0.64 μg/μL. One volume of each extr

0.64 μg/μL. One volume of each extract was combined with 0.5 volumes sample/buffer tracking dye solution [3 mM ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), 3% (w/v) SDS, 30 mM Tris, pH 8.0; 30% (v/v) glycerol, 0.003% (w/v) pyronine Y) (Wang, 1982) and 0.1 volumes of 2- mercaptoethanol for a final protein concentration of 0.4 μg/μL. Gel samples were heated to 60 °C for 15 min and then frozen at −80 °C for up to 10 d until electrophoresis.
Individual sample protein extracts were loaded (3.2 μg protein) onto 1.5 mm thick mini polyacrylamide gels (5% stacking and 15% resolving with a 37.5:1 acrylamide:bis crosslinking and separated by electropho- resis in a running buffer [25 mM Tris, 0.19 M glycine, 1.7 mM EDTA, 0.1% (w/v) SDS] for 3.5 h at a constant voltage of 150. After electrophoresis, proteins were transferred onto polyvinylidene fluoride membranes (Immobilon-P, 0.45 μm pore size; Millipore Corporation, Billerica, MA) in a transfer buffer [25 mM Tris, 0.19 M glycine, 1.7 mM EDTA, 15% (v/v) methanol] using a wet tank transfer system with cooling at 90 V for 1.5 h.
Membranes were incubated at room temperature in a blocking solution of 5% (w/v) nonfat dry milk in phosphate buffered saline (PBS)-Tween [80 mM sodium phosphate, dibasic; 20 mM sodium phos- phate, monobasic, 100 mM sodium chloride, 0.1% (v/v) polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween 20)]. After blocking, membranes were incubated overnight at 4 °C with mouse monoclonal anti-rabbit TnT antibody (clone JLT-12, Sigma T 6277, St. Louis, MO) diluted 1:45,000 in PBS-Tween. Blots were washed in PBS-Tween and then probed with goat anti-mouse IgG peroxidase conjugate (Sigma A 2554) diluted 1:45,000 in wash buffer for 1 h at room temperature.
Blots were washed with the PBS-Tween solution, and ECL Prime Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare Biosciences, Piscataway, NJ) were used to detect immunoreactive bands. A molecu- lar weight marker was used to estimate the molecular weights of the immunoreactive bands. Chemiluminescence was photo-documented and measured with an Alpha Innotech FluorChem FC2 image analysis system with supporting AlphaEaseFC software (Protein Simple, Santa Clara, CA) using 1-D multi analysis with horizontal baseline and a band width sample of ~ 60% of the total band width. All band intensities were normalized (band area value/control area value) to the intensity of the 30-kDa degradation Bandof a whole muscle protein extract control sample run on every gel.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Μg 0.64/μL เสียงหนึ่งของสารสกัดแต่ละถูกรวมกับตัวอย่างปริมาณ 0.5/ติดตาม แก้ไขปัญหาย้อมบัฟเฟอร์ [3 มม. ethylenediamine tetraacetic กรด (EDTA), องค์กร 3% (w/v) ตรี pH 8.0; 30 มม. 30% (v/v) กลีเซอร 0.003% (w/v) pyronine Y) (วัง 1982) และ 2-mercaptoethanol สำหรับความเข้มข้นสุดท้ายโปรตีนของ 0.4 μg μL 0.1 จำนวนมาก ตัวอย่างเจมีอุณหภูมิ 60 ° C สำหรับ 15 นาที และแช่ใน −80 ° C สำหรับถึง 10 d จน electrophoresisสารสกัดจากโปรตีนแต่ละตัวอย่างถูกโหลด (3.2 μg โปรตีน) ลง 1.5 มม.หนามินิ polyacrylamide gels (ซ้อน 5% และ 15% แก้ไข ด้วยการ 37.5:1 acrylamide:bis crosslinking และคั่น ด้วย electropho-resis ในบัฟเฟอร์รัน [25 มม.ตรี 0.19 M glycine, 1.7 mM EDTA, 0.1% (w/v) SDS] สำหรับ h 3.5 ที่แรงดันคงที่ 150 หลัง electrophoresis โปรตีนถูกโอนย้ายไปยังสารฟลูออไรด์ polyvinylidene (Immobilon-P, 0.45 μm รูขุมขนขนาด มากบริษัท Billerica, MA) ในบัฟเฟอร์โอน [25 มม.ตรี 0.19 M glycine, 1.7 mM EDTA เมทานอล 15% (v/v)] ด้วยระบบโอนย้ายถังน้ำระบายความร้อนที่ 90 V สำหรับ 1.5 hเข้าที่ incubated ที่อุณหภูมิห้องในการแก้ปัญหาการบล็อคของนมแห้ง nonfat 5% (w/v) ในน้ำเกลือฟอสเฟต buffered (PBS) -Tween [80 mM โซเดียมฟอสเฟต dibasic; 20 มม.โซเดียม phos-phate, monobasic, 100 มม.โซเดียมคลอไรด์ 0.1% (v/v) polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween 20)] หลังบล็อก เยื่อหุ้มถูก incubated ค้างคืนที่ 1:45,000 4 ° C มีเมาส์โมโนกระต่ายป้องกันภายหลังแอนติบอดี (ในโคลนที่ JLT-12 ซิก T 6277, St. Louis, MO) ยกเว้นใน PBS Tween กันบล็อทล้างใน PBS Tween และพิสูจน์แล้ว กับแพะป้องกันเมาส์ IgG peroxidase ค่าสังยุค (ซิกเป็น 2554) ยกเว้น 1:45,000 ในล้างบัฟเฟอร์สำหรับ h 1 ที่อุณหภูมิห้องกันบล็อทถูกล้าง ด้วย PBS Tween โซลูชัน และ ECL นายกเวส blotting วิธีตรวจ Reagents (เวลาออกสุขอนามัยการ GE ปิสกาตาเวย์ NJ) ใช้ตรวจหาวง immunoreactive ใช้เครื่องหมาย molecu lar น้ำหนักประเมินน้ำหนักโมเลกุลของวง immunoreactive Chemiluminescence ถูก บันทึกภาพ และวัดกับระบบวิเคราะห์ภาพ Alpha Innotech FluorChem FC2 มีสนับสนุนซอฟต์แวร์ AlphaEaseFC (โปรตีนอย่างง่าย ซานตาคลารา CA) ใช้วิเคราะห์ 1 D หลายหลักแนวนอนและแบบวงกว้างตัวอย่าง ~ 60% ของความกว้างของวงรวมกัน ปลดปล่อยก๊าซทั้งหมดของวงได้ตามปกติ (วงที่ตั้งค่า/ควบคุมตั้งค่า) กับความเข้มของย่อยสลาย 30 kDa ตัวกล้ามเนื้อทั้งหมดโปรตีนสกัดควบคุมอย่างรันเจลทุก Bandof

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

0.64 ไมโครกรัม / ไมโครลิตร ปริมาณหนึ่งของสารสกัดแต่ละคนถูกรวมกับ 0.5 ปริมาณตัวอย่าง / บัฟเฟอร์การติดตามการแก้ปัญหาสีย้อม [3 มิลลิ ethylenediamine กรด tetraacetic (EDTA), 3% (w / v) SDS 30 มิลลิทริสพีเอช 8.0; 30% (v / v) กลีเซอรอล, 0.003% (w / v) pyronine Y) (วัง 1982) และ 0.1 เล่ม 2 mercaptoethanol สำหรับโปรตีนเข้มข้นสุดท้ายของ 0.4 ไมโครกรัม / ไมโครลิตร ตัวอย่างเจลถูกความร้อนถึง 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 นาทีและจากนั้นแช่แข็งที่ -80 ° C ถึง 10 จนกว่าอิ.
สารสกัดจากโปรตีนตัวอย่างบุคคลที่ถูกโหลด (3.2 ไมโครกรัมโปรตีน) ลง 1.5 มมเจลอะคริเลตขนาดเล็ก (ซ้อน 5% และ 15% การแก้ปัญหาที่มี 37.5: 1 ริลาไมด์: ทวิเชื่อมขวางและแยกจากกันโดย resis electropho- ในบัฟเฟอร์ทำงาน [25 มิลลิ Tris, 0.19 M glycine, EDTA 1.7 มิลลิ 0.1% (w / v) SDS] 3.5 ชั่วโมงที่คงที่ แรงดันไฟฟ้าของ 150 หลังจากที่อิโปรตีนถูกโอนไปยังเมมเบรนฟลูออไร Polyvinylidene (Immobilon-P, 0.45 ไมโครเมตรขนาดรูขุมขน; คคอร์ปอเรชั่นบิลเลริกา, MA) ในบัฟเฟอร์โอน [25 มิลลิ Tris, 0.19 M glycine, EDTA 1.7 มิลลิ, 15% (v / v) เมทานอล] โดยใช้ระบบการโอนถังเปียกด้วยการระบายความร้อนที่ 90 V 1.5 ชม.
เยื่อถูกบ่มที่อุณหภูมิห้องในการแก้ปัญหาการปิดกั้นของ 5% (w / v) ไม่มีน้ำมันนมแห้งในฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือ (พีบีเอส) -Tween [โซเดียมฟอสเฟต 80 มิลลิ, dibasic 20 มิลลิโซเดียม phos- phate, monobasic 100 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ 0.1% (v / v) ซอร์ polyoxyethylene monolaurate (Tween 20)] หลังจากที่ปิดกั้นเยื่อถูกบ่มค้างคืนที่ 4 ° C ที่มีโมโนโคลนอลเมาส์ต่อต้านกระต่าย TnT แอนติบอดี (โคลน JLT-12, ซิก T 6277, เซนต์หลุยส์) เจือจาง 1: 45,000 ในพีบีเอส-Tween blots ถูกล้างในพีบีเอส-Tween และการตรวจสอบแล้วกับแพะ IgG ต่อต้านเมาส์ผัน peroxidase (ซิกม่า 2554) เจือจาง 1: 45,000 ในบัฟเฟอร์ล้างเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง.
blots ถูกล้างด้วยโซลูชั่นที่พีบีเอส-Tween และ ECL นายกรัฐมนตรี เวสเทิร์ซับการตรวจวิเคราะห์สาร (GE Healthcare ชีววิทยาศาสตร์, พิสแคต, นิวเจอร์ซีย์) ถูกนำมาใช้ในการตรวจสอบวงดนตรี immunoreactive เครื่องหมายน้ำหนัก LAR molecu- ถูกใช้ในการประเมินน้ำหนักโมเลกุลของวงดนตรีที่ immunoreactive chemiluminescence ได้ภาพเอกสารและวัดที่มีภาพอัลฟา Innotech FluorChem FC2 ระบบการวิเคราะห์ที่มีการสนับสนุนซอฟต์แวร์ AlphaEaseFC (โปรตีนง่ายซานตาคลารา, แคลิฟอร์เนีย) โดยใช้ 1-D วิเคราะห์หลายคู่พื้นฐานแนวนอนและตัวอย่างวงกว้างของ ~ 60% ของจำนวนทั้งหมด วงกว้าง ความเข้มวงทุกคนปกติ (วงดนตรีค่าพื้นที่ / การควบคุมค่าพื้นที่) ความรุนแรงของการย่อยสลาย 30 กิโลดาลตัน Bandof โปรตีนของกล้ามเนื้อทั้งสารสกัดจากการควบคุมการทำงานของกลุ่มตัวอย่างในทุกเจล

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

μ 0.64 กรัม / ลิตรμเล่มหนึ่งของแต่ละแยกมารวมกับ 0.5 ปริมาณตัวอย่าง / บัฟเฟอร์ติดตามสารละลายสีย้อม [ 3 มิลธิลีนไดเ ีน tetraacetic acid ( EDTA ) , 3% ( w / v ) t , 30 มม. ซึ่ง pH 8.0 ; 30 เปอร์เซ็นต์ ( v / v ) กลีเซอรอล 0.003 % ( w / v ) ไพโรนีน 6 จี Y ) ( วัง , 1982 ) และ 0.1 เล่ม 2 - mercaptoethanol สำหรับความเข้มข้นโปรตีนสุดท้าย 0.4 μกรัม / μ Lมีตัวอย่างเจลอุ่น 60 ° C เป็นเวลา 15 นาที แล้วแช่แข็งที่อุณหภูมิ− 80 ° C ถึง 10 D จนกว่า electrophoresis
บุคคลตัวอย่างโปรตีนที่แยกได้มีโหลด ( 3.2 μกรัมโปรตีน ) ลงบนโพลีอะคริลาไมด์เจลหนา 1.5 มม. มินิ ( 5% ซ้อนและ 15% การแก้ไขด้วย 37.5:1 อะคริลาไมด์ : ทำปฏิกิริยาทวิและแยก โดย electropho - รีซิซในการวิ่งบัฟเฟอร์ [ 25 มม. นอกจากนี้ 0.19 M glycine , 0.5 mM EDTA , 0 .1% ( w / v ) t ] 3.5 H ที่แรงดันคงที่ 150 หลังจากอิเล็ก โปรตีนถูกโอนไปยังีนฟลูออไรด์เมมเบรน ( immobilon-p 0.45 มิลลิμ M ขนาดรูพรุน ; บริษัท โตเกียว , MA ) ในการบัฟเฟอร์ [ 25 มม. นอกจากนี้ 0.19 M glycine , 0.5 mM EDTA , 15 เปอร์เซ็นต์ ( v / v ) ส่วน ] โดยใช้ระบบโอนรถถังเปียกเย็นที่ 90 V สำหรับ
1.5 ชั่วโมงเยื่อแผ่นแบบบ่มที่อุณหภูมิห้องในบล็อกโซลูชั่น 5% ( w / v ) ในฟอสเฟตบัฟเฟอร์นมไขมันต่ำเกลือแห้ง ( PBS ) - ทวี [ 80 มิลลิเมตรโซเดียมฟอสเฟต dibasic ; 20 มิลลิเมตรโซเดียม phos - เฟต monobasic , โซเดียมคลอไรด์ , 100 มม. , 0.1 เปอร์เซ็นต์ ( v / v ) พอลีออกซีเอทิลีนซอบิแทนโมโน monolaurate ( ทวีน 20 ) ] หลังจากที่บล็อกเยื่อแผ่นแบบบ่มค้างคืนที่ 4 ° C กับโมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อต้านกระต่ายทีเอ็นที ( โคลน jlt-12 , Sigma T 6277 เซนต์หลุยส์ โม ) ซึ่ง 1:45000 ใน PBS ทวี . ไม้ถูกล้างใน PBS Tween และจากนั้นตรวจสอบแพะป้องกันเมาส์ IgG peroxidase ) ( Sigma เป็น 2554 ) เจือจาง 1:45000 ในบัฟเฟอร์ซัก 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง
ไม้ถูกล้างด้วย pbs Tween , สารละลายECL นายกรัฐมนตรีและ Western blotting ตรวจจับสารเคมี ( GE Healthcare ชีววิทยา ปิสกาตาเวย์ , NJ ) ถูกใช้เพื่อตรวจสอบวง immunoreactive . เป็น molecu - เครื่องหมายน้ำหนักลาร์ใช้ประเมินน้ำหนักโมเลกุลของวง immunoreactive .นโยบายแรงงานคือภาพเอกสารและวัดกับอัลฟ่าอินโนเทค fluorchem fc2 ระบบวิเคราะห์ภาพด้วยซอฟต์แวร์ที่สนับสนุน alphaeasefc ( โปรตีนง่าย , ซานตาคลารา , แคลิฟอร์เนีย ) โดยใช้การวิเคราะห์พื้นฐานภายในหลายความกว้างแนวนอนและวงตัวอย่าง ~ 60% ของวงกว้างทั้งหมด