Fig.•5. Phase-contrast micrograph o

Fig.•5. Phase-contrast micrograph of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis strain 4Q7/p45S1-11B, which produces crystals of Cry11B, Cyt1A and the Bacillus sphaericus binary toxin.

Fig.•6. Analysis of endotoxin content in recombinant strains of Bacillus thuringiensis. M, molecular mass marker; lane 1, B. thuringiensis subsp. israelensis 4Q7 producing Bs binary toxin and Cyt1A (4Q7/p45S1); lane 2, B. thuringiensis subsp. israelensis 4Q7 producing Cry11B (4Q7/pPFT11Bs-CRP); lane 3, B. thuringiensis subsp. israelensis 4Q7 producing Cry11B, Cyt1A and Bs binary toxin (4Q7/p45S1-11B).


marker for expression in Bti (Fig.•4). The first plasmid (P45S1) contained as its key elements the Bs Bin toxin operon, under the control of cyt1A promoters and the STAB/SD sequence, along with the cyt1A gene and the 20-kDa chaperone-like protein, under the control of the cry1Ac promoters (Wu and
Federici, 1993, 1995; Park et al., 1998). This plasmid had, as its selectable marker, erythromycin resistance. The second plasmid (pPFT11Bs-CRP) contained the cry11B gene under the control of cyt1A promoters and the STAB/SD sequence. The first plasmid was transferred into a Bti crystal minus strain
(4Q7) by electroporation, and the transformants were selected on brain heart infusion agar containing erythromycin. Subsequently, the second plasmid (pPFT11BS-CRP) was transferred into this transformant by electroporation and was selected for on plates containing chloramphenicol. Analysis of this double transformant by microscopy and SDS-PAGE showed that it produced large quantities of all three endotoxins
(Figs•5,•6). Bioassays of this double transformant against fourth instars of C. quinquefasciatus showed that it had an LC50 of 1.7•ng•ml–1, making it approximately fourfold as toxic as Bti (LC50=7.9•ng•ml–1) and approximately sixfold as toxic as Bs 2362 (LC50=12.6•ng•ml–1). While the activity of this recombinant was much better against this species than Bti or Bs, against A. aegypti the toxicity was much lower than Bti (Table•1). As the second example, we transformed the p45S1 plasmid described above, which produces large amounts of the Bs Bin toxin, into the acrystalliferous strain of Bti (4Q7) as well as
into IPS-82, a strain of Bti that produces the normal complement of Bti toxins. Both of these strains produced very large quantities of the Bs Bin toxin, as assessed by SDS-PAGE analysis (Fig.•7). Both of these transformants had markedly improved toxicity in comparison with wild-type strains of Bti
or Bs 2362, each being at least 10-fold more toxic against
Fig.•7. Recombinant strains of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (Bti) that produce the Bacillus sphaericus (Bs) 2362 binary toxin. (A) Acrystalliferous strain transformed with a plasmid that produces the Bs 2362 binary toxin using cyt1A promoters and the STAB/SD mRNA stabilizing sequence. (B) IPS-82 transformed with the same plasmid. A large crystal of the Bs binary toxin and a typical Bti crystal are obvious in the sporulated cell. (C) SDS-PAGE analysis of IPS-82 (lane Bti) and IPS-82 producing the Bti proteins and the Bs binary toxin (lane Bti/BsB).

fourth instars of C. quinquefasciatus as assessed by comparison of their LC50s per unit fermentation medium (Table•2). However, there was no substantial improvement in toxicity against fourth instars of A. aegypti

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

รูป. • 5 micrograph เฟสความคมชัดของ Bacillus thuringiensis subsp israelensis ความเครียด 4Q7 / p45S1-11B ซึ่งเป็นผู้ผลิตคริสตัล Cry11B, Cyt1A และ Bacillus sphaericus พิษไบนารี. รูป. • 6 การวิเคราะห์เนื้อหา endotoxin ในสายพันธุ์ recombinant ของเชื้อ Bacillus thuringiensis M เครื่องหมายมวลโมเลกุล; ช่องทางที่ 1, B. thuringiensis subsp israelensis 4Q7 Bs ผลิตสารพิษไบนารีและ Cyt1A (4Q7 / p45S1); ช่องทางที่ 2 B. thuringiensis subsp israelensis 4Q7 ผลิต Cry11B (4Q7 / pPFT11Bs-CRP); ช่อง 3 บี thuringiensis subsp israelensis 4Q7 ผลิต Cry11B, Cyt1A Bs และสารพิษไบนารี (4Q7 / p45S1-11B). เครื่องหมายสำหรับการแสดงออกใน Bti (รูป. • 4) พลาสมิดแรก (P45S1) ที่มีเป็นองค์ประกอบที่สำคัญของ operon พิษถัง Bs ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ cyt1A และลำดับแทง / SD พร้อมกับยีน cyt1A และ 20 กิโลดาลตันโปรตีนพี่เลี้ยงเหมือนภายใต้การควบคุมของ โปรโมเตอร์ cry1Ac (วูและเดอร์ริ, 1993, 1995; ปาร์ค et al, 1998). พลาสมิดนี้ได้เป็นเครื่องหมายเลือกของ erythromycin ต้านทาน พลาสมิดที่สอง (pPFT11Bs-CRP) ที่มียีน cry11B ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ cyt1A และแทง / ลำดับแบบ SD พลาสมิดแรกที่ถูกโอนเข้ามาในสายพันธุ์ลบคริสตัล Bti (4Q7) โดย electroporation และ transformants ได้รับการคัดเลือกในอาหารเลี้ยงเชื้อแช่หัวใจสมองที่มี erythromycin ต่อมาพลาสมิดที่สอง (pPFT11BS-CRP) ถูกย้ายเข้า transformant โดย electroporation นี้และได้รับเลือกให้บนจานที่มี chloramphenicol การวิเคราะห์ transformant คู่นี้โดยใช้กล้องจุลทรรศน์และ SDS-PAGE พบว่าผลิตในปริมาณมากของทั้งสาม endotoxins (มะเดื่อ• 5 • 6) bioassays transformant ของคู่นี้กับวัยที่สี่ของซี quinquefasciatus แสดงให้เห็นว่ามันมี LC50 1.7 นาโนกรัม•• ml-1 ทำให้มันประมาณสี่เท่าเป็นพิษ Bti (LC50 = 7.9 นาโนกรัม•• ml-1) และประมาณหกเป็น พิษ Bs 2362 (LC50 = 12.6 ••นาโนกรัมต่อมิลลิลิตร-1) ในขณะที่การทำงานของ recombinant นี้เป็นที่ดีมากกับสายพันธุ์นี้กว่า Bti หรือ Bs กับเอลายความเป็นพิษต่ำกว่า Bti (ตาราง• 1) ในฐานะที่เป็นตัวอย่างที่สองที่เราเปลี่ยนพลาสมิด p45S1 อธิบายไว้ข้างต้นซึ่งเป็นผู้ผลิตจำนวนมากของสารพิษถังชัด ๆ ลงไปในสายพันธุ์ acrystalliferous ของ Bti (4Q7) เช่นเดียวกับเข้าIPS-82 สายพันธุ์ของ Bti ที่ผลิตส่วนประกอบปกติของ Bti สารพิษ ทั้งสองสายพันธุ์เหล่านี้ผลิตในปริมาณมากของสารพิษถัง Bs เช่นการประเมินโดยการวิเคราะห์ระบบ SDS-PAGE (รูป. • 7) ทั้งสอง transformants เหล่านี้เป็นพิษดีขึ้นอย่างเห็นได้ชัดเมื่อเปรียบเทียบกับสายพันธุ์ป่าชนิดของ Bti หรือ Bs 2362 แต่ละคนเป็นอย่างน้อย 10 เท่าเป็นพิษมากขึ้นกับรูป. • 7 สายพันธุ์ของ recombinant Bacillus thuringiensis subsp israelensis (Bti) ที่ผลิต sphaericus บาซิลลัส (Bs) 2,362 พิษไบนารี (A) สายพันธุ์ Acrystalliferous เปลี่ยนที่มีพลาสมิดที่ก่อให้เกิดสารพิษ Bs 2362 ไบนารีใช้ก่อการ cyt1A และแทง / SD mRNA เสถียรภาพลำดับ (B) IPS-82 เปลี่ยนที่มีพลาสมิดเดียวกัน คริสตัลขนาดใหญ่ของสารพิษไบนารี Bs และคริสตัล Bti ทั่วไปที่เห็นได้ชัดในเซลล์ sporulated (C) การวิเคราะห์ระบบ SDS-PAGE ของ IPS-82 (ถนน Bti) และ IPS-82 ผลิตโปรตีน Bti และสารพิษไบนารี Bs (เลน Bti / BSB). สี่วัยซี quinquefasciatus ประเมินโดยเปรียบเทียบของ LC50s ต่อหน่วยของพวกเขา สื่อการหมัก (ตาราง• 2) แต่ไม่มีการปรับปรุงอย่างมากในความเป็นพิษกับวัยที่สี่ของยุงลายเอ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

รูปที่ - 5 ขั้นตอนการเปรียบเทียบลักษณะของ Bacillus thuringiensis subsp . กับความเครียด 4q7 / p45s1-11b ซึ่งสร้างผลึกของ cry11b cyt1a และ Bacillus sphaericus ไบนารี , สารพิษ

- รูปที่ 6 การวิเคราะห์ปริมาณโปรตีนนโดท็อกซินในสายพันธุ์ Bacillus thuringiensis . มวล m , เครื่องหมายโมเลกุล ช่องที่ 1 , B . thuringiensis subsp . 4q7 BS กับการผลิตสารพิษไบนารีและ cyt1a ( 4q7 / p45s1 )ช่องทางที่ 2 , B . thuringiensis subsp . 4q7 กับการผลิต cry11b ( 4q7 / ppft11bs ค้นหา ) ; ซอย 3 , B . thuringiensis subsp . 4q7 กับการผลิต cry11b cyt1a BS , ไบนารีและสารพิษ ( 4q7 / p45s1-11b )

สำหรับการแสดงออกในเครื่องหมายอะ ( รูปที่ - 4 ) ซึ่งสายพันธุ์แรก ( p45s1 ) ที่มีอยู่เป็นองค์ประกอบหลักของ BS บินสารพิษเปอรอน ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ cyt1a แทง / SD และลำดับพร้อมกับ cyt1a 20 kDa ยีนและพี่เลี้ยง เช่น โปรตีน ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ cry1ac ( Wu และ
federici , 1993 , 1995 ; ปาร์ค et al . , 1998 ) สายพันธุ์นี้มี เป็นเลือกเครื่องหมาย , erythromycin ต้านทาน ส่วนที่สอง ( ppft11bs พลาสมิดที่มียีนขาด ) cry11b ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ cyt1a แทง / SD และลำดับการถ่ายโอนลงในพลาสมิดแรกอะคริสตัลลบความเครียด
( 4q7 ) โดย electroporation และพลาสมิดที่เกี่ยวกับสมอง หัวใจ แช่วุ้นที่มีซิน เมื่อนำสายพันธุ์ที่สอง ( ppft11bs ซีรีแอกทีฟโปรตีน ) ถูกย้ายเข้า / โดย electroporation และเลือกจานที่มี chloramphenicol .การวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์ / คู่ และ SDS-PAGE พบว่ามันผลิตปริมาณมากของทั้งสามถือเซลล์
( มะเดื่อ - 5 - 6 ) ละเอียดของ / คู่กับสี่วัยของ โดยแสดงให้เห็นว่ามันมี LC ( , 50 ) 700 - ng - มล – 1 ทำให้จาตุรงค์ประมาณที่เป็นพิษอย่างต่ำ ( LC ( , 50 ) = 79 - นาโน - มล – 1 ) และ ค.ศ. 1940 หกประมาณที่เป็นพิษเป็น BS 2362 ( LC ( , 50 ) = 12.6 - นาโน - มล ( 1 ) ในขณะที่กิจกรรมของรีคอมบิแนนท์ที่ดีมากกับชนิดนี้มากกว่าอะ หรือ BS กับ ก. และความเป็นพิษต่ำกว่าอะ ( ตาราง - 1 ) เป็นตัวอย่างที่สอง เราเปลี่ยน p45s1 พลาสมิดที่อธิบายไว้ข้างต้น ซึ่งสร้างจำนวนมากของ BS บินพิษเป็นสายพันธุ์ acrystalliferous ของ Bti ( 4q7 ) รวมทั้ง
เป็น ips-82 , สายพันธุ์ของ Bti ที่ผลิตกว่าปกติของ Bti สารพิษ ทั้งสองสายพันธุ์เหล่านี้ผลิตจํานวนมากของ BS บินสารพิษตามที่ประเมินโดยการวิเคราะห์เอนไซม์ ( รูปที่ - 7 ) ทั้งของ transformants เหล่านี้ดีขึ้นอย่างเห็นได้ชัด เมื่อเปรียบเทียบกับสายพันธุ์ของความเป็นพิษของอะ
2362 หรือ BS ,