[3H]-Thymidine Incorporation Assay

[3H]-Thymidine Incorporation Assay for Rat-1a Cells
Please find the following protocol:
[3H]-Thymidine Incorporation Assay for Rat-1a Cells
Overview:
The rate of proliferation of cells can be measured by determining the incorporation of [3H]-thymidine into cellular nucleic acids.
Procedure:
Synchronizing Cells in a Low Growth State to Make Cells Quiescent
1. Seed 500,000 cells per well in a 24-well plate in DMEM+ 10% Fetal Calf Serum.
2. Incubate cells in a 37°C incubator for 12 to 24 hr.
3. Remove the media from the wells and rinse the cells once with serum-free media (DMEM).
4. Add 1 ml of serum-free media to each well.
5. Incubate the cells for 24 hr in a 37°C humidified 5% CO2 incubator.
Stimulating cell proliferation and labeling with [3H]-Thymidine
1. Add Dynorphin or Spiradoline to a concentration in the range of 0.05 pM to 1 μM.
2. Incubate cells for 16 hr in a 37°C humidified 5% CO2 incubator.
3. Add 1 μCi of [3H]-Thymidine (NEN) to each well. For ease of manipulation, add 1 μl of Thymidine (1 μCi) to 24 μl of media . Then add this mixture to each well.
4. Incubate the cells 8 hr in a 37°C humidified 5% CO2 incubator.
Extraction of [3H]-Thymidine-labeled DNA
1. Aspirate the media from each well.
2. Wash the cells carefully with 1 ml of ice-cold PBS.
3. Aspirate PBS.
4. Add 1 ml of ice-cold 5% TCA.
5. Incubate cells at 4°C for 30 min.
6. Aspirate TCA solution and wash once with PBS.
7. At room temperature, add 0.5 ml of 0.5 M NaOH/0.5% SDS Solution.
8. Pipette the cell suspension up and down to lyse cells and add this mixture directly to scintillation vials containing Scintillation Fluid.
9. Count the vials in a scintillation counter for assessment of radioactive nucleotide incorporation.
Solutions:

PBS.............................................................................pH 7.2

.......................................................................2.7 mM KCl

.....................4.3 mM Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4)

...............1.8 mM Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)

....................................................................137 mM NaCl

70-90 Ci/mmole methyl-[3H]-Thymidine (NEN, 1 mCi/ml) ...............................................CAUTION! Biohazard

DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) + 10% Fetal Calf Serum
0.5 M NaOH/0.5% SDS Solution.......................0.5% (w/v) SDS
..............................0.5 M NaOH
5% (w/v) TCA................................CAUTION! Biohazard

Bioreagents and Chemicals:

Sodium Phosphate, Dibasic
Potassium Phosphate, Monobasic
Potassium Chloride
Sodium Chloride
Sodium Hydroxide
SDS
Trichloroacetic Acid (TCA)
Scintillation Fluid
[3H]-Thymidine
Fetal Calf Serum (FCS)
DMEM
Spiradoline
Dynorphin

- See more at: http://www.scientistsolutions.com/forum/cell-culture-and-tissue-culture-proliferationapoptosis/3h-thymidine-incorporation-assay-rat-1a#sthash.7jwZhBst.dpuf

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

[3H] -ทดสอบประสาน Thymidine Rat 1a เซลล์กรุณาค้นหาโพรโทคอต่อไปนี้: [3H] -ทดสอบประสาน Thymidine Rat 1a เซลล์ภาพรวม:สามารถวัดอัตราการเจริญเติบโตของเซลล์ โดยการพิจารณาเสนอแนะ [3H] -thymidine เป็นกรดนิวคลีอิกที่เซลลูลาร์ได้ขั้นตอน:เซลล์ที่ตรงกันในสถานะต่ำเจริญเติบโตจะทำให้เซลล์ไม่มีการทำ 1. เมล็ด 500,000 เซลล์ต่อกันอยู่ในจานเช่น 24 DMEM + 10% ซีรั่มลูกทารกในครรภ์ 2. ฟักเซลล์ในตู้อบ 37° C ที่ 12 ถึง 24 ชั่วโมง 3. เอาสื่อออกจากหลุม และล้างเซลล์หนึ่งครั้ง ด้วยเซรั่มฟรีสื่อ (DMEM) 4. เพิ่ม 1 มล.ซีรั่มฟรีสื่อแต่ละอย่าง 5. ฟักเซลล์สำหรับ 24 ชั่วโมงในตู้ 37° C ณอุณหภูมิ 5% CO2 อบกระตุ้นเซลล์ และการติดฉลาก ด้วย [3H] -Thymidine 1. เพิ่ม Dynorphin หรือ Spiradoline ให้ความเข้มข้นในช่วง 0 pM 05 ถึง 1 Μm 2. เซลล์ฟัก 16 ชั่วโมงในในตู้อบ 37 C 5% CO2 ณอุณหภูมิ 3. เพิ่ม μCi 1 ของ [3H] -Thymidine (ฆราวาส) ไปดีละกัน สำหรับการจัดการง่าย เพิ่ม μl 1 ของ Thymidine (1 μCi) กับ μl 24 สื่อ เพิ่มส่วนผสมนี้ไปละดี4. เซลล์ฟัก 8 ชมในในตู้อบ 37 C 5% CO2 ณอุณหภูมิป้าย [3H] - Thymidine - สกัดดีเอ็นเอ1. aspirate สื่อจากแต่ละดี 2. ล้างเซลล์ ด้วย 1 ml ของ PBS ฉ่ำอย่างระมัดระวัง 3. aspirate PBS 4. เพิ่ม 1 มล.ฉ่ำ 5% TCA 5. ฟักเซลล์ที่ 4° C เป็นเวลา 30 นาที 6. aspirate โซลูชัน TCA และล้าง ด้วย PBS ครั้ง 7. ที่อุณหภูมิห้อง เพิ่ม 0.5 ml ของ 0.5 M NaOH/0.5% SDS โซลูชัน 8. ปิเปตระงับเซลล์ขึ้นและลงเพื่อ lyse เซลล์ และเพิ่มส่วนผสมนี้อาร์กอนขวดบรรจุของเหลวอาร์กอนโดยตรง 9. นับขวดในเคาน์เตอร์อาร์กอนสำหรับการประเมินการจดทะเบียนนิติบุคคลกัมมันตรังสีนิวคลีโอไทด์โซลูชั่น: PBS.............................................................................pH 7.2 ....................................................................... 2.7 mM KCl ..................... 4.3 มม.โซเดียมฟอสเฟต Dibasic (Na2HPO4) ............... 1.8 มม.โพแทสเซียมฟอสเฟต Monobasic (KH2PO4) .................................................................... 137 มม. NaCl 70-90 Ci/mmole เมทิล- [3H] -Thymidine (ฆราวาส 1 mCi/ml) ... ข้อควรระวัง ปลอดเชื้อ DMEM (ของ Dulbecco ปรับอินทรีกลาง) + เซรั่ม 10% ลูกทารกในครรภ์ 0.5 M NaOH/0.5% SDS โซลูชัน... 0.5% (w/v) SDS .............................. 0.5 M NaOH 5% (w/v) TCA................................ ข้อควรระวัง ปลอดเชื้อ Bioreagents และสารเคมี: โซเดียมฟอสเฟต Dibasic โพแทสเซียมฟอสเฟต Monobasic โพแทสเซียมคลอไรด์ โซเดียมคลอไรด์ โซเดียมไฮดรอกไซด์ SDS กรด Trichloroacetic (TCA) อาร์กอนเหลว [3H] -Thymidine เซรั่มลูกทารก (FCS) DMEM Spiradoline Dynorphin-ดูเพิ่มเติมได้ที่: http://www.scientistsolutions.com/forum/cell-culture-and-tissue-culture-proliferationapoptosis/3h-thymidine-incorporation-assay-rat-1a#sthash.7jwZhBst.dpuf

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

[3H] -Thymidine อินคอร์ปอเรชั่น Assay สำหรับเซลล์หนู-1a
กรุณาหาโปรโตคอลต่อไปนี้:
[3H] -Thymidine อินคอร์ปอเรชั่น Assay สำหรับหนู-1a เซลล์
ข้อมูลทั่วไป:
อัตราการแพร่กระจายของเซลล์สามารถวัดได้โดยการกำหนดการรวมตัวกันของ [3H] - . thymidine เป็นกรดนิวคลีอิกโทรศัพท์มือถือ
ขั้นตอน:
ตรงกันเซลล์ในรัฐการเจริญเติบโตต่ำการสร้างเซลล์ Quiescent
1 เมล็ดพันธุ์ 500,000 เซลล์ต่อดีในจาน 24 หลุมใน DMEM + 10% ของทารกในครรภ์ลูกวัวเซรั่ม.
2 บ่มเพาะเซลล์ในอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลาบ่มเพาะ 12 ถึง 24 ชม.
3 นำกระดาษออกจากบ่อและล้างเซลล์ครั้งกับสื่อในซีรั่มฟรี (DMEM).
4 เพิ่ม 1 มิลลิลิตรของสื่อในซีรั่มฟรีให้กับแต่ละกัน.
5 บ่มเพาะเซลล์เป็นเวลา 24 ชั่วโมงในอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสความชื้นศูนย์บ่มเพาะ CO2 5%.
กระตุ้นการเพิ่มจำนวนเซลล์และการติดฉลากด้วย [3H] -Thymidine
1 เพิ่ม Dynorphin หรือ Spiradoline กับความเข้มข้นในช่วง 12:05 ถึง 1 ไมครอนได้.
2 บ่มเพาะเซลล์ 16 HR ในความชื้นศูนย์บ่มเพาะ CO2 37 องศาเซลเซียส 5%.
3 เพิ่ม 1 μCiของ [3H] -Thymidine (NEN) แต่ละอย่างดี เพื่อความสะดวกในการจัดการเพิ่ม 1 ไมโครลิตรของ Thymidine (1 μCi) ถึง 24 ไมโครลิตรของสื่อ จากนั้นจึงใส่ส่วนผสมนี้ให้กับแต่ละกัน.
4 บ่มเพาะเซลล์ 8 ชมในอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสความชื้นศูนย์บ่มเพาะ CO2 5%.
สกัด [3H] -Thymidine ป้ายดีเอ็นเอ
1 ดูดสื่อจากแต่ละกัน.
2 ล้างเซลล์อย่างระมัดระวังด้วย 1 มิลลิลิตรของเย็นพีบีเอส.
3 ดูดพีบีเอส.
4 เพิ่ม 1 มิลลิลิตรเย็น 5% TCA.
5 บ่มเพาะเซลล์ที่ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที.
6 วิธีการแก้ปัญหาดูด TCA และล้างครั้งเดียวกับพีบีเอส.
7 ที่อุณหภูมิห้องเพิ่ม 0.5 มล. 0.5 M NaOH / 0.5% SDS โซลูชั่น.
8 เปตเซลล์ระงับการขึ้นและลงไปยังเซลล์ Lyse และเพิ่มส่วนผสมนี้โดยตรงกับขวดที่มีประกายระยิบระยับของไหล.
9 นับขวดเคาน์เตอร์ประกายการประเมินความเบื่อหน่ายของสารกัมมันตรังสี 7.2 ................................................. ...................... 2.7 มิลลิ KCl ..................... 4.3 มิลลิโซเดียมฟอสเฟต dibasic (Na2HPO4) ............... 1.8 มิลลิโพแทสเซียมฟอสเฟต monobasic (KH2PO4) ....................... ............................................. 137 มิลลิโซเดียมคลอไรด์70 90 Ci / mmole เมธิล [3H] -Thymidine (NEN 1 มิลลิ / ml) ............................... ................ ข้อควรระวัง! Biohazard DMEM (Dulbecco ของ Modified นกอินทรีขนาดกลาง) + 10% ของทารกในครรภ์ลูกวัวเซรั่ม0.5 M NaOH / 0.5% SDS โซลูชั่น ....................... 0.5% (w / V) SDS .............................. 0.5 M NaOH 5% (w / v) TCA ...... .......................... ข้อควรระวัง! Biohazard Bioreagents และสารเคมี: โซเดียมฟอสเฟต Dibasic โพแทสเซียมฟอสเฟต monobasic โพแทสเซียมคลอไรด์โซเดียมคลอไรด์โซเดียมไฮดรอกไซSDS Trichloroacetic Acid (TCA) ประกายของไหล[3H] -Thymidine ของทารกในครรภ์ลูกวัวเซรั่ม (FCS) DMEM Spiradoline Dynorphin - ดูเพิ่มเติมได้ที่:

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

[ 3 ] - เพียงใช้สำหรับการ rat-1a เซลล์กรุณาหาโปรโตคอลดังต่อไปนี้ :[ 3 ] - เพียงใช้สำหรับการ rat-1a เซลล์ภาพรวม :อัตราการงอกของเซลล์ที่สามารถวัดได้โดยการรวมตัวกันของ [ 3 ] - เพียงเป็นโทรศัพท์มือถือ กรดนิวคลีอิกขั้นตอน :การเซลล์ในรัฐต่ำเพื่อให้เซลล์ที่มีการเจริญเติบโต1 . เมล็ด 500000 เซลล์ต่อใน 24 ดี จาน dmem + 10% fetal คาล์ฟซีรั่ม2 . บ่มเพาะเซลล์ใน 37 ° C บ่มเป็นเวลา 12 ถึง 24 ชั่วโมง3 . เอาสื่อจากบ่อและล้างเซลล์เมื่อมี serum-free สื่อ ( dmem )4 . เพิ่ม 1 มิลลิลิตร serum-free สื่อกันได้ดี5 . บ่มเพาะเซลล์ 24 ชั่วโมงใน 37 ° C humidified 5% CO2 ตู้ฟักไข่กระตุ้นเซลล์ proliferation และการติดฉลากด้วย [ 3 ] - ไทมิดีน1 . เพิ่มไดนอร์ฟินหรือ spiradoline เพื่อความเข้มข้นในช่วง 0.05 น. 1 μม.2 . บ่มเพาะเซลล์เป็นเวลา 16 ชั่วโมง 37 ° C humidified 5% CO2 ตู้ฟักไข่3 . เพิ่ม 1 และ # 956 ; CI [ 3 ] - ไทมิดีน ( เณร ) แต่ละครั้งได้อีกด้วย เพื่อความสะดวกในการจัดการ เพิ่ม 1 μลิตรเพียง ( 1 μ CI ) 24 μ L ของสื่อ แล้วเพิ่มส่วนผสมนี้กัน .4 . บ่มเพาะเซลล์ 8 ชั่วโมงใน 37 ° C humidified 5% CO2 ตู้ฟักไข่การสกัด [ 3 ] - เพียงติดป้ายว่าดีเอ็นเอ1 . หรือ สื่อจากแต่ละคนได้ดี2 . ล้างเซลล์ด้วย 1 มิลลิลิตรของ PBS เย็นน้ำแข็ง3 . หรือ PBS4 . เพิ่ม 1 ml เย็น 5 % TCA .5 . บ่มเซลล์ที่ 4 ° C เป็นเวลา 30 นาที6 . โซลูชั่นที่ TCA หรือล้างครั้งเดียวกับ PBS7 . ที่อุณหภูมิห้อง , เพิ่ม 0.5 ml 0.5 M NaOH / 0.5 % SDS โซลูชั่น8 . ปิเปตต์เซลล์แขวนลอยขึ้นและลงเพื่อทำให้เซลล์และเพิ่มส่วนผสมนี้โดยตรงขวดที่มีประกายแสงของเหลว9 . นับไวรัสในตัวนับประกายสำหรับการประเมินของนิติบุคคลนิวคลีโอไทด์กัมมันตรังสีโซลูชั่น :พีบีเอส ............................................................................. pH 7.2....................................................................... 2.7 mm ...................... 4.3 มิลลิเมตรโซเดียมฟอสเฟต dibasic ( na2hpo4 )เอ๊ย 1.8 มม. โพแทสเซียมฟอสเฟต monobasic ( kh2po4 ).................................................................... 137 mM NaCl70-90 CI / มิลลิโมลเมทิล - [ 3 ] - ไทมิดีน ( เณร 1 มิลลิคูรีต่อมิลลิลิตร ) ............................................... ข้อควรระวัง ! การคุกคามทางชีวภาพdmem ( ดัลเบโค่การนกอินทรีขนาดกลาง ) + 10% เซรั่มของน่อง0.5 M NaOH / 0.5 % SDS โซลูชั่น ....................... 0.5% ( w / v ) SDS.............................. 0.5 M โซเดียมไฮดรอกไซด์5% ( w / v ) TCA ................................ ข้อควรระวัง ! การคุกคามทางชีวภาพbioreagents และสารเคมี :โซเดียมฟอสเฟต dibasicโพแทสเซียมฟอสเฟต monobasicโพแทสเซียมคลอไรด์โซเดียมคลอไรด์โซดาไฟSDSกรดไตรคลอโรอะซิติก ( TCA )แสงของเหลว[ 3 ] - ไทมิดีนซีรัมลูกโค ( fetal FCS )dmemspiradolineไดนอร์ฟินดูเพิ่มเติมได้ที่ : http : / / www.scientistsolutions . com / ฟอรั่ม / เซลล์และเนื้อเยื่อวัฒนธรรม proliferationapoptosis / 3h-thymidine-incorporation-assay-rat-1a # sthash.7jwzhbst.dpuf