( 1 เล่ม ) รักษาก่อนหน้านี้
ที่ 40 C / 15 นาที ปฏิกิริยาผสมบ่ม
ที่ 40 C นาน 10 นาที ปฏิกิริยาที่ถูกหยุด
94 . herna ใหม่ ndez et al ./ วารสารวิศวกรรมอาหาร 1 ( 2006 ) 93 - 100
โดยนอกเหนือจาก 480 จะ dinitrosalicylic กรด และปล่อย
กลูโคสถูกกำหนดจากปฏิกิริยาเป็นกรด 3,5-dinitrosalicylic
( bernfeld , 1951 ) หน่วยหนึ่งของกิจกรรมเอนไซม์อะไมเลส
( หน่วยของเอนไซม์ ( EU ) / ml ) หมายถึง ปริมาณของเอนไซม์ที่ปล่อย
1 มก. / มล. ลดน้ำตาล ( เทียบเท่ากลูโคส ) ภายใต้เงื่อนไขการทดสอบ
การสังเคราะห์ protease activity ) กำหนด
โดยดัดแปลงแอนสัน วิธี ( ยาง&วัง , 1999 ) .
ปฏิกิริยาผสมกับ 1 มิลลิลิตร 1 % ( w / v ) เคซีนใน
0.02 M NaOH และ 2 มล. 0.4 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์พีเอช 6.0
1 มิลลิลิตรของการสังเคราะห์ปานกลาง ( สามารถเจือจาง )
อุณหภูมิ 30 C / 10 นาที ปฏิกิริยาที่ถูกหยุดด้วย
3 ml 10% กรดไตรคลอโรอะซิติกผสม
และหลังจาก 5 นาที ระดับที่ 12000 ด้วยเป็นเวลา 5 นาที จากนั้น
0.5 ml ของ supernatants ถูกบ่มด้วย 0.1 M NaOH
2.5 มิลลิลิตร 2 % ( w / v ) Na2CO3 สำหรับ
10 นาทีหลังจากนั้น 0.25 มล. folin ฟีนสารเคมี
( โซลูชั่นเชิงพาณิชย์เจือจาง 1 : 1 ในน้ำกลั่น )
เพิ่มผสมอยู่สำหรับ 30 นาทีที่ อุณหภูมิห้อง
นวัดที่ 750 นาโนเมตรถูกแปลงเพื่อมิลลิกรัม / ลิตร
ซีนใช้เป็นรูปโค้ง ( มิลลิกรัม /
แต่อย่างใดผม กับ ค่า ) โดยโซลูชั่นละลาย
ซีนใน 0.01 M HCl , ได้รับในเงื่อนไขเดียวกับ
การสังเคราะห์ปานกลาง หนึ่งหน่วย ( หน่วยของเอนไซม์โปรติเอส
( EU ) / ml ) หมายถึงปริมาณของเอนไซม์ที่ผลิตค่า
1 750 นาโนเมตร เทียบเท่ากับ lmol แต่อย่างใด ใน 1 นาที ภายใต้เงื่อนไขการทดสอบ
2.4 . ผลของอุณหภูมิและ pH ที่มีผลต่อเสถียรภาพของเอนไซม์อะไมเลสและโปรติเอส
เพื่อ murado et al . ( 1993 ) ผสม 80 จะ paperfiltered
ปานกลาง ( สามารถเจือจาง ) กับ 400 จะ
0.15 เมตรซิเตรทฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ; pH 5.0 ( 1 เล่ม )
4 % soluble starch ( 1 เล่ม ) รักษาก่อนหน้านี้
ที่ 40 C / 15 นาที ปฏิกิริยาผสมบ่ม
ที่ 40 C นาน 10 นาที ปฏิกิริยาที่ถูกหยุด
94 . herna ใหม่ ndez et al ./ วารสารวิศวกรรมอาหาร 1 ( 2006 ) 93 - 100
โดยนอกเหนือจาก 480 จะ dinitrosalicylic กรด และปล่อย
กลูโคสถูกกำหนดจากปฏิกิริยาเป็นกรด 3,5-dinitrosalicylic
( bernfeld , 1951 ) หน่วยหนึ่งของกิจกรรมเอนไซม์อะไมเลส
( หน่วยของเอนไซม์ ( EU ) / ml ) หมายถึง ปริมาณของเอนไซม์ที่ปล่อย
1 มก. / มล. ลดน้ำตาล ( เทียบเท่ากลูโคส ) ภายใต้เงื่อนไขการทดสอบ
การสังเคราะห์ protease activity ) กำหนด
โดยดัดแปลงแอนสัน วิธี ( ยาง&วัง , 1999 ) .
ปฏิกิริยาผสมกับ 1 มิลลิลิตร 1 % ( w / v ) เคซีนใน
0.02 M NaOH และ 2 มล. 0.4 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์พีเอช 6.0
1 มิลลิลิตรของการสังเคราะห์ปานกลาง ( สามารถเจือจาง )
อุณหภูมิ 30 C / 10 นาที ปฏิกิริยาที่ถูกหยุดด้วย
3 ml 10% กรดไตรคลอโรอะซิติกผสม
และหลังจาก 5 นาที ระดับที่ 12000 ด้วยเป็นเวลา 5 นาที จากนั้น
0.5 ml ของ supernatants ถูกบ่มด้วย 0.1 M NaOH
2.5 มิลลิลิตร 2 % ( w / v ) Na2CO3 สำหรับ
10 นาทีหลังจากนั้น 0.25 มล. folin ฟีนสารเคมี
( โซลูชั่นเชิงพาณิชย์เจือจาง 1 : 1 ในน้ำกลั่น )
เพิ่มผสมอยู่สำหรับ 30 นาทีที่ อุณหภูมิห้อง
นวัดที่ 750 นาโนเมตรถูกแปลงเพื่อมิลลิกรัม / ลิตร
ซีนใช้เป็นรูปโค้ง ( มิลลิกรัม /
แต่อย่างใดผม กับ ค่า ) โดยโซลูชั่นละลาย
ซีนใน 0.01 M HCl , ได้รับในเงื่อนไขเดียวกับ
การสังเคราะห์ปานกลาง หนึ่งหน่วย ( หน่วยของเอนไซม์โปรติเอส
( EU ) / ml ) หมายถึงปริมาณของเอนไซม์ที่ผลิตค่า
1 750 นาโนเมตร เทียบเท่ากับ lmol แต่อย่างใด ใน 1 นาที ภายใต้เงื่อนไขการทดสอบ
2.4 . ผลของอุณหภูมิและ pH ที่มีผลต่อเสถียรภาพของเอนไซม์อะไมเลสและโปรติเอส
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- คุณคอยดูแลฉันทุกครั้งซึ่งแตกต่างจากคนไทย
- Please give me a little more time!
- การฝึกประสบการณ์
- วิทยุมีการนำเสนอรายการเพลง รายการข่าว รา
- วัดบึงบาล
- มันไม่เหมือนกับความพิการของแขนหรือขา ที่
- คุณประทับใจไหม
- The heat of the sun makes me feel hot.
- What is about you?
- On the surface
- ทำไมอยากอ่าน"โรบินฮูด" เพราะเรื่องนี้มีค
- ฉันกำลังไปทำการบ้าน
- hello nice to meet you am jasper by name
- Most of the school students and teachers
- The heat of the sun makes me feel hot.
- alcoholic
- ฉันจะถ่ายรูปไว้เป็นความทรงจำของฉัน
- ดินสอของฉันมันใช้ดีมาก
- ฉันทำตัวให้เป็นแบบอย่าง
- ที่มาของวันวาเลนไทน์
- ครบรอบ 1 ปี
- aflatoxin in milk
- ทะเลเผา
- Study on diet and stocking density in ne
